CN108300800A - 辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记、引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及与辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记、特异性引物及其应用。本发明提供的分子标记，操作简单易行，重复性好，检测结果稳定可靠，周年均可进行，且为共显性分子标记，实现了在苗期对辣椒材料是否含有细胞质雄性不育恢复基因的鉴定，通过利用ABI3130XL遗传分析仪及其配套软件进行高通量电泳分析和基因型鉴定，或者进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，可以批量完成大样本分离群体的育性鉴定及其中是否含有雄性不育恢复基因的检测，提高育种效率，加速育种进程，在辣椒三系杂交制种和恢复系分子标记辅助选择育种上具有重要意义。

Description

辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记、引物及应用

(一)技术领域

本发明属于生物技术领域中的分子标记辅助育种，涉及与辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记、特异性引物及其应用，以及利用所述引物检测辣椒雄性不育恢复基因的方法。

(二)背景技术

辣椒利用CMS(Cytoplasmic male sterility)三系配套制种可以省去人工去雄，提高种子纯度，同时有利于知识产权的保护。但是，如果父本的育性恢复力不强，则会严重影响F1的果形和产量(王立浩，2007)。因此，选育恢复性强、配合力高、农艺性状优良的恢复系(父本)成为辣椒CMS在杂种优势利用中急需解决的主要问题之一(沈火林和石正强，2002)。传统的辣椒CMS育性基因选择是根据测交组合的育性表现进行筛选。分子标记辅助选择可直接反映不同材料DNA的多态性差异，并且选择不受时间和环境的影响(华明艳等，2008)。通过育性紧密连锁的分子标记直接进行育性基因的选择，可以有效加快恢复系的筛选进程。目前，分子标记辅助育种技术已在多种作物的CMS恢复系选育中得到应用，在杂交后代(或花药再生植株)苗期鉴定有Rf基因的个体，短时间内即可在室内检测大量样品，显著提高育种的选择效率(王俊霞等,2000；刘保申等,2002；华明艳等,2008)。众多研究认为辣椒育性恢复是由主效恢复基因Rf控制，另外还受修饰基因和环境因素的影响(Zhang etal.,2000；Gulyas et al.,2006)。

Zhang等(2000)采用RAPD技术发现位于Rf基因两侧的标记OP131400(0.37cM)和OW19800(8.12cM)；Kim(2005)将分子标记OPP131400转化为更容易操作的OPP13-CAPS(HinfI)标记，此标记为显性标记且通用性较强。Lee等(2004)和Gulyas等(2006)利用与Rf基因连锁的RAPD标记OPT-02/570(5cM)开发出一个STS标记CRF-SCAR。Kim等(2006)成功地将AFLP标记AFRF8转化成一个与Rf基因紧密连锁的共显性CAPS标记AFRF8CAPS(1.8cM)。Lee等(2008a)发现在辣椒中存在部分可育(pr)现象，利用AFLP-BSA方法开发出1个与pr基因连锁的分子标记PR-CAPS(1.8cM)，可用于部分育性材料的去除。常彩涛等(2005)利用BSA分析法筛选得到PCR标记S4181515，并证明其能用于候选育性材料的初筛。Min等(2009)利用AFLP技术开发了3个与Rf基因连锁的标记AFRF1、AFRF3和AFRF4，并转化为可用于PCR的标记类型。杨娟等(2010)发现AF208834标记与Rf基因连锁，遗传距离为20.8cm。Jo等(2010)利用矮牵牛Rf基因筛选辣椒BAC文库开发出连锁标记BAC13T7SCAR(1.4cM)。吴国平等(2012)以甜椒为试材，利用SRAP分子标记技术筛选得到一个与甜椒恢复基因相关的分子标记，并成功地将此SRAP标记转化为简单、稳定的SCAR标记。

米志波等(2015)利用36份已知基因型(RfRf或rfrf)的辣椒自交系对11对已报道的辣椒恢复基因连锁标记进行适用性检验，发现显性标记CRF3S1S和CRF-SCAR的适用性最广，其准确率分别为91.67％、88.89％；在6对共显性标记中CaRf-FL-M2的适用性最广，其准确率为80.56％。育种实际应用中可以首先利用显性标记CRF3S1S或者CRF-SCAR对辣椒材料进行初次鉴定，对其中含有Rf基因的辣椒材料利用共显性标记CaRf-FL-M2再次进行鉴定。李怡斐等(2016)利用已报道的9个与辣椒恢复基因连锁的标记对加工型辣椒CMS不育系83-3A、恢复系812、F1(83-3A×812)、F1'(F1×83-3B)与保持系83-3B回交群体进行试验，发现CRF-SCAR、PR-CAPS和OPP13-CAPS标记与CMS育性恢复基因Rf紧密连锁，但标记CRF-SCAR不需要酶切，通过PCR产物电泳就能鉴定加工型辣椒材料中是否含有恢复基因，且对回交群体辣椒育性鉴定准确度可以达到100％。

随着辣椒基因组参考序列数据库的公布，为开发辣椒恢复基因分子标记和图位克隆辣椒恢复基因提供了便利。本发明在现有研究基础上，进一步筛选和开发了与该白粉病基因紧密连锁的分子标记，并在不同遗传背景的分离群体中验证了标记的有效性。这为利用分子标记辅助选择转育辣椒恢复基因，为辣椒三系杂交制种奠定了基础。

(三)发明内容

本发明目的是提供与辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记筛选方法、分子标记特异性引物及其在辣椒细胞质雄性不育恢复材料的分子标记辅助选育中应用，以及利用所述引物检测辣椒雄性不育恢复基因的方法。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记，命名为SCD06-175和SCD06-179，SCD06-175序列如SEQ ID NO：1所示，SCD06-179序列如SEQ ID NO：2所示。SCD06-175和SCD06-179为各自独立的两个分子标记，可单独用于辣椒雄性不育恢复基因的检测、也可组合用于检测。

所述分子标记由如下方法筛选获得：

1)SSR分子标记的引物设计：在VegMarks数据库(https://vegmarks.nivot.affrc.go.jp/)中找分布于辣椒6号染色体上的SSR标记，并进行筛选；在网站The Pepper Genome Database中利用SSRHunter软件查找辣椒6号染色体上具有重复序列的SSR位点，由Array designer4.3软件和Primer5软件设计引物，最后在上游引物或下游引物的5’端添加由19个碱基组成的M13接头序列(CACGACGTTGTAAAACGAC)，送去生物公司进行引物合成，同时合成荧光染料NED、VIC或FAM标记的M13接头序列引物；

2)辣椒基因组DNA的提取：取三系杂交种辣椒父本、母本和F2分离群体各单株样品苗期幼嫩叶片0.1g克左右，用2X CTAB法提取DNA后，充分干燥后，加水稀释至PCR所需的工作浓度，分别保存，备用；

3)基因组DNA的PCR扩增：为便于使用ABI3130XL遗传分析仪对样品进行快速、自动化检测，本发明专利采用了一种特殊的PCR扩增方法：在各PCR管中分别加入步骤2)提取的各辣椒样品基因组DNA2μL后，再依次加入10×Taq PCR buffer 1μL，步骤1)设计的不含M13序列接头的上游或下游引物(10μM)0.15μL，带有M13序列接头的下游或上游引物(10μM)0.05μL，NED、VIC或FAM荧光染料标记过的M13接头序列引物0.15μL，dNTP(10μM)0.15μL，加无菌纯水至10μL，94℃预变性3min后，PCR反应程序采用前5个循环为touchdown反应，94℃变性50s，退火温度从58℃开始，每循环降低1℃，72℃延伸50s，进行5个循环；后面为30个循环的正常PCR反应：94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，扩增循环30个，产物4℃保存；

4)PCR扩增产物的ABI3130XL遗传分析仪检测：利用96或384复制器把各样品的PCR扩增产物从PCR板蘸取0.15μL左右到对应每个孔含有8μL Hi-Di Formamide(甲酰胺)的96或384孔机器上样板中，94℃变性3-5m之后立即置于冰上冷却，然后按照ABI3130XL遗传分析仪的使用说明进行电泳分离，然后把机器读取的结果利用GeneScan软件进行基因分型分析，Genographer软件生成电泳模拟图进行条带判读。

5)共显性标记统计方法，与表型为雄性不育、无花粉的母本带型一致的植株记为a，与有花粉，表型为可育的父本植株带型一致的带型记为b，同时含有不育母本和可育父本带型、杂合的记为h；

6)筛选出与辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记，命名为SCD06-175和SCD06-179：其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1序列如下：

5’-GCCTTGTCCAATTCCTTATGAAGAAATTCACCGTGAAGCTCTCAGTTAATATTTATTTTCATTTGCTTTTTCGATTGTTAATGGATTCAATTTGAGTAGAGTTAAATGGATATATATATATATATATATATATATATATGATTTTTTTAATTATTATTATTATTATTAGTTTTTTTGATAATCGTGGATTATGTAGAAGATTTATGTAGATGAATACTGTAATTGAGAAACTCTCAGATAGTATTTATTATCCTCTGCATTTTTGCTTTTTAATTAATTGAATTTGAGTAGAGTTAAAATGAATATATATGATTTTTTTTTAATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTAGTTTTTGGATAATCG TGCTGTAGTTTGAT-3’。

SEQ ID NO.2序列如下：

5’-TTAGCCTTCAACGTTGGTTTAGCATAAGTCTATTATTCCAAAAGGGTTCTTAAACCATGCTCTCAGTAGTGTACAATTCAATACCATACAAGTACATTAATATCATCATGGATTTAAAGGATTCCCAATTCATATTCAAAACCATCCTTCAAGTTCAAAACACACCCACACACACGCGCACACACACACACACACACACACACACACACATATATATATATATATACTAGTTTCTCGACACGTGCAACACA-3’。

本发明还涉及检测所述分子标记的特异性引物，其序列如下：

SCD06-175特异性引物：

上游引物：5’-GCCTTGTCCAATTCCTTATGAAG-3’；

下游引物：5’-ATCAAACTACAGCACGATTATCC-3’；

SCD06-179特异性引物：

上游引物：5’-TTAGCCTTCAACGTTGGTTTAGCA-3’；

下游引物：5’-TGTGTTGCACGTGTCGAGAAACTA-3’。

本发明还涉及所述的分子标记及其特异性引物在辣椒育种中的应用。本发明分子标记结合ABI3130XL遗传分析系统及其配套软件可以批量完成大样本分离群体的育性鉴定。

本发明还涉及利用所述的特异性引物检测辣椒雄性不育恢复基因的方法，所述方法包括：

(1)用CTAB法提取各待检测辣椒样品基因组DNA，分别保存，备用；

(2)PCR扩增反应：以提取的基因组DNA为模板，以SCD06-175或SCD06-179特异性引物为扩增引物进行PCR扩增；

扩增反应的总体积为10μL，1μL DNA模板，2×Taq PCRMasterMix 5·μL，SCD06-175或SCD06-179的上、下游引物各0.15μL，无菌纯水4.5μL；PCR反应程序为：94℃3min预变性后，接着94℃变性50s，55℃复性50s，72℃延伸50s，30个扩增循环，最后72℃延伸5min，产物4℃保存。

(3)PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；

具体方法可如下：各样品分别取扩增产物2.5μL，并加入由10mM EDTA、0.25％溴酚兰、0.25％二甲基苯菁和98％甲酰胺配制而成的上样缓冲液2.5μL，混匀；将混合物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，2-10V/cm电压，电泳1h后溴酚兰到达凝胶的底端处停止电泳。电泳结束后，将两块玻璃板剥开，将凝胶片置于到1000ml固定液中(纯酒精100ml+900ml蒸馏水+5ml冰乙酸)并在摇床上轻轻晃动10min。固定结束之后，迅速将凝胶放入1000ml银染液(1000ml蒸馏水+2g硝酸银)中于摇床上染色染色10min。染色结束之后，将凝胶置于1000ml显影液中(3mL的甲醛+9g的NaOH+1000ml蒸馏水)，放于摇床上轻轻摇晃，直至条带清晰。倒掉显影液，用蒸馏水小心将凝胶水洗2-3次即可。在观片灯下读带，将读带结果输入电脑保存，并对胶片拍照保存。

(4)辣椒样品恢复基因的检测结果判定：按共显性标记统计方法，与母本一致的带型记为a，与父本一致的带型记为b，杂合的带型记为h，则带型为b或h的辣椒样品就可以确定为含有辣椒雄性不育恢复基因。

本发明的有益效果主要体现在：

1、开发辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁得的SSR分子标记，可加速辣椒雄性不育的选育进程，提高育种效果，对辣椒CMS三系的分类和选育提供理论依据；

2、采用自主开发的SSR引物和ABI3130XL遗传分析系统或聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合，可以批量快速对辣椒植株的检测，在苗期选出雄性不育株和具有恢复基因的植株。该方法是对遗传物质的检测，方便、重复性好，且周年均可进行。

(四)附图说明

图1为辣椒F2分离群体的部分植株的基因型检测图。A：SCD06-175；B：SCD06-179。1，2，3，5，10，12为可育植株中含恢复基因的纯合株；6，7，9，11为雄性不育植株；4，8，10为可育植株中含恢复基因的杂合株。

图2为利用分子标记SCD06-175和SCD06-179对自选辣椒恢复材料株的基因型检测图。A：SCD06-175；B：SCD06-179。本例所述辣椒材料：1，为辣椒不育系对照材料134-A；2为恢复系对照材料134-C；其余为自选辣椒恢复材料。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：辣椒雄性不育恢复基因F2分离群体的部分植株的基因型检测

1)辣椒基因组DNA的提取：取三系杂交种辣椒父本、母本、F1杂交株、F2分离群体各单株样品苗期幼嫩叶片0.1g克左右，用2X CTAB法提取DNA后，充分干燥后，加水稀释至PCR所需的工作浓度，分别保存，备用；

2)基因组DNA的PCR扩增：为便于使用ABI3130XL遗传分析仪对样品进行快速、自动化检测，本发明专利采用了一种特殊的PCR扩增方法：在各PCR管中分别加入步骤1)提取的各辣椒样品基因组DNA 2μL后，再依次加入10×Taq PCR buffer 1μL，设计的不含M13接头的SCD06-175或SCD06-179上游或下游特异序列引物(10μM)0.15μL，带有M13接头的SCD06-175或SCD06-179下游或上游特异序列引物(10μM)0.05μL，NED、VIC或FAM荧光染料标记过的M13接头序列引物0.15μL，dNTP(10μM)0.15μL，加无菌纯水至10μL，94℃预变性3min后，PCR反应程序采用前5个循环为touchdown反应，94℃变性50s，退火温度从58℃开始，每循环降低1℃，72℃延伸50s，进行5个循环；后面为30个循环的正常PCR反应：94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，扩增循环30个，产物4℃保存；

SCD06-175特异性引物：

上游引物：5’-GCCTTGTCCAATTCCTTATGAAG-3’；

下游引物：5’-ATCAAACTACAGCACGATTATCC-3’；

SCD06-179特异性引物：

上游引物：5’-TTAGCCTTCAACGTTGGTTTAGCA-3’；

下游引物：5’-TGTGTTGCACGTGTCGAGAAACTA-3’；

M13接头序列：5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’。

3)PCR扩增产物的ABI3130XL遗传分析仪检测：利用96或384复制器把各样品的PCR扩增产物从PCR板蘸取0.15μL左右到对应每个孔含有8μL Hi-Di Formamide(甲酰胺)的96或384孔机器上样板中，94℃变性3-5m之后立即置于冰上冷却，然后按照ABI3130XL遗传分析仪的使用说明进行电泳分离，然后把机器读取的结果利用GeneScan软件进行基因分型分析，Genographer软件生成电泳模拟图进行条带判读；

4)共显性标记统计方法，与表型为雄性不育、无花粉的母本植株带型一致的记为a，与有花粉，表型为可育的父本植株带型一致的带型记为b，同时含有不育母本和可育父本带型、杂合的记为h(图1)；

实施例2：利用分子标记SCD06-175或SCD06-179对自选辣椒恢复材料株的基因型检测

1)辣椒基因组DNA的提取：取待检测辣椒样品苗期幼嫩叶片各0.1克，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；

2)基因组DNA的PCR扩增：在各PCR管中分别加入步骤(1)提取的各辣椒样品基因组DNA1μL后，再依次加入2×Taq PCR MasterMix 5·μL，SCD06-175或SCD06-179上下游引物各0.15μL，加无菌纯水至10μL；扩增条件、程序同实施例1；

3)PCR扩增产物的ABI3130XL遗传分析仪检测：利用96或384复制器把各样品的PCR扩增产物从PCR板蘸取0.15μL左右到对应每个孔含有8μL Hi-Di Formamide(甲酰胺)的96或384孔机器上样板中，94℃变性3-5m之后立即置于冰上冷却，然后按照ABI3130XL遗传分析仪的使用说明进行电泳分离，然后把机器读取的结果利用GeneScan软件进行基因分型分析，Genographer软件生成电泳模拟图，具体分析同实施例1；

4)自选辣椒样品恢复基因的检测：标记统计方法同实施例1(见图2)。

5)带型为a的辣椒样品为不含有辣椒雄性不育恢复基因；带型为b或h的辣椒样品就可以确定为含有辣椒雄性不育恢复基因。

需要说明的是，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 河南省农业科学院园艺研究所

<120> 辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记、引物及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 388

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gccttgtcca attccttatg aagaaattca ccgtgaagct ctcagttaat atttattttc 60

atttgctttt tcgattgtta atggattcaa tttgagtaga gttaaatgga tatatatata 120

tatatatata tatatatatg atttttttaa ttattattat tattattagt ttttttgata 180

atcgtggatt atgtagaaga tttatgtaga tgaatactgt aattgagaaa ctctcagata 240

gtatttatta tcctctgcat ttttgctttt taattaattg aatttgagta gagttaaaat 300

gaatatatat gatttttttt taattattat tattattatt attattatta ttattattag 360

tttttggata atcgtgctgt agtttgat 388

<210> 2

<211> 251

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

ttagccttca acgttggttt agcataagtc tattattcca aaagggttct taaaccatgc 60

tctcagtagt gtacaattca ataccataca agtacattaa tatcatcatg gatttaaagg 120

attcccaatt catattcaaa accatccttc aagttcaaaa cacacccaca cacacgcgca 180

cacacacaca cacacacaca cacacacaca tatatatata tatatactag tttctcgaca 240

cgtgcaacac a 251

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

gccttgtcca attccttatg aag 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

atcaaactac agcacgatta tcc 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

ttagccttca acgttggttt agca 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

tgtgttgcac gtgtcgagaa acta 24

Claims (6)

1.辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记，命名为SCD06-175、SCD06-179，SCD06-175序列如SEQ ID NO：1 所示，SCD06-179序列如SEQ ID NO：2所示。

2.检测辣椒雄性不育恢复基因分子标记SCD06-175的引物，其序列如下：

上游引物：5’- GCCTTGTCCAATTCCTTATGAAG-3’；

下游引物：5’-ATCAAACTACAGCACGATTATCC-3’。

3.检测辣椒雄性不育恢复基因分子标记SCD06-179的引物，其序列如下：

上游引物：5’-TTAGCCTTCAACGTTGGTTTAGCA-3’；

下游引物：5’-TGTGTTGCACGTGTCGAGAAACTA-3’ 。

4.权利要求1所述的分子标记在辣椒细胞质雄性不育恢复材料的分子标记辅助选育中的应用。

5.权利要求2或3所述的引物在辣椒细胞质雄性不育恢复材料的分子标记辅助选育中的应用。

6.利用所述的特异性引物检测辣椒雄性不育恢复基因的方法，所述方法包括：

（1）用CTAB 法提取各待检测辣椒样品基因组DNA ，分别保存，备用；

（2）PCR 扩增反应：以提取的基因组DNA为模板，以SCD06-175或SCD06-179特异性引物为扩增引物进行PCR扩增；

（3）PCR 扩增产物利用ABI3130 XL遗传分析仪或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析；

（4）辣椒样品恢复基因的检测结果判定：按共显性标记统计方法，与母本一致的带型记为a，与父本一致的带型记为b，杂合的带型记为h，则带型为b或h的辣椒样品就可以确定为含有辣椒雄性不育恢复基因的植株。