CN102220430B - 一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物。本发明提供了一种辅助筛选抗条锈病植物的PCR试剂，包括引物对，所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列2。所述PCR试剂由所述引物对和PCR扩增缓冲液组成。本发明的实验证明，本发明提供了一个新抗条锈病主效基因位点QYr.caas-2BL及该位点的辅助筛选抗条锈病小麦的SSR引物Xgwm501，该标记能准确鉴定抗条锈病基因QYr.caas-2BL。本发明的专用引物和分子标记将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

Description

一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物。

背景技术

由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的条锈病是一种分布广泛的气传病害，几乎在所有小麦主产国家都有发生，冷凉和高海拔地区尤为严重。我国是世界上最大的小麦条锈病流行区，小麦条锈病主要发生在我国的西北和西南地区。从20世纪50年代至今，我国曾发生15次中度流行和7次较大规模小麦条锈病流行，其中1950、1964、1990和2002年四次大流行发生面积最大，危害也最重，前两次发病面积达2亿亩以上，后两次发病1.1亿亩以上，分别损失小麦600、300、265和100万吨(万安民等，2002年我国小麦条锈病发生回顾植物保护2003，29：5-8)。最近五年来，我国条锈病每年发生面积均在5500万亩以上，最大年份9000万亩左右，严重威胁着我国小麦安全生产(全国农业技术推广中心张跃进等，2007年全国主要农作物重大病虫发生趋势预报.中国植保导刊，中国植保导刊，2007，2：32-35)。

由于小麦条锈病具有分布广泛、病原菌生理小种复杂多变等特点，导致品种抗性频繁丧失，防治和控制是一项长期任务。尽管化学药剂能有效防治，但选育抗病品种是防治小麦条锈病最经济、安全、有效的方法。利用分子标记辅助选择技术跟踪转育或聚合抗条锈基因是培育持久抗性小麦品种的重要手段。目前已经命名的小麦抗条锈病基因有48个，分布于43个位点(有3个复等位基因)，这些命名的基因大多是有生理专化性的抗病基因。由于生理专化抗病基因对条锈病害的高抗而深受育种家喜爱，但是当大面积种植抗病基因单一的品种会加速病原菌小种的定向化选择，并哺育优势小种种群的增长，导致抗锈品种在生产上大面积应用几年之后丧失其抗病性。由于“洛类”和“繁6”衍生系的大面积种植导致新致病小种CYR31和CYR32的出现而爆发了2002年的条锈病大流行。由于认识到单一抗病基因的潜在危害，育种学家和植病学家希望通过利用多基因聚合、基因布局和多系品种来延长抗病基因的持久抗性寿命。要实现多基因聚合、基因布局和多系品种，必须有丰富的有效抗源，目前已知的有效抗病基因仅有Yr5、Yr10、Yr15、Yr24和Yr26，因此寻找和发掘新的抗源异常重要。

SSR和DArT标记具有丰富遗传变异的特点，在小麦的基因作图和关联分析中广泛应用的分子标记。其中，SSR标记是根据基因组中微卫星两端的相对保守序列设计的特异引物，PCR扩增稳定，检测技术简单且成熟，较适合用于分子标记基因定位和辅助育种选择。近年来，利用分子标记连锁分析技术已经定位和标记了20多个小麦抗条锈病基因。

关联分析以连锁不平衡为基础，是鉴定自然群体内性状与遗传标记间的关系并结合遗传连锁图谱定位QTL的一种方法，已广泛用于水稻、玉米和小麦等作物的基因定位。Thornsberry等(2001)首次利用92个玉米自交系对dwarf8基因的等位变异进行关联分析，证明了dwarf8基因不仅控制株高而且影响开花期。Bresehello和Sorrells(2006)利用62个SSR标记对95个小麦品种进行关联分析，发现2D、5A和5B染色体携带控制籽粒形态性状的主效基因位点；而且这些位点与他们利用连锁作图群体定位的结果一致(Breseghello和Sorrells，2007)，肯定了关联分析在小麦基因定位中的有效性。Crossa等(2007)利用813个DArT标记和831个其它遗传标记对170份CIMMYT春小麦的产量性状和秆锈、叶锈、条锈及白粉病进行全基因组关联分析，发现大部分产量性状和抗病基因位点与已报道的结果一致，并定位了许多新抗性基因位点。

周8425B是周口市农业科学院于20世纪八十年代后期育成的高产抗病新种质，用其做亲本已育成衍生品种(系)80多个，包括百农AK58和周麦16等主栽品种，已成为目前黄淮麦区南片最重要的骨干亲本。利用连锁分析，Li等(2006)在7BL染色体上定位了一个来自周8425B的抗条锈病新基因YrZH84，与SSR标记Xcfa2040和Xbarc32及RGAP标记Xrga-1紧密连锁。Zhao等(2008)报道，周8425B携带一个抗叶锈病新基因LrZH84，位于染色体1BL的着丝点附近，与Xgwm582紧密连锁。可见，周8425B之所以成为当前主栽品种的骨干亲本，主要与其携带有新抗病基因有关。定位并发掘周8425B携带新抗条锈病基因的标记，对今后育种过程中跟踪选择携带抗性基因的品种具有重要实用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供如下所述的PCR试剂或所述试剂盒的应用。

本发明提供的如下所述的PCR试剂或所述试剂盒在植物抗病育种中的应用；

本发明的另一个目的是提供如下所述的PCR试剂或所述试剂盒的应用。

本发明提供的如下所述的PCR试剂或所述试剂盒在辅助筛选抗条锈病植物中的应用。

所述植物小麦；

所述条锈病的病原菌为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)，所述小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)具体为小麦条锈菌(Puccinia striigormis f.sp.tritici)小种条中32号。

本发明的第三个目的是提供一种辅助筛选抗条锈病植物的PCR试剂，

本发明提供的辅助筛选抗条锈病植物的PCR试剂，包括引物对，所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列2。

所述PCR试剂由所述引物对和PCR扩增缓冲液组成。

所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的终浓度均为4pmol；

所述PCR扩增缓冲液由DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、KCl、Tris和水组成，所述PCR扩增缓冲液的pH值为8.4；

所述MgCl₂在所述的PCR试剂中的终浓度为1.5mmol·L^-1；

所述KCl在所述的PCR试剂中的终浓度为20mmol·L^-1；

所述Tris在所述的PCR试剂中的终浓度为20mmol·L^-1；

所述dNTP在所述的PCR试剂中的终浓度为200μmol·L^-1；

所述dNTP在所述的PCR试剂中的终浓度为每种dNTP的终浓度。

所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中的终浓度为1.5U；

所述引物对进行PCR扩增时的退火温度为55℃，退火时间为1min；

所述植物为小麦；

所述条锈病的病原菌为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)，所述小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)具体为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)小种条中32号。

含有所述PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

本发明的第四个目的是提供一种辅助筛选抗条锈病植物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用所述的PCR试剂或所述试剂盒对待测植物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物大小为195bp，则所述待测植物为候选抗条锈病植物，若所述PCR扩增产物中大小不为195bp，则所述待测植物为候选不抗条锈病植物。

所述PCR扩增中，以待测植物的基因组DNA为模板；

所述PCR扩增的退火温度为55℃；

所述植物为小麦；小麦的品种具体为周麦11、周麦12、周麦13、周麦16、周麦17、周麦22、百农AK58、04中36、阜98-46、洛麦22、郑麦9023、豫麦34、豫麦70、中优16号、中优9507、中优9701、小偃54、原冬6号、北京10号或京411。

所述条锈病的病原菌为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)，所述小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)具体为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)小种条中32号。

所述PCR扩增产物的核苷酸序列为序列表序列3；

所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。

本发明的实验证明，本发明提供了一个新抗条锈病主效基因位点QYr.caas-2BL及该位点的辅助筛选抗条锈病小麦的SSR引物Xgwm501，该标记能准确鉴定抗条锈病基因QYr.caas-2BL。利用该分子标记可以对小麦抗条锈病基因QYr.caas-2BL进行分子标记辅助选择。本发明的专用引物和分子标记将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

附图说明

图1为用Xgwm501标记在周8425B衍生群体中PCR扩增的结果

图2为2个SSR标记和1个DArT标记与QYr.caas-2BL基因的连锁图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所有引物合成均北京奥科生物技术有限责任公司完成。以下实施例中所有用到的小麦材料均为普通小麦(Triticum aestivum L.)，来自中国农业科学院国家农作物种质保存中心。

实施例1、QYr.caas-2BL标记Xgwm501195的获得

一、QYr.caas-2BL基因和连锁标记的发现

周8425B对条中32表现为成株期高抗。用选用冬小麦骨干亲本周8425B及其80个衍生品种(系)，包括子一代8份，子二代35份，子三代37份。

1、田间设计和调查

于2009-10年度分别种植于河南安阳和周口，采用完全随机区组设计，3次重复，每小区6行，行距20cm，行长4m。每2个小区间种植1行高感小麦条锈病品种铭贤169作为诱发行。田间抗病鉴定用条锈菌优势生理小种CYR32为主的混合小种。

田间接种于小麦3-4叶期进行，用条锈菌优势生理小种CYR32为主的混合小种配制成含0.05％吐温20的孢子悬浮液，傍晚时将其均匀喷洒诱发行，并立即盖上薄膜保湿，次日早晨揭开薄膜。接种后保持田间湿度，确保条锈病发病成功。待条锈病发病最严重时进行田间病害调查，指标为最大严重度(maximum disease severities，MDS)，即发病最严重时叶片上条锈病孢子堆面积占总叶片面积的百分数。

2、引物获得和标记分析

SSR引物序列信息来自文献或GrainGenes2.0(http://wheat.pw.usda.gov/)网站中查获，所用引物均由北京奥科生物技术有限责任公司合成，包括GWM系列、WMC系列、BRAC系列、GDM系列、CFD系列和CFA系列。共计2300对引物用于分析周8425B及其衍生品种(系)基因组DNA。

DArT标记由澳大利亚Triticarte股份有限公司(Canberra，Australia；http://www.triticarte.com.au)进行分析，即将不同来源的13个小麦品种基因组DNA经Pst I-TaqI双酶切后形成的片段连接后产生基因组代表片段，并将此DArT基因组代表性文库的每个克隆点在芯片上；周8425B及其衍生品种(系)基因组DNA经同样双酶切形成的基因组代表性片段与芯片杂交，在全基因组3000个位点中筛选出921个位点产生限制性多态性片段信号。

SSR标记的PCR反应体系为20μL，含20mmol·L^-1Tris-HCl(pH 8.4)，20mmol·L^-1KCl，200μmol·L^-1dNTPs，1.5mmol·L^-1MgCl₂，每条引物4pmol，Taq DNA聚合酶1.5U，模板DNA 50ng。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸10min。扩增产物经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，正负极的电泳缓冲液分别为0.5×TBE和0.3×TBE，上样量5μL，80W恒定功率电泳50min左右。经硝酸银染色后进行带型统计，结果如图1所示，其中S为感病品种对应带型，R为抗病品种对应带型。

二、关联基因定位和连锁标记Xgwm501₁₉₅的发现

利用STRUCTURE软件分析群体结构，K取值范围1-20且每个K值重复估算5次，采用MCMC(Monte Carlo Markov Chain)模型，burn-in和run length均设置100000，估算Q参数。ΔK估算发现，当K＝3时曲线出现较大拐点，因此，推断该衍生群体又可分成3个亚组群。结合SPAGeDi软件估算群体亲缘矩阵(kinship matrix)，利用Tassel3.0软件(www.maizegenetics.net/tassel)的MLM模型(Mixed Linear Model)进行关联分析，选择P＜0.01为等位变异与性状关联阈值。定位出Xgwm501₁₉₅、Xgwm120₁₄₈和wPt-1068与位点QYr.caas-2BL关联，其中Xgwm501₁₉₅与该基因关联最显著(p＜0.0001)，解释表型变异为17.1％。

Xgwm501195的引物具体为WMS501F 5′GGCTATCTCTGGCGCTAAAA 3′(序列1)，WMS501R 5′TCCACAAACAAGTAGCGCC 3′(序列2)。

三、Xgwm501₁₉₅标记的鉴定

分别提取50个周8425B衍生品种的全基因组DNA。分别以各个基因组DNA为模板用Xgwm501₁₉₅位点的引物：WMS501F 5′GGCTATCTCTGGCGCTAAAA 3′，WMS501R 5′TCCACAAACAAGTAGCGCC 3′进行PCR扩增(PCR扩增体系与扩增程序同一中的2)。将PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺电泳，银染显色(同一中的2)。结果见表1，抗病植物扩增得到195bp的片段(核苷酸序列为序列3)，表明SSR标记Xgwm501的195片段能够有效鉴定小麦品种条锈病抗性。

表1Xgwm501标记等位变异在周8425B衍生群体中的分离

根据Wheat DArT maps Version 1.2(http://www.triticarte.com.au)和Somers等(2004)整合的小麦分子标记图谱，将标记Xgwm501、Xgwm120和wPt-1068整合到小麦遗传图谱上，结果如图2所示，确定QYr.caas-2BL在染色体2BL上的83.0cM位置。

实施例2、Xgwm501₁₉₅标记的应用

周麦11、周麦12、周麦13、周麦16、周麦17、周麦22、04中36、洛麦22、百农AK58、阜98-46等均是周8425B的后代品种。郑麦9023、豫麦34、豫麦70、中优16号、中优9507、中优9701、小偃54、原冬6号、北京10号和京411等品种不是周8425B的后代品种。

一、检测不同品种的小麦的条锈病抗性

小麦品种抗条锈病鉴定于2010年冬在中国农业科学院作物科学研究所温室进行。小麦条锈菌小种(条中32号)(Puccinaia striiformis f.sp.tritici，万安民，吴立人，金社林，姚革，王保通.中国小麦条锈病菌条中32号的命名及其特征.植物保护学报，2003，30(4)：347-352.，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)。

以小麦农家品种铭贤169(李树雪.山西铭贤学校农业科技改良的贡献研究.中北大学学报(社会科学版)，2009，25(4)：71-75.，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)为感病对照品种，将供试小麦材料经1％(V/V)H₂O₂浸种催芽24小时，待其萌芽后播种在花盆中，每盆种植10株待测小麦和3株铭贤169。当幼苗一叶一心时，用扫抹法接种繁殖好的小麦条锈菌新鲜菌种。在接种后15天左右，当感病对照铭贤169发病充分时，调查发病情况。各供试材料对条锈病的抗病性以侵染型表示，侵染型采用6级标准(见表2)，即0、0；、1、2、3、4，并以“+”和“-”表示强弱分级标准。0-2⁺型为抗病，3--4型为感病。检测结果见表3。

表2小麦条锈病苗期侵染型分级标准

二、检测不同品种小麦是否携带QYr.caas-2BL

分别提取各个品种小麦的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别采用Xgwm501位点的引物：WMS501F 5′GGCTATCTCTGGCGCTAAAA 3′，WMS501R 5′TCCACAAACAAGTAGCGCC 3′进行PCR扩增。

20μL PCR反应体系：终浓度为20mmol·L^-1的Tris-HCl(pH 8.4)，终浓度为20mmol·L^-1的KCl，终浓度为200μmol·L^-1的dNTPs(TaKaRa公司)，终浓度为1.5mmol·L^-1的MgCl₂(Promega公司)，每条引物终浓度为4pmol，Taq DNA聚合酶1.5U(Tiangen公司)，模板DNA 50ng。

PCR反应在PTC-200PCR扩增仪上进行，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸10min；10℃保存。

对PCR扩增产物进行6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，具体操作为：取15μl扩增产物，加入3μl变性载样指示剂(98％无离子甲酰胺，10mM EDTApH8.0，0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青)，94℃变性7min后，立即放入冰水混合物中冷却10min，每份变性的扩增样品5μl在浓度为64％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。结果见表3。

表3用Xgwm501分子标记对20个小麦品种的QYr.caas-2BL位点检测结果

注：a：+表示含有QYr.caas-2BL位点，-表示不含QYr.caas-2BL位点。

b：殷贵鸿，王建武，闻伟锷，何中虎，李在峰，王辉，夏先春.小麦抗条锈病基因YrZH84的RGAP标记及其应用.作物学报，2009，35(7)：1274-1281.记载有周麦11、周麦12、周麦13、周麦16、周麦17、周麦22、百农AK58、04中36、阜98-46、洛麦22、郑麦9023、豫麦34、豫麦70，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

周阳，何中虎，张改生，夏兰琴，陈新民，张立平，陈锋.用微卫星标记鉴定中国小麦品种中Rht8矮秆基因的分布.作物学报，2003，29(6)：810-814.记载有中优16号、中优9507、中优9701、小偃54、原冬6号、北京10号、京411，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

以上结果表明：周麦11、周麦12、周麦13、周麦16、周麦17、周麦22、百农AK58、04中36、阜98-46、洛麦22均扩增得到195bp的条带(核苷酸序列为序列3)。表明这些小麦中含有QYr.caas-2BL。认为这些小麦均抗条锈病。

其结果与抗条锈病抗病检测的结果一致，证明，Xgwm501₁₉₅标记可以快速、准确地鉴定小麦品种是否抗条锈病。

Claims (3)

1.一种辅助鉴别抗条锈病植物的方法，包括如下步骤：用如下的PCR试剂对待测植物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物大小为195bp，则所述待测植物为候选抗条锈病植物，若所述PCR扩增产物大小不为195bp，则所述待测植物为候选不抗条锈病植物；

所述PCR试剂由如下的引物对和PCR扩增缓冲液组成；

所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列2；

所述PCR扩增缓冲液由DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、KCl、Tris和水组成，所述PCR扩增缓冲液的pH值为8.4；

所述PCR扩增中，以待测植物的基因组DNA为模板；

所述PCR扩增的退火温度为55℃；

所述植物为小麦；所述小麦为小麦周8425B；

所述条锈病的病原菌为小麦条锈菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici），所述小麦条锈菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici）为小麦条锈菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici）小种条中32号。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述大小为195bp的PCR扩增产物的核苷酸序列为序列表序列3；

所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的终浓度均为4pmol；

所述MgCl₂在所述的PCR试剂中的终浓度为1.5mmol·L^-1；

所述KCl在所述的PCR试剂中的终浓度为20mmol·L^-1；

所述Tris在所述的PCR试剂中的终浓度为20mmol·L^-1；

所述dNTP在所述的PCR试剂中的终浓度为200μmol·L^-1；

所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中的终浓度为1.5U；

所述引物对进行PCR扩增时的退火时间为1min。

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