CN111269974B

CN111269974B - 一段小叶杨雄株特异的基因组dna序列及其应用

Info

Publication number: CN111269974B
Application number: CN202010159715.7A
Authority: CN
Inventors: 席梦利; 张韬; 尚大鑫
Original assignee: Nanjing Forestry University; Yangzhou University
Current assignee: Nanjing Forestry University; Yangzhou University
Priority date: 2020-03-09
Filing date: 2020-03-09
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2040-03-09
Also published as: CN111269974A

Abstract

本发明公开了一段小叶杨雄株特异的基因组DNA序列及其应用，属于生物技术领域。通过对小叶杨雌株和雄株基因组进行DNA高通量测序和生物信息学分析，筛选出一段小叶杨雄株特异的基因组DNA序列。依据该小叶杨雄株特异的基因组DNA序列设计引物，以小叶杨和美洲黑杨的基因组DNA为模板，通过PCR扩增结果判断所检测杨树的性别，琼脂糖凝胶电泳检测出目标条带的为雄株，缺失该目标条带的为雌株。本发明提供的小叶杨雄株特异的基因组DNA序列及鉴定杨树植株性别的方法可以高效、准确地鉴定小叶杨和美洲黑杨的性别，在杨树性别鉴定及性别决定的分子机制研究中具有广阔的应用前景。

Description

一段小叶杨雄株特异的基因组DNA序列及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及一种小叶杨(Populus simonii)雄株特异的基因组DNA序列及其应用。

背景技术

杨树为杨属(Populus)树种的统称，依其形态学特征、地理分布及杂交亲和力而划归为五大派，即青杨派(Tacamahaca)、白杨派(Leuce)、黑杨派(Aigeiros)、胡杨派(Turanga)及大叶杨派(Leucoides)，在世界范围内广泛栽植。杨树是北半球绿化、防护林及人工用材林的重要树种，具有重要的生态价值和经济价值。杨树由于其自身的生物学特性及其重要地位而成为林木研究的模式树种。杨树为雌雄异株，其性别决定受遗传控制。杨树成年雌株在春季种子成熟时会飘散大量杨絮而造成严重环境污染，因此，用于行道树的杨树不应该选用雌株，而应栽植雄株，造林栽培时也需要不同性别比例合适搭配才能取得好的效果。然而，杨树在苗期从形态上很难准确辨别性别，待到成年开花后才可分辨雌雄株，且具有较长的幼年期，开花大约需要6年以上，因此，迫切需要开发杨树幼苗期早期鉴定性别的技术体系。

杨树有关性别鉴定的研究已有报道。杜宗岳和杨孟冬以山杨(Populusdavidiana)、小青杨(P.pseudo-simonii)和银山小杨(P.alba X(P.davidianaXP.simonii)的叶子和芽为材料，研究了杨树不同性别的同功酶酶谱。尽管这三种杨树的不同性别个体在多数酶谱中呈现差异，但同一树种的雌雄植株，在酶谱上呈现差异的程度因酶种而异，也因所分析的器官而异，并且这种差别，各树种表现不同，因此，该方法不能广泛应用于这三种杨树的苗期性别鉴定。伴随着各种分子标记技术的快速发展与应用，王洪梅等又开发了适用于鉴定山杨性别的SSR分子标记，以山杨幼嫩叶片中提取的基因组总DNA为模板，从200对SSR引物中筛选出的引物对F：CCTAGCCTTCATTCTCATTCAGC，R：GGTTGCTAGTCAGCTTCTTACC为引物进行PCR反应，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过观测山杨雌雄株的电泳条带特点可以准确鉴定山杨性别。然而，该分子标记不能在小叶杨(P.simonii)和美洲黑杨(P.detoides)中通用。

小叶杨自然分布区广，具有抗干旱和寒冷、耐土壤瘠薄、根系发达、萌芽力强、寿命长等优异特性，成为我国最早开展人工栽培和杂交育种的优良杨树树种，在我国北方林业生态环境建设和经济发展中发挥重要作用。美洲黑杨是北美洲的重要森林树种，具有速生、干直、抗病虫等优点，已在我国黄淮、江淮及长江中下游等平原地区大范围推广种植，成为我国重要的速生工业用材树种。然而，目前还缺乏小叶杨和美洲黑杨快速准确且方便应用的苗期性别鉴定技术。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一段小叶杨雄株特异的基因组DNA序列。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述小叶杨雄株特异的基因组DNA序列在杨树性别鉴定中的应用，可以准确、快速地鉴定杨树性别。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一段小叶杨雄株特异的基因组DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

所述的小叶杨雄株特异的基因组DNA序列在杨树性别鉴定中的应用。

进一步地，所述的小叶杨雄株特异的基因组DNA序列在杨树性别鉴定中的应用，具体步骤如下：

1)设计所述小叶杨雄株特异的基因组DNA序列的特异性引物；

2)提取杨树的基因组DNA作为模板，使用步骤1)所得引物进行PCR扩增；

3)对步骤2)扩增的结果进行检测，判断杨树性别：有扩增则为雄株，无扩增则为雌株。

一种权利要求1所述的小叶杨雄株特异的基因组DNA序列的特异性引物对，其序列如下：

F：5′-CACAACCTAAGCAATAGTTGGCA-3′，

R：5′-ATGTCTTTGAGCTTTGGTGCTG-3′。

所述的小叶杨雄株特异的基因组DNA序列的特异性引物对在鉴定杨树性别中的应用。

进一步地，在所述的应用中，所述的杨树为小叶杨或美洲黑杨。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明通过对小叶杨(P.simonii)雌株和雄株基因组DNA的高通量测序结果进行生物信息学分析，筛选出一段小叶杨雄株特异的DNA序列。根据所得小叶杨雄株特异的DNA序列设计引物，以小叶杨和美洲黑杨的基因组DNA为模板，通过PCR扩增该特异DNA序列，可以发现，琼脂糖凝胶电泳检测出目标条带的为雄株，缺失该目标条带的为雌株。因此，本发明所提供的小叶杨雄株特异的DNA序列可以用于高效、准确地鉴定出小叶杨和美洲黑杨的植株性别，在杨树性别鉴定及性别决定的分子机制研究中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为小叶杨和美洲黑杨的雌、雄株PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图；图中，泳道1为100bp的DNA ladder，泳道2为小叶杨雄株，泳道3为小叶杨雌株，泳道4为美洲黑杨雄株，泳道5为美洲黑杨雌株，泳道6为美洲黑杨雄株，泳道7为美洲黑杨雌株；可见小叶杨和美洲黑杨雄株均扩增出400bp左右的目标条带，即雄株特异的DNA序列，而雌株均缺失该条带。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1：

收集小叶杨和美洲黑杨雌雄株的幼嫩叶片，分别在液氮中研磨成粉末，依据植物总DNA提取试剂盒(TIANGEN DP320)中的说明书提取各样品的DNA，使用Nanodrop1000(美国)对提取的DNA质量及浓度进行测定。

分别构建小叶杨雌株和雄株的基因组DNA文库，通过高通量测序及生物信息学分析获得了一条长542bp小叶杨雄株特异的DNA序列，序列信息如SEQ ID NO 1所示。

使用Primer Premier5软件对小叶杨雄株特异的DNA序列设计引物，根据引物的分值我们选择了分值较高的3对引物委托南京擎科生物技术有限公司合成，分别以小叶杨雌、雄株的基因组总DNA为模板，通过PCR体系优化，凝胶电泳后观测目标条带，发现引物对F：5′-CACAACCTAAGCAATAGTTGGCA-3′和R：5′-ATGTCTTTGAGCTTTGGTGCTG-3′可以在小叶杨雄株的基因组总DNA中扩增出特异的400bp左右的目标条带，而小叶杨雌株的基因组总DNA中不能扩增出该条带，说明该引物对可以用于小叶杨性别鉴定。

实施例2：

选用1个基因型小叶杨雄株、1个基因型小叶杨雌株、2个基因型美洲黑杨雄株及2个基因型美洲黑杨雌株合计共6个基因型进行性别鉴定。通过PCR、凝胶电泳观测目标条带判断被检测植株性别。

PCR反应体系为25μL，其中包含12.5μL Premix Taq^TM(Takara RR902)，正向和反向引物各0.4μM，模板DNA 30ng，ddH₂O补至25μL。

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

将PCR反应扩增产物，采用1％琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统拍照检测。图1为6个基因型杨树的检测结果。泳道1为100bp的DNA ladder，泳道2为小叶杨雄株，泳道3为小叶杨雌株，泳道4为美洲黑杨雄株，泳道5为美洲黑杨雌株，泳道6为美洲黑杨雄株，泳道7为美洲黑杨雌株。可以清楚地看出，泳道2、4、6即小叶杨和美洲黑杨雄株的基因组总DNA均扩增出400bp左右的目标条带，泳道3、5、7即小叶杨和美洲黑杨雌株均缺失该条带。

由上可知，本发明获得的小叶杨雄性特异DNA序列，作为雄性特异性分子标记能够在小叶杨和美洲黑杨苗期准确鉴别雌、雄个体，通过上述方法可以一次性鉴定大量样本，鉴定时间不超过3个小时，适合大规模进行小叶杨和美洲黑杨性别鉴定，可以在小叶杨和美洲黑杨选育中进行推广应用。

序列表

<110> 南京林业大学

扬州大学

<120> 一段小叶杨雄株特异的基因组DNA序列及其应用

<130> 100

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 542

<212> DNA

<213> Populus simonii

<400> 1

cctgcaaata ttcacaatag tcacaaccta agcaatagtt ggcattcatt taagagcaga 60

ctcaatctgc ctttccaatc atccaatttt ttgagcagac tcaaatattg acaacatcat 120

aatcacaatt acgagcagac tcaatctacc cttccaatca tccaatttca cattcatttt 180

tcataattaa cttttagtat actacattat attaaaatca acaattatga atacaatata 240

aattacaatg ccatgtgaat aatttataaa caaagtaagt ttaatgccaa gttacaaaca 300

tctagacatt atgccattgt tacaatatga agccaatttc aagcaaaaat tgccaatgaa 360

acagttggaa ttatttccac caatctaaaa catattccca gcaccaaagc tcaaagacat 420

ataaatttat tcctatatat tcaattacta attacaaggt aaatttaaca ttaacaaata 480

catttcaata aagtattcaa ttattatgga gatacaaaca ataaaatata ttgaaaaaat 540

ta 542

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> F(Artificial)

<400> 2

cacaacctaa gcaatagttg gca 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> R(Artificial)

<400> 3

atgtctttga gctttggtgc tg 22

Claims

1.一段小叶杨雄株特异的基因组DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

2.权利要求1所述的小叶杨雄株特异的基因组DNA序列在杨树性别鉴定中的应用。

3.根据权利要求2所述的小叶杨雄株特异的基因组DNA序列在杨树性别鉴定中的应用，其特征在于，具体步骤如下：

1）设计所述小叶杨雄株特异的基因组DNA序列的特异性引物；

2）提取杨树的基因组DNA作为模板，使用步骤1）所得引物进行PCR扩增；

3）对步骤2）扩增的结果进行检测，判断杨树性别：有扩增则为雄株，无扩增则为雌株。

4.权利要求1所述的小叶杨雄株特异的基因组DNA序列的特异性引物对在鉴定杨树性别中的应用，其特征在于，所述的引物对序列如下：

F: 5'- CACAACCTAAGCAATAGTTGGCA-3'，

R: 5'-ATGTCTTTGAGCTTTGGTGCTG-3'。

5.根据权利要求2、3或4任一所述的应用，其特征在于，所述的杨树为小叶杨或美洲黑杨。