CN101659989A - 小麦抗白粉病基因Pm2的分子标记及其获得方法 - Google Patents

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Abstract

本发明小麦抗白粉病基因Pm2的分子标记及其获得方法,属于作物遗传育种与生产领域。本研究筛选出7个与Pm2基因连锁的SSR标记,其中1个为共分离标记,3个标记与Pm2的遗传距离低于5cm,它们可有效地用于Pm2基因的标记辅助选择。以该标记为路标,可以进行Pm2基因的精细定位或通过染色体步移法接近Pm2基因,从而为Pm2基因的克隆打下基础。

Description

小麦抗白粉病基因Pm2的分子标记及其获得方法
一、技术领域
本发明小麦抗白粉病基因Pm2的分子标记及其获得方法,提供了与小麦抗白粉病基因Pm2紧密连锁的共显性分子标记,属于作物遗传育种与生产领域。可以有效用于Pm2的跟踪检测和标记辅助育种。
二、背景技术
由专性寄生真菌小麦白粉菌引起的小麦白粉病是危害小麦生产的一种世界性病害。小麦白粉菌具有小种多、变异快、适应范围广等特点,小麦生产中使用抗性基因时,白粉菌群体往往会因寄主抗性基因的选择作用而发生协同进化,克服抗性基因,导致病害大流行(植物病理学报,1995,25:116)。近年来白粉病在我国各大麦区常有发生和流行,危害程度日趋严重,已成为影响和限制小麦高产和稳产的一大障碍。化学防治白粉病虽有一定成效,但需花费大量的人力、物力,而且还会引起环境污染等生态问题。培育和推广抗病品种被公认为是防治小麦白粉病最经济、有效、安全的途径(张增艳等2002中国农业科学,2002,35(7):789-793)。随着分子标记技术的产生和不断发展完善,利用分子标记技术标记抗病基因,并用于标记辅助育种已成为筛选抗病基因聚合体、选育抗病品种的有效方法(张庆利等2004 Agricultural Science in China,2004,3(6):409-415)。而建立与抗病基因紧密连锁的分子标记,是进行分子标记辅助育种的基础。寻找基因分子标记的最常用方法之一是Michelmore(1991Process.Natual.Academic.Science.USA,.1991,88:9828-9832)提出的分离群体分组分析法(BSA)。在小麦中,SSR已被证实是一种非常有效的分子标记,它与其它标记技术相比能检测到更高的多态性(Roder等1995 Mol.Gen.Genet.1995,248:163-167)。
小麦抗白粉病基因Pm2来源于前苏联地方品种Ulka,(Pugsley等1961Australian Journal of Biological Sciences.1961,14:70-75),McIntosh等将其定位于5DS,向齐君等通过对抗性基因对白粉病菌群体的抗性测定,证明Pm2是一个应用广泛、有效的小麦抗白粉病基因。目前,已报道的Pm2基因的分子标记主要是RFLP和RAPD标记,SSR标记的研究报道较少。而与其共分离的分子标记还未见报道。
本研究利用F2分离群体分组法(BSA)对抗白粉病基因Pm2进行了SSR标记分析,寻找与Pm2连锁的SSR标记。
本实验所用材料是以Chancellor为背景带有抗病基因Pm2的小麦近等基因系为抗病亲本,以不具有任何抗病基因的小麦品种Chancellor为感病亲本,配制杂交组合Pm2×Chancellor,获得杂种F1。F1自交,获得F2分离群体。
三、发明内容
本发明的目的是:提供了与小麦抗白粉病基因Pm2紧密连锁的共显性分子标记,有效用于Pm2的跟踪检测和标记辅助育种。而且利用该分子标记在早代就可以进行选择,提高选择的准确性,缩小育种群体,并且不受环境、生长季节的限制,结合加代技术能大大缩短育种年限、提高育种效率。
1、小麦抗白粉病基因Pm2的分子标记,其特征在于:
采用已定位在5D染色体上的71对SSR引物在亲本Chancellor和以Chancellor为背景的Pm2近等基因系间进行多态性筛选,均能扩增出明显可辨的带,其中12对引物的扩增产物在抗、感材料间具有多态性差异,经5次以上重复扩增,结果稳定。从Pm2×Chancellor的F2代分离群体中随机选取10个抗病单株的DNA等量混合,随机选取10个感病单株的DNA等量混合,分别建立抗病池和感病池。利用第一轮筛选出的12对引物在抗、感池间进行第二轮扩增检测,结果有7个引物Xcfd189,Xcfd29,Xcfd8,Xcfd102,Xcfd7,Xcfd57和Xgwm190能在抗、感池间揭示多态性差异,多次重复扩增结果稳定。7对引物所扩增的特异谱带分别记为:Xcfd189360、Xcfd29190、Xcfd8160、Xcfd102250、Xcfd7200、Xcfd57245和Xgwm190210,它们与Pm2基因间的遗传距离分别为0cM,1.5cM,2.3cM,3.9cM,7.9cM,25.1cM和44.1cM,可作为Pm2的SSR标记。其中标记Xcfd189360与Pm2共分离,标记Xcfd29190、Xcfd8160和Xcfd102250与Pm2紧密连锁,这些标记可以有效用于小麦分子标记辅助育种。
2、权利要求1所述小麦抗白粉病基因Pm2的分子标记的获得方法,包括:
步骤一:分离群体的创建
Pm2×Chancellor获得F1种子,F1自交,得F2分离群体。
步骤二:白粉病抗性接种及鉴定
用当前小麦白粉菌的优势小种NO.15号小种对抗、感亲本、所有的F2单株进行两次接种,一次在三叶期(盛宝钦等1988植物保护,1988,1:49-501988),一次在拔节期(CIMMTY),同时以感病亲本Chancellor为感病对照。在感病对照充分发病的条件下,调查抗、感分离情况,每隔2-3天重复调查一次,病级鉴定按盛宝钦等(1988)提出的反应型标准(0-4级)进行。
步骤三:F2代群体的分子标记分析
(1)用Devos(Theor.Appl.Genet,1992,84:567-572)的酚-氯仿提取法,稍有改动,适于1.5ml离心管提取,提取抗、感亲本及F2代群体各单株的DNA;
(2)首先用已定位在5D染色体上的71对SSR引物在亲本Chancellor和以Chancellor为背景的Pm2近等基因系间进行多态性筛选,利用第一轮筛选出的在抗、感材料间具有多态性差异的引物在抗、感池间进行第二轮筛选:
建立抗病池和感病池:从Pm2×Chancellor的F2代分离群体中随机选取10个抗病单株的DNA等量混合,随机选取10个感病单株的DNA等量混合;
SSR-PCR反应体系:PCR反应体积为25μl,其中含有2.5μl 10×PCR Buffer(100mmol/L Tris-HCI(pH 8.3),500mmol/L KCI),2μl 30ng膜板DNA,0.2μl(5U/μl)Taq酶,2μl(25Mm)MgCI2,3μl(2.5μmol/L)引物,2μl(2.5mmol/L)dNTP;
SSR扩增程序:扩增反应在Thermal Cycler 9600 PCR上进行。先进行一次预扩增:95℃变性5分钟,然后进行30个循环的扩增,每个循环95℃变性1分钟,55℃(复性温度因引物不同而异)复性1分钟,72℃延伸1分钟,最后72℃延伸5分钟;
扩增产物的检测:扩增产物在6%聚丙烯酰胺非变性凝胶上稳压110V电泳,银染显色,然后用Tanon Gis-2010型凝胶成像系统照相观察,记录结果:
选择在亲本间和F2代群体的抗、感池间扩增出相同有多态性的引物为与Pm2连锁的SSR分子标记7对,将这7对分子标记在F2代群体单株中扩增获取群体各单株的抗、感反应型资料。
步骤四:分子标记获得
根据连锁交换规律,利用扩增获得的F2代群体各单株基因型资料与田间鉴定获得的对应各单株的抗、感反应型资料构建7对分子标记与Pm2基因的连锁图谱,利用MAPMARKER3.0计算各标记与Pm2基因间的遗传距离分别为0cM、1.5cM、2.3cM、3.9cM、7.9cM、25.1cM和44.1cM(图6),其中标记Xcfd189360与Pm2基因表现共分离,标记Xcfd29190、Xcfd8160和Xcfd102250与Pm2基因的遗传距离分别为1.5cM、2.3cM和3.9cM,表现为紧密连锁。
本发明的有益效果是:
1、本发明在国际上首次获得了与小麦抗白粉病基因Pm2共分离的分子标记;同时一次性获得了3个与小麦抗白粉病基因Pm2紧密连锁的分子标记。小麦基因组巨大,是水稻基因组的40倍,是小麦遗传育种研究的障碍。本发明采用已定位在5D染色体上的71对SSR引物,首次找到了与小麦抗白粉病基因Pm2共分离的分子标记1个,同时一次性获得了3个与小麦抗白粉病基因Pm2紧密连锁的分子标记。可以有效用于Pm2的跟踪检测和标记辅助育种。
2、鉴定方便,提高效率。SSR标记的特点是多态性强、共显性、在整个基因组中随机分布、稳定性好、操作简单;在小麦中,SSR已被证实是一种非常有效的分子标记。利用共分离标记和紧密连锁标记在早代就可以进行选择,提高选择的准确性,缩小育种群体,并且不受环境、生长季节的限制,结合加代技术能大大缩短育种年限、提高育种效率。
3、可用于克隆Pm2基因研究。图位克隆Pm2基因的前提在于获得与Pm2基因紧密连锁的分子标记。标记Xcfd189360与Pm2共分离,标记Xcfd 29190、Xcfd8160和Xcfd102250与Pm2基因紧密连锁。
以下结合附图对本发明作进一步的说明
四、附图说明
图1.SSR引物Xcfd57(A),Xcfd29(B),Xcfd190(C),Xcfd7(D),Xgwm189(E),Xcfd8(F)and Xcfd102(G)在抗病池(R)和感病池(S)间的扩增结果。箭头示产生的特异带。
图2.引物Xcfd189在F2分离群体中的部分扩增结果(S表示感病单株,R表示抗病单株,M表示标准分子量)
图3.引物Xcfd8在F2分离群体中的部分扩增结果(R:表示抗病单株,S:表示感病单株)
图4.引物Xcfd29在F2分离群体中的部分扩增结果(R:表示抗病单株,S:表示感病单株,M表示标准分子量)
图5.引物Xcfd102在F2分离群体中的部分扩增结果(R:表示抗病单株,S:表
示感病单株,M表示标准分子量)
图6.小麦染色体5D上Pm2基因与SSR标记的连锁图谱
五、具体实施方式
本试验所用近等基因系材料是Briggle以含Pm2基因的Ulka为抗病基因的供体,以感白粉病的小麦品种Chancellor为轮回亲本,经7代回交及自交并在施以白粉病的选择压力下育成的,在我国和中欧地区目前对小麦白粉病仍表现出良好的抗性(Zeller,1993 Euphytica 1993,68:223-229)。其载体品种为普通小麦,没有其它基因的连锁累赘,所以Pm2基因是小麦抗白粉病育种中的一个优良抗源。目前获得的Pm2的标记主要是RFLP标记。虽然RFLP标记具有重复性好,稳定可靠的优点,但由于其在小麦中的多态性水平较低,加之操作过程复杂,并使用放射性同位素,因而限制了它在育种实践中的应用。SSR标记是以PCR扩增为基础的新的分子标记,具有多态性强、共显性、在整个基因组中随机分布、稳定性好、操作简单等特点,在小麦中已被证实是一种非常有效的分子标记。
本研究筛选出7个与Pm2基因连锁的SSR标记,其中1个为共分离标记,3个标记与Pm2的遗传距离低于5cM,它们可有效地用于Pm2基因的标记辅助选择。以该标记为路标,可以进行Pm2基因的精细定位或通过染色体步移法接近Pm2基因,从而为Pm2基因的克隆打下基础。
步骤一:分离群体的创建
Pm2×Chancellor获得F1种子,F1自交,得F2分离群体。
步骤二:白粉病抗性接种及鉴定
用当前小麦白粉菌的优势小种NO.15号小种对抗、感亲本、所有的F2单株进行两次接种,一次在三叶期(盛宝钦等1988植物保护,1988,1:49-50),一次在拔节期(CIMMTY),同时以感病亲本Chancellor为感病对照。在感病对照充分发病的条件下,调查抗、感分离情况,每隔2-3天重复调查一次,病级鉴定按盛宝钦等(1988)提出的反应型标准(0-4级)进行。
步骤三:F2代群体的分子标记分析
(1)用Devos(Theor.Appl.Genet,1992,84:567-572)的酚-氯仿提取法,稍有改动,适于1.5ml离心管提取,提取抗、感亲本及F2代群体各单株的DNA;
(2)首先用已定位在5D染色体上的71对SSR引物在亲本Chancellor和以Chancellor为背景的Pm2近等基因系间进行多态性筛选,利用第一轮筛选出的在抗、感材料间具有多态性差异的引物在抗、感池间进行第二轮筛选:建立抗病池和感病池:从Pm2×Chancellor的F2代分离群体中随机选取10个抗病单株的DNA等量混合,随机选取10个感病单株的DNA等量混合;
SSR-PCR反应体系:PCR反应体积为25μl,其中含有2.5μl 10×PCRBuffer(100mmol/L Tris-HCI(pH 8.3),500mmol/L KCI),2μl 30ng膜板DNA,0.2μl(5U/μl)Taq酶,2μl(25Mm)MgCI2,3μl(2.5μmol/L)引物,2μl(2.5mmol/L)dNTP;
SSR扩增程序:扩增反应在Thermal Cycler 9600 PCR上进行。先进行一次预扩增:95℃变性5分钟,然后进行30个循环的扩增,每个循环95℃变性1分钟,55℃(复性温度因引物不同而异)复性1分钟,72℃延伸1分钟,最后72℃延伸5分钟;
扩增产物的检测:扩增产物在6%聚丙烯酰胺非变性凝胶上稳压110V电泳,银染显色,然后用Tanon Gis-2010型凝胶成像系统照相观察,记录结果:
选择在亲本间和F2代群体的抗、感池间扩增出相同有多态性的引物为与Pm2连锁的SSR分子标记7对,将这7对分子标记在F2代群体单株中扩增获取群体各单株的抗、感基因型资料。
步骤四:分子标记获得
根据连锁交换规律,利用扩增获得的F2代群体各单株基因型资料与田间鉴定获得的对应各单株的抗、感反应型资料构建7对分子标记与Pm2基因的连锁图谱,利用MAPMARKER3.0计算各标记与Pm2基因间的遗传距离。找到了分别为0cM、1.5cM、2.3cM、3.9cM、7.9cM、25.1cM和44.1cM(图6),其中标记Xcfd189360与Pm2基因表现共分离,标记Xcfd29190、Xcfd8160和Xcfd102250与Pm2基因的遗传距离分别为1.5cM、2.3cM和3.9cM,表现为紧密连锁。
步骤五:结果与分析
采用定位于小麦5D染色体上的71对SSR引物,在亲本Chancellor和以Chancellor为背景的Pm2近等基因系间进行多态性筛选,能扩增出明显可辨的带,其中12对引物的扩增产物在抗、感材料间具有多态性差异,经多次重复结果稳定。从Pm2×Chancellor的F2代分离群体中随机选取10个抗病单株将其DNA等量混合,随机选取10个感病单株将其DNA等量混合,分别建立抗病池和感病池。利用第一轮筛选出的12对引物在抗、感池间进行第二轮扩增检测,结果有7个引物Xcfd189,Xcfd29,Xcfd8,Xcfd102,Xcfd7,Xcfd57和Xgwm190能在抗、感池间揭示多态性差异,多次重复扩增结果稳定。7个引物扩增的差异片段长分别约为:360bp、190bp、160bp、250bp、200bp、245bp和210bp(图1)。
将Pm2×Chancellor F2分离群体,种植于试验网室,并在12月上旬移栽于温室内。利用15号白粉病菌种在苗期和拔节期分别接种,待充分发病后进行抗病性调查并记载发病情况。在调查的F2分离群体中,苗期共调查157株,其中105株表现抗病,52株表现感病,经chi-square x2检验,抗病株∶感病株符合3∶1分离比例(x2=2.071<x2=3.841);成株期(灌浆期)共调查131株,其中95株表现抗病,36株表现感病,经chi-square x2检验,抗病株∶感病株符合3∶1分离比例(x2=0.077<x2=3.841)。证实小麦抗白粉病基因Pm2是一个单显性基因。
利用筛选出的7对特异引物对131株F2植株进行扩增,获得了稳定的特异标记带,分别记为Xcfd189360、Xcfd29190、Xcfd8160、Xcfd102250、Xcfd7200、Xcfd57245和Xgwm190210。利用MAPMARKER3.0计算各标记与Pm2基因间的遗传距离分别为0cM、1.5cM、2.3cM、3.9cM、7.9cM、25.1cM和44.1cM(图6),其中标记Xcfd189360与Pm2基因表现共分离,标记Xcfd29190、Xcfd8160和Xcfd102250与Pm2基因的遗传距离分别为1.5cM、2.3cM和3.9cM,表现为紧密连锁。引物Xcfd189、Xcfd8、Xcfd29和Xcfd102的部分扩增结果分别见图2、图3、图4和图5。

Claims (4)

1、小麦抗白粉病基因Pm2的分子标记,其特征在于:
采用已定位在5D染色体上的71对SSR引物在亲本Chancellor和以Chancellor为背景的Pm2近等基因系间进行多态性筛选,均能扩增出明显可辨的带,其中12对引物的扩增产物在抗、感材料间具有多态性差异,经5次以上重复扩增,结果稳定,从Pm2×Chancellor的F2代分离群体中随机选取10个抗病单株的DNA等量混合,随机选取10个感病单株的DNA等量混合,分别建立抗病池和感病池,利用第一轮筛选出的12对引物在抗、感池间进行第二轮扩增检测,结果有7个引物Xcfd189,Xcfd29,Xcfd8,Xcfd102,Xcfd7,Xcfd57和Xgwm190能在抗、感池间揭示多态性差异,多次重复扩增结果稳定,7对引物所扩增的特异谱带分别记为:Xcfd189360、Xcfd 29190、Xcfd8160、Xcfd102250、Xcfd7200、Xcfd57245和Xgwm190210,它们与Pm2基因间的遗传距离分别为0cM,1.5cM,2.3cM,3.9cM,7.9cM,25.1cM和44.1cM,可作为Pm2的SSR标记,其中标记Xcfd189360与Pm2共分离,标记Xcfd 29190、Xcfd8160和Xcfd102250与Pm2紧密连锁,这些标记可以有效用于小麦分子标记辅助育种。
2、权利要求1所述小麦抗白粉病基因Pm2的分子标记的获得方法,包括:
步骤一:分离群体的创建
Pm2×Chancellor获得F1种子,F1自交,得F2分离群体;
步骤二:白粉病抗性接种及鉴定
用当前小麦白粉菌的优势小种NO.15号小种对抗、感亲本、所有的F2单株进行两次接种,一次在三叶期,一次在拔节期,同时以感病亲本Chancellor为感病对照,在感病对照充分发病的条件下,调查抗、感分离情况,每隔2-3天重复调查一次,病级鉴定按盛宝钦等提出的反应型标准0-4级进行;
步骤三:F2代群体的分子标记分析
1、用Devos(1992)的酚-氯仿提取法,稍有改动,适于1.5ml离心管提取,提取抗、感亲本及F2代群体各单株的DNA;
2、首先用已定位在5D染色体上的71对SSR引物在亲本Chancellor和以Chancellor为背景的Pm2近等基因系间进行多态性筛选,利用第一轮筛选出的在抗、感材料间具有多态性差异的引物在抗、感池间进行第二轮筛选;
建立抗病池和感病池:从Pm2×Chancellor的F2代分离群体中随机选取10个抗病单株的DNA等量混合,随机选取10个感病单株的DNA等量混合;
SSR-PCR反应体系:PCR反应体积为25μl,其中含有2.5μl 10×PCR Buffer(100mmol/L Tris-HCI(pH 8.3),500mmol/L KCI),2μl 30ng膜板DNA,0.2μl(5U/μl)Taq酶,2μl(25Mm)MgCI2,3μl(2.5μmol/L)引物,2μl(2.5mmol/L)dNTP;
SSR扩增程序:扩增反应在Thermal Cycler 9600PCR上进行,先进行一次预扩增:95℃变性5分钟,然后进行30个循环的扩增,每个循环95℃变性1分钟,55℃(复性温度因引物不同而异)复性1分钟,72℃延伸1分钟,最后72℃延伸5分钟;
扩增产物的检测:扩增产物在6%聚丙烯酰胺非变性凝胶上稳压110V电泳,银染显色,然后用Tanon Gis-2010型凝胶成像系统照相观察,记录结果;
选择在亲本间和F2代群体的抗、感池间扩增出相同有多态性的引物为与Pm2连锁的SSR分子标记7对,将这7对分子标记在F2代群体单株中扩增获取群体各单株的抗、感反应型资料;
步骤四:分子标记获得
根据连锁交换规律,利用扩增获得的F2代群体各单株基因型资料与田间鉴定获得的对应各单株的抗、感反应型资料构建7对分子标记与Pm2基因的连锁图谱,利用MAPMARKER3.0计算各标记与Pm2基因间的遗传距离分别为0cM、1.5cM、2.3cM、3.9cM、7.9cM、25.1cM和44.1cM(图6),其中标记Xcfd189360与Pm2基因表现共分离,标记Xcfd29190、Xcfd8160和Xcfd102250与Pm2基因的遗传距离分别为1.5cM、2.3cM和3.9cM,表现为紧密连锁。
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CN110923352B (zh) * 2019-12-02 2021-07-23 河南大学 小麦抗白粉病基因PmDTM的KASP标记及其应用

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