CN107190089B

CN107190089B - 利用分子标记对3种草莓品种进行快速鉴别的方法

Info

Publication number: CN107190089B
Application number: CN201710590228.4A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 朱炳耀; 郭文杰; 郑益平; 杨志敏; 庄志鸿
Original assignee: Institute of Biotechnology of Fujian Academy of Agricultural Science
Current assignee: Institute of Biotechnology of Fujian Academy of Agricultural Science
Priority date: 2017-07-19
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2037-07-19
Also published as: CN107190089A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体提供一种利用分子标记对3种草莓品种进行快速鉴别的方法。由于草莓在植株与果实形态上直接鉴别的难度较大，即采用分子标记中的SSR标记法对已在本地区范围内推广种植的草莓品种进行指纹图谱的比较，快速鉴别出品种。本发明主要包括提取草莓的总DNA，筛选SSR引物，通过对不同草莓样品的PCR扩增，仅用3对SSR引物鉴别出与对照品种形成显著条带差异的品种，扩增结果可有效地用于筛选不同于在本地区长期种植的传统品种的引进品种，以达到保护品种知识产权的目的。

Description

利用分子标记对3种草莓品种进行快速鉴别的方法

技术领域

本发明属于园艺育种领域与分子生物学领域，更具体涉及一种利用分子标记对3种草莓品种进行快速鉴别的方法。

技术背景

我国是世界草莓种植大国，产量和种植面积都位居世界第一，目前生产使用的品种多是欧美和日韩的品种，对产量高，抗性强，商品性好的品种需求旺盛。福建省的宁德地区是我国东南区域草莓的主产区，但当地的大规模主栽品种是早年从欧美引进的法兰地和甜查理，此外，也种植有从外省引进的如红颜、红宝等品种。本发明于2010年首次从美国和北京等地引进一系列品种，通过小区试验筛选出了3个中日性的草莓品种紫莓1号、紫莓3号和太空1号，适应在福建沿海半促成栽培和露地栽培，与我省主栽培品种法兰地比较，具有产量高，抗白粉病，黄萎病，红蜘蛛，硬度大，果型美观，货架期长等特点，值得进一步研究推广。本项目组自2012年起，3个品种陆续提供给宁德蕉城、霞浦、连江、闽侯、惠安、漳州、漳浦、连城等地种植示范推广。通过在宁德的蕉城虎贝乡、洋中镇际头村组建草莓苗育种及过渡驯化基地，使得新品种的繁育速度增加20倍以上，每年繁育300多万株一代种苗。2013年新品种推广种植面积达650亩以上。平均每亩产值在2万元左右，增加社会经济效益1000多万元。由于质量好深受种植户的喜爱，2年来专业合作社和农民育苗户直接收入达80万元以上。社会经济效益显著。

由于我们筛选出的三个品种具有果个大，产量高，抗性强，硬度大，架期长的特点。不仅适合在本省有推广应用前景，也可在全国进一步示范推广。而在推广的过程中，由于草莓品种的取材繁育简单易行，驯化成活率高，技术门槛和成本低，种植户易学快懂；有关品种知识产权的认定与归属的问题就逐渐地显现出来。而对品种进行快速有效的鉴定，是知识产权认定最基本的证据。因此，本项目组依据SSR分子标记技术检测重现性高，稳定性好的特点，在前人对草莓进行的SSR标记研究工作的基础上，从数十对SSR引物中筛查出3对本项目引进的3个草莓品种可以进行有效鉴别的引物，并建立快速的鉴定程序。为我们引进的三个草莓品种的鉴定和知识产权保护奠定了基础。同时，拟首先对引物序列及鉴定过程申请专利保护。

发明内容

本发明提供了一种利用分子标记对3种草莓品种进行快速鉴别的方法。通过大量SSR引物的扩增反应，筛选出3个SSR位点的引物对，能够在引进的新品种及若干个已在本区域推广种植的旧品种之间形成显著差异的电泳条带，扩增结果可有效地用于鉴别草莓品种。

所述SSR位点指3个微卫星序列位点两侧的3对引物序列，所述引物的序列如下：A，上游：ACGAGGCCTTGTCTTCTTTGTA，下游：GCTCCAGCTTTATTGTCTTGCT；

B，上游：GCCTTGATGTCTCGTTGAGTAG，下游：TACCTTCTGCATTCACCATGAC ；

C，上游：CTTCACCTAATCACTTGCCTGA，下游GGTCTGTTCCTTTCCTTGTTTG；

所述的草莓品种为紫莓1号、紫莓3号和太空1号。

SSR引物对草莓品种进行鉴别的方法，所述方法包括下列步骤：草莓样品中的总DNA的提取；PCR扩增；PCR产物电泳及染色，根据电泳结果判别草莓株系。

草莓总DNA提取方法，以在田间生长的草莓叶片为材料, 采用CTAB 法提取基因组DNA，利用离心柱过滤叶片提取物中褐黄色有机杂质，所获得的DNA可顺利进行鉴别反应。具体的操作步骤为：（1）取样：称取0.1克叶片，用去离子水冲洗干净，迅速转入1.5ml离心管中；（2）研磨：加入液氮，迅速用电钻捣碎；（3）抽提：加入600mlCTAB (中文名：十六烷基-三甲基-溴化铵；产自BBI公司，分析纯)； 65℃水浴1h，混匀；（4）除蛋白：加等体积的氯仿－异戊醇，氯仿（北京化工厂，分析纯）与异戊醇（北京化工厂，分析纯）的体积比为24：1，混匀；12000rpm离心6min，取上清液；（5）沉淀核酸：向上清液中加入2倍体积的无水乙醇（北京化工厂，分析纯）或2/3体积的异丙醇（北京化工厂，分析纯）沉淀DNA， 12000rpm离心6min，弃上清液；（6）高盐溶解：风干沉淀后加入含0.5M NaCl的TE缓冲液溶解DNA；（7）过柱：将溶解于高盐状态下DNA通过由硅基质膜构成的离心柱（可选用上海Bioteke DP3型、北京BiomedDL114型、上海Sangon Ezup型离心柱）；（8）漂洗：通过2-3次的漂洗-离心步骤，反复清洗柱中的基因组DNA（可选用离心柱型号配套的漂洗缓冲液进行漂洗）；（9）洗脱：用低盐的洗脱缓冲液将纯净的基因组DNA从硅基质膜上洗脱（可选用TE、无菌去离子水或与离心柱型号配套的缓冲液进行洗脱），洗脱后备用。

所述PCR扩增，其 PCR反应体系为：25 μL的PCR 反应体系中包括提取的DNA 溶液1μL，10nmol L⁻¹引物（由上海生工合成）2 μL（上游引物1μL、下游引物1μL）, 2.5 mmol L⁻¹dNTP （产自康润生物GenStar）2 μL，10×PCRbuffer 2.5 μL，TaqDNA 聚合酶1 U（产自康润生物GenStar）。PCR反应程序为:94℃预变性3min；随后30 个循环，每个循环94℃变性30 s，65℃退火30 s， 72℃延伸30s；最后72℃延伸30 min。

所述PCR产物电泳及染色，采用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色。PCR产物经电泳及染色，形成不同草莓品种的SSR指纹图谱，根据3对引物的指纹图谱，进行3种引进新品种的鉴别。

本发明的显著优点：

1）对草莓基因组DNA的提取程序进行了改进，增加用硅基质膜进行过滤漂洗的步骤，这样就可以在草莓的任何生长时期以及任何生长环境以叶片为取材材料时，均能洗除叶片中不同代谢物的干扰，获得纯净的基因组DNA。特别可以方便地以在田间自然生长的草莓叶片为取样材料，提取总DNA进行鉴定而不影响反应结果，从而避免草莓的生长状态与生长时期对品种鉴别的干扰与影响，及时地进行品种的鉴定；2）采用的分子标记技术为微卫星分子标记，也称SSR标记。这种标记广泛随机分布于真核生物基因组中，具有高度的多态性、高信息含量、高度的可重复性和共显性遗传方式。因此，SSR标记方法比其他标记方法具有简便、快捷、特异、稳定、所揭示的等位基因多样性高等特点；3）对随机分布于基因组中大量的SSR位点进行筛选，用SSR位点两翼序列设计的引物进行PCR扩增，可以对随机分布于基因组中的变异位点进行较为全面的扫描，尽可能多的筛选到有效的SSR引物，用于构建草莓新品种的指纹图谱，达到鉴别新品种的目的。

附图说明

图1为引物A扩增的11个样品的带型。

图2为引物A鉴别出的品种。

图3为引物B扩增的11个样品的带型。

图4为引物B鉴别出的品种。

图5为引物C扩增的11个样品的带型。

图6为引物C鉴别出的品种。

图7引物A,B,C的SSR-PCR反应数据形成的11个参试品种的聚类图。

具体实施方式

实施例1

1、草莓总DNA的提取：

（1）参试草莓品种：选取福建省农业科学院生物技术研究所在宁德基地保存的草莓引进品种以及在福建省各草莓种植区征集来的当家种植品种为实验材料。其中草莓紫莓1号和紫莓3号为本单位前几年从美国引进培育的品种，已通过品种中试，并有市售，公众可以通过商业化渠道购得；太空系列是近年来在基地筛选的太空辐射变异品种，原种系从北京农科院首次引进的太空辐射品种系列，现在本省小区域范围试种，未正式公开市售。

（2）以草莓叶片为材料, 采用CTAB法并结合离心柱过滤法提取基因组DNA，具体过程为：①取样：称取0.1克叶片，用去离子水冲洗干净，迅速转入1.5ml离心管中；②研磨：加入液氮，迅速用电钻捣碎；③抽提：加入600mlCTAB (中文名：十六烷基-三甲基-溴化铵；产自BBI公司，分析纯)； 65℃水浴1h，混匀；④除蛋白：加等体积的氯仿－异戊醇，氯仿（北京化工厂，分析纯）与异戊醇（北京化工厂，分析纯）的体积比为24：1，混匀； 12000rpm离心6min，取上清液；⑤沉淀核酸：向上清液中加入2倍体积的无水乙醇（北京化工厂，分析纯）或2/3体积的异丙醇（北京化工厂，分析纯）沉淀DNA， 12000rpm离心6min，弃上清液；⑥高盐溶解：风干沉淀后加入含0.5M NaCl的TE缓冲液溶解DNA；⑦过柱：将溶解于高盐状态下DNA通过由硅基质膜构成的离心柱（可选用上海Bioteke DP3型、北京Biomed DL114型、上海Sangon Ezup型离心柱）；⑧漂洗：通过2-3次的漂洗-离心步骤，反复清洗柱中的基因组DNA（可选用离心柱型号配套的漂洗缓冲液进行漂洗）；⑨洗脱：用低盐的洗脱缓冲液将纯净的基因组DNA从硅基质膜上洗脱（可选用TE、无菌去离子水或与离心柱型号配套的冲液进行洗脱），洗脱后备用。

2、SSR引物的合成及筛选及PCR 扩增含有微卫星序列的DNA片段，其中引物序列来源有：（1）直接按照前人文献报道使用的SSR引物对序列进行引物的合成；（2）对DNA基因组数据库中前人文献报道的SSR序列进行分析，选取微卫星重复序列的两端的碱基序列设计特异引物对；引物由上海生工公司合成，并对草莓全基因组DNA进行反应。PCR反应体系为：25μL的PCR 反应体系中包括提取的DNA 溶液1 μL, 10nmol L⁻¹引物2 μL, 2.5 mmol L⁻¹dNTP 2 μL, 10×PCRbuffer 2.5 μL, TaqDNA 聚合酶1 U，PCR反应体系的成分均产自康润生物（Genstar）公司。PCR反应程序为:94℃预变性3-7min; 随后30 个循环, 每个循环94℃变性30 s, 55-68℃退火30 s, 72℃延伸30s;最后72℃延伸10-30 min。

3、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色，具体操作程序为：①配制聚丙烯酰胺凝胶，吸取PCR产物7μL和1μL的上样缓冲液，充分混匀上样。上样完毕后140 V电压电泳。当溴酚蓝指示剂距下边1 cm～2 cm时，结束电泳。②电泳结束后，关闭电泳仪，拿出玻璃板并用药匙柄小心撬开，移走上层玻璃板，将附有凝胶的玻璃板以凝胶面朝下浸入已准备好的放有双蒸水的干净的瓷盘中，凝胶即落下，或轻轻用药匙柄把胶剥开一角，即可落入盘内; ③凝胶的固定：倒掉瓷盘中的水，加入固定液(100 mL/L 乙醇) (购自北京化工厂，分析纯)，在摇床上缓缓摇动15 min;倒掉瓷盘中的固定液，用双蒸水洗2次;④凝胶的染色：倒掉瓷盘中的水，加入染色液(20 g/L AgNO₃)(购自北京化工厂，工业基准含量99%以上)，在摇床上缓缓摇动染色20 min;⑤洗胶：倒掉瓷盘中的染色液，用双蒸水洗2次，共计1 min; ⑥凝胶的显影：加少量显色液(30 g/L Na₂CO₃) (购自北京化工厂，优级纯)冲洗15 s，再加一定体积显色液，轻摇瓷盘直到看到清晰的条带，一般为5 min～6 min，时间不要过长，否则背景会过深; ⑦终止显影：倒掉瓷盘中的显影液，迅速倒入定影液(100 mL/L HAC) (购自北京化工厂，优级纯),缓缓摇动2 min～3 min;⑧识读序列：倒掉瓷盘中的定影液,用双蒸水洗2次，每次2 min，将凝胶放在空气中干燥,识读序列。也可用数码相机或凝胶成像仪摄像。

4、 SSR指纹图谱结果分析及判定：由于SSR引物具有很高的特异性，这些引物一般的反应结果可以分为：不反应、无区别以及有区别。根据PCR的电泳结果只选取带型清晰，且有有区别的引物形成的不同指纹带型作为变异鉴别的依据。结果有多态性的10对引物可在参试品种中可扩增出带型清晰。证明这些引物对之间的SSR位点在姬松茸未诱变原始株系与诱变的株系的基因组中存在着明显的多态性，PCR的电泳结果可用于构建品种间的指纹图谱。通过筛选其中3对引物对应的SSR位点在所要鉴定的3种新品种中形成的明显差异指纹带型见图1-图6。

、数据分析：依据电泳结果记录清晰可重复的条带，清晰且可重复的条带记为“1”，模糊不清的弱带且不重复或无条带出现记为“0”，形成“1、0”数据矩阵；统计扩增带总数和特异条带数目，计算多态性比率；利用NTsys 2.10e软件对每对引物的扩增结果均构建草莓供试品种材料的聚类树状图。

实施例2三种引进草莓品种紫莓1号、紫莓3号和太空1号的SSR分子标记鉴别

一、样品来源：

1、检测样品：共3个

紫莓1号，紫莓3号，2010年由本项目组首次由美国拉森峡谷农业发展有限公司引进的San Andreas及Monterey品种系列，在福建省宁德地区试验基地田间种植的基础上，通过单株选育，小区中试后于2014年正式命名的2个新品种。现已在本省草莓种植区推广示范。

太空1号， 2012年由本项目组首次由北京农科院引进的太空辐射诱变的品种系列中的太空2008草莓品种，在福建省宁德地区试验基地田间种植，通过单株筛选，小区对比后于2016年正式命名的1个新品种。现已在宁德地区进行小规模种植示范。

2、对照样品：共7个

法兰地，甜查理，最早从美国引进，经过在我省近10年的栽培，现成为我省的传统主栽品种，其中法兰地的种植面积最大，甜查理次之。阿尔比、福莓、红宝、红颜、章姬，均为在我省具有一定种植规模的品种。

参与试验的11个草莓品种材料中，除福莓由本省的福州市蔬菜科学研究所选育的外，其余分别引种自美国和省外，现种植于福建省农科院生物技术研究所的宁德实验基地。详见附表1。

表１参与试验的11个草莓样品

二、检测日期：2016/11/1---------2017/4/31

三、报告内容：

1、使用仪器及试剂

主要仪器：超净工作台、离心机（eppendorf公司：5418）、PCR仪（Bio-Rad公司：C1000热循环仪）、电泳仪（JUNYI公司：JY-SCZ6或JY-SCZ7）、凝胶成像系统（Bio-Rad公司：Gel Doc XR⁺)。

主要试剂：CTAB抽提液、沉淀液、TE缓冲液、PCR Kit、3对SSR引物对A、B、C；聚丙烯酰胺凝胶、硝酸银银染试剂；

所述引物的序列如下：A 上游：ACGAGGCCTTGTCTTCTTTGTA，下游：GCTCCAGCTTTATTGTCTTGCT； B 上游：GCCTTGATGTCTCGTTGAGTAG，下游：TACCTTCTGCATTCACCATGAC ；C 上游：CTTCACCTAATCACTTGCCTGA，下游GGTCTGTTCCTTTCCTTGTTTG；

2、实验方法

（1）基因组DNA的提取

（2）SSR-PCR

3、实验结果

(1) 通过SSR引物对A的DNA指纹图谱可以看出：参试所有品种可以分为反应与不反应两大类群，反应的样品多源于欧美，不反应类群虽为外省引进，但主要源于日本。与7种在本省已经推广种植的品种相比，通过本项目引进的待鉴别的3个品种有着显著的特异性，由该引物PCR扩增结果的聚类分析可以明显形成一个聚类群。

（2）通过SSR引物对B的DNA指纹图谱可以看出：与7种在本省已经推广种植的品种相比，通过本项目引进的待鉴别的3个品种均扩增出各自独特的条带（条带1，条带4和条带11），由该引物PCR扩增结果的聚类分析可以与其它品种形成明显不同分支。

（3）通过SSR引物对C的DNA指纹图谱可以看出：参试所有品种可以分为反应与不反应两大类群，反应的样品多源于欧美，不反应类群虽为外省引进，但主要源于日本。与7种在本省已经推广种植的品种相比，通过本项目引进的待鉴别的3个品种有着显著的特异性，其中紫苺3号与太空1号均出现明显的特异条带，由该引物PCR扩增结果的3个新品种聚类分析可以明显形成不同聚类分支。

、结论

综合对A、B、C三对SSR引物的PCR反应结果的数据进行进一步的聚类分析，由品种的聚类图(图7)可以看出：参试11种草莓品种均可以得到有效区别；其中紫莓3号(Z3)的特异性最为显著，而紫莓1号(Z1)与太空1号(T)也明显地区别于其余品种。筛选出来的A、B、C三对SSR引物可以有效地鉴别由本项目率先引进并通过田间中试获得的3个新品种紫莓1号、紫莓3号与太空1号。为进一步申请品种与品种鉴定技术的知识产权保护提供了有力证据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院生物技术研究所

<120> 利用分子标记对3种草莓品种进行快速鉴别的方法

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgaggcctt gtcttctttg ta 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctccagctt tattgtcttg ct 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gccttgatgt ctcgttgagt ag 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taccttctgc attcaccatg ac 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cttcacctaa tcacttgcct ga 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtctgttcc tttccttgtt tg 22

Claims

1.用于鉴别3种草莓品种的分子标记SSR引物，其特征在于：所述SSR引物的序列如下：A，上游：ACGAGGCCTTGTCTTCTTTGTA，下游：GCTCCAGCTTTATTGTCTTGCT； B，上游：GCCTTGATGTCTCGTTGAGTAG，下游：TACCTTCTGCATTCACCATGAC；C，上游：CTTCACCTAATCACTTGCCTGA，下游GGTCTGTTCCTTTCCTTGTTTG；

所述3种草莓品种为紫莓1号、紫莓3号和太空1号。

2.一种利用权利要求1所述的分子标记SSR引物对草莓品种进行鉴别的方法，其特征在于：所述方法包括下列步骤：草莓样品中的总DNA的提取；PCR扩增；PCR产物电泳及染色，根据电泳结果判别草莓株系。

3.根据权利要求2所述的分子标记SSR引物对草莓品种进行鉴别的方法，其特征在于：草莓总DNA提取方法，以在田间生长的草莓叶片为材料, 采用CTAB 法提取基因组DNA，利用离心柱过滤叶片提取物中褐黄色有机杂质，所获得的DNA可顺利进行鉴别反应。

4.根据权利要求2所述的分子标记SSR引物对草莓品种进行鉴别的方法，其特征在于：所述PCR扩增，其 PCR反应体系为：25 μL的PCR 反应体系中包括提取的DNA 溶液1 μL, 10nmol/L上游引物1μL、10 nmol/L下游引物1μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL, 10×PCR buffer2.5 μL, TaqDNA 聚合酶1 U；PCR反应程序为：94℃预变性3 min；随后30 个循环，每个循环94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸30 min。

5.根据权利要求2所述的分子标记SSR引物对草莓新品种进行鉴别的方法，其特征在于：所述PCR产物电泳及染色，采用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色；PCR产物经电泳及染色，形成不同草莓品种的SSR指纹图谱，根据3对引物的指纹图谱，进行3种引进品种的鉴别。