CN114262747A - 一种基于snp研究玉米南方锈病群体遗传和传播的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于SNP标记研究玉米南方锈病群体遗传和传播路径的方法。本申请的方法使用筛选出的限制性内切酶EcoRI和MspI酶切不同菌株DNA，以简化基因组测序技术，利用Stacks软件挖掘SNP标记，进而对多堆柄锈菌群体遗传结构和传播路径进行研究；本发明的限制性内切酶EcoRI和MspI对多堆柄锈菌全基因组切割效果较好，相较于其他组合，在测序深度相同的情况下，能获得更多的标签数。目前尚未对多堆柄锈菌全基因组测序，本发明以简化基因组测序并利用stacks软件获得不同菌株的SNP位点，并基于此研究多堆柄锈菌的群体遗传结构和传播路径的方法，对病害综合治理和精准防治有重要意义。

Description

一种基于SNP研究玉米南方锈病群体遗传和传播的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域和遗传分析领域，具体地，本申请提供了一种基于SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径的方法及其应用。

背景技术

玉米南方锈病是由多堆柄锈菌引起的，是一种世界性的病害。该病害已在多个国家大暴发，导致了严重的产量损失。目前，该病害在我国海南、广东、广西、湖南、浙江、福建、江西、云南、贵州、重庆、四川、安徽、江苏、河南、湖北、河北、天津、北京、山西、陕西和辽宁等省份均有发生。我国种植的主要玉米品种，如郑单958、浚单20和先玉335，均对该病害均表现为高感。该病于2015年在我国大暴发，造成756万吨的玉米产量损失。该病害在我国具有发生面积大、发病速度快和远距离传播等特点，加大了该病在我国的防控难度。

多堆柄锈菌的夏孢子能够通过气流进行远距离传播。我国玉米南方锈病由南向北依次发生，因此，我国南方地区玉米上的多堆柄锈菌极有可能是北方夏玉米区的菌源。通过群体遗传学方法推断多堆柄锈菌的菌源中心以及传播路径，对该病的防控具有重要意义。

世界上应用群体遗传学方法研究多堆柄锈菌的群体结构和推断传播路径的研究极少。主要是因为分子遗传标记的匮乏。研究病原菌群体遗传的最有效的标记是SSR标记(简单重复序列标记)和SNP标记(单核苷酸多态性)。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换等。

目前没有发现多堆柄锈菌SNP标记的报道。研究多堆柄锈菌群体遗传，前人使用的标记有SSR、RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)和ISSR(简单重复序列区间标记)。在日本，Hirayae等(1998)利用ITS1和ITS2区域的RFLP标记研究采自日本的14个多堆柄锈菌菌株，发现在日本至少有2个群体。在泰国，Unartngam等(2011)利用5对ISSR标记对采自泰国8个省份的38个菌株进行分析，发现该38个菌株被划分为了13个群体。郭云艳等(2013)使用18对ISSR引物对我国12个省份的72个菌株进行群体遗传分析，发现72个菌株被划分为2个群5个亚群和10个组，菌株群体间存在较高的遗传变异。Sun等(2021)利用9对SSR标记对我国广东省的多堆柄锈菌进行群体遗传学分析，发现该地区的菌为克隆群体，且阳江市的多堆柄锈菌具有较高的遗传多样性。

与其他标记相比，SNP标记为共显性标记，有利于基因分型，且具有在基因组中数量多，分布广泛和高度稳定等特点。针对SNP标记，开发了一系列分子生物学相关的软件，易于进行自动化分析，缩短了研究的时间。因此SNP标记被广泛应用在分子生物学研究。应用SNP标记技术研究多堆柄锈菌群体遗传结构和推测该病在我国的传播规律，将对我国玉米南方锈病在我国的综合治理就有重要意义。

发明内容

针对以上情况，发明人筛选出了一对能获得较多片段的限制性内切酶组合(EcoRI和MspI)，使用该酶对多堆柄锈菌全基因组酶切后，对酶切片段进行简化基因组测序(GBS)，使用Stacks软件对测序数据分析，挖掘SNP标记，利用SNP标记，对多堆柄锈菌进行群体遗传学研究。

一方面，本申请提供了一种基于SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径的方法，其特征在于，包括酶切多个多堆柄锈菌菌株的DNA；测序；发掘SNP标记；利用SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径。

进一步地，所述测序为简化基因组测序(GBS)。

进一步地，所述测序在NovaSeq 6000平台上进行。

进一步地，所述发掘SNP标记中使用Stacks软件对测序数据分析。

进一步地，所述酶切使用EcoRI和MspI内切酶组合。

进一步地，所述利用SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径包括遗传多样性分析、群体分化指数Fst分析和/或群体遗传结构与传播分析。

另一方面，本申请提供了上述方法在如下(A)-(H)任一项中的应用：

(A)在多堆柄锈菌群体遗传学中的应用；

(B)在多堆柄锈菌遗传结构分析中的应用；

(C)在多堆柄锈菌遗传多样性分析中的应用；

(D)在多堆柄锈菌群体分化分析中的应用；

(E)在玉米南方锈病菌源中心确定中的应用；

(F)在确定玉米南方锈病病原菌传播途径中的应用；

(G)在玉米南方锈病防治中的应用；

(H)在玉米南方锈病病原菌检测中的应用。

另一方面，本申请提供了EcoRI和MspI内切酶组合在发掘锈菌目SNP位点中的应用。

进一步地，所述锈菌为多堆柄锈菌。

本申请中所述的多堆柄锈菌为玉米南方锈病病原菌，其拉丁名为Pucciniapolysora，也被成为多堆柄锈菌。

本发明的有益效果：

本发明筛选出了一对限制性内切酶组合(EcoRI和MspI)，通过对多堆柄锈菌全基因组酶切后，对酶切片段进行简化基因组测序，使用Stacks软件对测序数据分析，挖掘SNP标记，利用SNP标记，对多堆柄锈菌进行群体遗传学研究。该方法能够有效从分子水平上确定该菌在我国的传播路径，推测菌源中心，对我国玉米南方锈病的综合治理，减少产量损失和农药使用量具有重要意义。

附图说明

图1显示不同K值对应的CV error值分布图(A)和广东、广西和海南省多堆柄锈菌的群体遗传结构(B)。

具体实施方式

实施例1限制性内切酶的筛选

对我国海南、广东和广西的多堆柄锈菌进行采样，将采集的多堆柄锈菌样品带回实验室。挑取单孢子堆进行单孢分离和培养获得单孢系(菌株)，具体方法参考本课题组申请的发明专利(一种玉米多堆柄锈菌的单孢扩繁方法，专利号：ZL201510765142.1)，通过扩繁，每个单孢系获得大量夏孢子。提取一个单孢系的DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。使用不用限制性内切酶组合对DNA进行酶切，酶切后的每个样品取5ul进行跑胶检测，要求DNA酶切完全，即酶切结束后没有主条带；250-1000bp之间有明显弥散的条带。对上述DNA片段进行PCR扩增，富集测序文库模板，并且连接上测序接头。然后采用磁珠纯化PCR产物；对纯化后的PCR产物在NovaSeq 6000平台上进行双末端测序，测序片段长度为150bp(脱氧核糖核苷酸)。统计不同测序深度的每个标记(序列片段)的数量(表1)。发现EcoRI和MspI在相同测序深度的情况下，获得更多的序列片段数。更多的序列片段可以充分代表玉米多堆柄锈菌的全基因组信息，从而获得全基因组范围内更多的有代表性的SNP遗传标记，充分揭示群体遗传关系。因此EcoRI和MspI是最好的酶切组合。

表1 GBS内切酶组合筛选结果。

注：X代表测序深度，Num代表对应测序深度时的标签数，dep代表对应测序深度的所有标签的平均深度。

实施例2SNP标记挖掘

利用EcoRI和MspI限制性内切酶组合对不同菌株的DNA进行酶切，通过简化基因组技术，对酶切后的序列片段在NovaSeq 6000平台上进行双末端测序，测序片段长度为150bp。利用stacks软件，对采自海南、广东和广西的106个菌株的简化基因组序列进行比对，检测变异位点，获得不同菌株的SNP数据。

实施例3群体遗传学分析和路径推断

遗传多样性分析

基于SNP数据，利用R软件的poppr数据包(Kamvar et al.,2014)，分析海南省、广东和广西总共106个多堆柄锈菌菌株的遗传多样性，包括群体中每个位点平均个体数(NumIndv)、所有位点平均观测杂合度(Obs Het)、所有位点平均观测纯合度(Obs Hom)和根据哈迪-温伯格平衡计算的群体所有稳点平均期望杂合度(Exp Het)。发现广东和广西的菌株具有较高的遗传多样性，海南的菌株遗传多样性较低(表2)。

表2 不同群体的遗传多样性结果

注：HN代表采自海南省的多堆柄锈菌群体，GX代表采自广西的群体，GD代表采自广东的群体。

群体分化指数Fst分析

Fst代表群体间的遗传分化程度，其值一般在0-1之间。值越小，说明不同群体间的遗传分化越小，当该值为0时，说明群体间自由交配，当该值为1时，说明群体间不共用任何遗传多样性。通过R软件的hierfstat数据包，计算海南、广东和广西三个群体的群体分化指数Fst，发现群体间分化指数Fst的值均小于0.05，说明群体间分化很小，基本没有差异(表3)。

表3 不同群体的遗传分化指数

群体遗传结构与传播分析

基于SNP数据，利用R软件的ade4、adegenet数据包和ggplot2数据包绘制群体遗传结构图，设置K＝2-10，即假设存在2-10个祖先群体，发现当划分为2个群体时(K＝2)，最接近实际的群体数(此时CV值最低)(图1)。绘制K＝2-4的群体遗传结构图，发现广东和广西群体遗传组成较为一致，与海南群体有一定的差异，海南群体多数被划为一个群。说明广东和广西的菌极有可能是海南的菌源，其传播方向为从广东和广西传到海南。

Claims (9)

1.一种基于SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径的方法，其特征在于，包括酶切多个多堆柄锈菌菌株的DNA；测序；发掘SNP标记；利用SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述测序为简化基因组测序。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述测序在NovaSeq 6000平台上进行。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述发掘SNP标记中使用Stacks软件对测序数据分析。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶切使用EcoRI和MspI内切酶组合。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述利用SNP标记分析玉米南方锈病群体遗传和传播路径包括遗传多样性分析、群体分化指数Fst分析和/或群体遗传结构与传播分析。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法在如下(A)-(H)任一项中的应用：

(A)在多堆柄锈菌群体遗传学中的应用；

(B)在多堆柄锈菌遗传结构分析中的应用；

(C)在多堆柄锈菌遗传多样性分析中的应用；

(D)在多堆柄锈菌群体分化分析中的应用；

(E)在玉米南方锈病菌源中心确定中的应用；

(F)在确定玉米南方锈病病原菌传播途径中的应用；

(G)在玉米南方锈病防治中的应用；

(H)在玉米南方锈病病原菌检测中的应用。

8.EcoRI和MspI内切酶组合在发掘锈菌目SNP位点中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其中所述锈菌为多堆柄锈菌。

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