CN105483126A - 桃est-ssr分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供桃EST-SSR分子标记，其序列如SEQ？ID？NO:1至SEQ？ID？NO:12所示。本发明以18个亲缘关系较近的桃品种基因组DNA模板为研究对象，根据NCBI中公开的桃EST序列，采用MISA引物设计软件，查找并设计新的EST-SSR引物。经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、克隆验证、STR基因分型筛选出6个具有多态性的EST-SSR分子标记，本发明提供的桃EST-SSR分子标记能有效地对11个桃品种进行区分，可用于桃的品种鉴定、亲本鉴别、遗传多样性分析以及分子辅助选育等领域。

Description

桃EST-SSR分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子标记领域，具体涉及桃品种6个EST-SSR分子标记技术及其应用。
背景技术
桃[Prunuspersica(L.)Batsch]是世界重要水果之一，起源于中国，世界各地均有种植，是我国主要水果之一，中国桃产量居世界第一。
桃分布广，品种多，但亲缘关系近的桃品种之间的鉴定却比较困难，特别是同一个亲本组合的不同后代品种之间很难鉴别。
近年来，应用简单重复序列(Simplesequencerepeat，SSR)对品种进行鉴别在多种植物上有着广泛应用，该标记具有重复性好、数量多、成本低、检测便利等特点。有一部分SSR存在于表达序列标签(Expresssequencetag，EST)中，与基因组SSR相比，EST-SSR具有开发耗时短，花费低，效率高等优点。
目前，EST-SSR标记已相继应用于葡萄，梨，草莓，苹果，甘蔗等物种，虽然近年来关于桃EST-SSR标记也有报道，如桃EST-SSR标记开发及其在蔷薇科其他果树中通用性的研究(谭彬等，2013)；隋毅等(2006)用8个EST-SSR标记对扁桃和其它李属物种SSR的进化模式和突变机制进行研究；但对于近缘品种或同一杂交组合不同后代材料的鉴别而言EST-SSR数量仍嫌不足。因此，开发更多的EST-SSR标记以应用于桃品种或育种材料鉴别以及种质资源遗传多样性研究具有必要性。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供桃EST-SSR分子标记，涉及6个新的桃EST-SSR标记。所述桃EST-SSR标记分别是六组引物对，其序列如SEQIDNO:1至SEQIDNO:12所示。
本发明提供的6个桃分子标记，其特征如表1所示。
表1桃EST-SSR标记特征(SEQIDNO:1-12)
本发明的6个桃EST-SSR标记通过以下方法获得：
(1)利用GenBank公布的桃EST序列和MISA软件找到2146个重复基元，选取其中三至六碱基重复且重复次数大于5的和复合碱基重复共37个SSR序列设计了引物，引物设计的原则为：PCR产物长度100-350bp；GC含量40％-70％，最适为50％；退火温度50-65℃；引物长度18-25bp；避免出现引物二聚体。在设计好的正向引物的5’端统一加18个bp的尾巴(M13-TGTAAAACGACGGCCAGT)，另合成加了FAM和HEX两种不同荧光基团标识的M13尾巴引物，引物委托上海生工生物工程有限公司合成；
(2)用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyltrimethylammoniumbromide)法提取桃品种基因组DNA；
(3)采用SSR分子标记方法进行桃分子标记的筛选：以‘白丽’品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增：在20μl反应体系中分别加入10×ExTaqBuffer(含Mg2+)，1.6μl的2.5mMdNTP，5units/μlExTaqDNApolymerase0.1μl，正向引物4pmol，反向引物5pmol，M13通用荧光引物1pmol，10ng/μlDNA模板1μl，ddH2O补充体系至20μl。使用EppendorfMastercycler进行DNA扩增，具体步骤为：94℃预变性5min,，然后94℃(30s)/60℃(30s)/72℃(30s)循环20次，之后94℃(30s)/55℃(30s)/72℃(30s)循环12次，最后72℃延伸15min。产物检测：在含有0.5％μg/μlEB的3％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并照相记录结果；
(4)将初步筛选的有扩增产物的引物在另外10个桃品种上进行扩增，于ABI遗传分析仪上进行分析，并使用PowerMarkerV3.25,Tree32和GenALE×6.501读取数据并分析结果。
本发明的另一个目的是还提供所述的桃EST-SSR标记在桃种质资源遗传多样性分析以及品种鉴别中的应用。
为开发更多的EST-SSR标记，本发明利用已发布的GenBank的EST序列和MISA软件开发新的标记，找到了500多个SSR位点，合成了37对引物，经11个近缘关系的桃品种筛选，得到14个未被报道的具有多态性的标记，本发明使用其中多态性最高的6个标记。本发明的有益效果是：(1)本发明的6个分子标记在11个桃品种中有多态性，在11个桃品种中进行遗传多样性分析与桃植物分类常识相吻合(图1)，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的6个引物对应用于更多桃材料上，进行种质资源和遗传多样性分析。(2)本发明的6个分子标记均来自桃EST序列，可应用于桃的品种鉴定、亲本鉴别、遗传多样性分析以及分子辅助选育等工作。
附图说明
图1为基于6个EST-SSR标记构建的11个桃品种遗传相似系数的UPGMA聚类图。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步的说明。
实施例1：改良CTAB法提取基因组DNA
(1)配制CTAB缓冲液(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyltrimethylammoniumbromide)的配方为：2％CTAB，0.1MTris，20mMEDTA，1.4MNaCl，pH值8.0.TE缓冲液(10mMTris,1mMEDTA,pH8.0)。
(2)采桃幼嫩叶片，桃品种信息如图1所示。
(3)将桃叶片放入液氮中充分研磨至粉末状，称取0.7g左右转入盛有4mlCTAB溶液与80μlβ-巯基乙醇(65℃预热)的10ml离心管中，65℃水浴1h；加入4ml氯仿/异戊醇(24:1,v/v)，混匀，12000rpm离心10min，取上清液并再次加入4ml氯仿/异戊醇(24:1,v/v)，混匀，12000rpm离心10min。吸取上清液，加入2ml5MNaCl，4ml异丙醇(-20℃预冷)，混匀，放入-20℃2h。12000rpm离心15min，弃上清，沉淀用75％乙醇漂洗2次，晾干。加入100μl含10μg/mlRNaseA的TE缓冲液溶解沉淀，37℃水浴1h以降解RNA。用分光光度计法检测DNA浓度，用电泳法检测质量，保存于-20℃。
实施例2：设计EST-SSR引物
本发明利用GenBank公布的桃EST序列开发EST-SSR引物。引物设计软件为NCBIPrimer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHomeAd)。引物设计的具体条件为：PCR产物长度100-350bp；GC含量40％-70％，最适为50％；退火温度50-65℃；引物长度18-25bp；避免出现引物二聚体。引物合成中在正向引物的5’端加上18bp的M13-tail(序列为TGTAAAACGACGGCCAGT)。共开发了37对EST-SSR引物，序列如表2所示。
表2桃EST-SSR标记特征
实施例3：有多态性引物筛选
用实施例1中抽提的桃叶片DNA为模板，用实施例2中设计的37对引物进行扩增。
1、PCR反应体系：10×ExTaqBuffer(含Mg2+)，1.6μl的2.5mMdNTP，5units/μlExTaqDNApolymerase0.1μl，正向引物4pmol，反向引物5pmol，M13通用荧光引物1pmol，10ng/μlDNA模板1μl，ddH2O补充体系至20μl。
2、利用EppendorfMastercycler(EppendorfScientific,Inc.)PCR仪扩增。反应程序为：94℃预变性5min,，然后94℃(30s)/60℃(30s)/72℃(30s)循环20次，之后94℃(30s)/55℃(30s)/72℃(30s)循环12次，最后72℃延伸15min。
3、电泳检测：取5μlPCR产物加入1μl6×loadingbuffer，在浓度为1％的琼脂糖凝胶上检测，并拍照记录。
4、STR片段长度分析：将上述电泳检测中条带长度在合理范围内的PCR产物进行STR片段长度分析，得到不同桃品种的SSR位点的具体长度，收集6个引物多态性信息。并用POWERMARKER软件和MEGA软件构建UPGMA聚类图。

Claims (7)

1.一种桃EST-SSR分子标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。
2.一种桃EST-SSR分子标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。
3.一种桃EST-SSR分子标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。
4.种桃EST-SSR分子标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。
5.一种桃EST-SSR分子标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示。
6.一种桃EST-SSR分子标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示。
7.权利要求1-6任一所述的桃EST-SSR标记在桃种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、亲本鉴别和分子辅助育种中的应用。
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