CN103074333B

CN103074333B - 与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记、其获得方法及应用

Info

Publication number: CN103074333B
Application number: CN201210407964.9A
Authority: CN
Inventors: 郑有良; 陈国跃; 陈时盛; 魏育明; 刘亚西; 蒲至恩; 邓梅
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2032-10-24
Also published as: CN103074333A

Abstract

本发明涉及农业生物技术工程和小麦抗病遗传育种领域，具体地涉及与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记、其获得方法及应用。所述与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记是通过使用简并引物：上游引物：5’-AAGTGGAACAAGGTTACG-3’；下游引物：5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’扩增而得。该标记可用于小麦抗条锈病的辅助选择育种，可克服常规育种中小麦条锈病抗性鉴定易受环境影响、稳定性和重复性较差、工作量大、费时费力、育种周期长等缺点，进而加快小麦抗条锈病品种的育种进程。

Description

与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记、其获得方法及应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术工程和小麦抗病遗传育种领域，具体地涉及与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记、其获得方法及应用。

背景技术

由条型柄锈菌（Puccinia striiformis West.f.sp.tritici，Pst）引起的小麦条锈病是世界性气传叶部病害，病原菌可通过气流在高空远距离传播，导致该病害在不同的小麦生产区域流行，特别是在冷凉或高海拔地区危害尤为严重，造成小麦严重减产。中国是世界上最大且相对独立的小麦条锈病流行区。新毒性小种的产生和流行更加剧了条锈病成灾趋势，使中国小麦再度处于条锈病大流行的威胁中。因此，迫切需要寻找并引入新的抗病基因，增强小麦栽培品种的抗性，以满足生产需要。

抗病新基因的发掘及鉴定是育种工作的基础，也是解决抗性丧失这一难题的根本途径。研究表明，小麦条锈病的抗性主要由主基因控制。目前，我国小麦抗条锈病育种面临严峻局面，一方面我国小麦主栽品种或骨干亲本完全丧失抗性；另一方面，我国目前的主栽品种抗性遗传基础狭隘，抗源单一。这一现状已经构成小麦抗条锈病育种的瓶颈。因此，发掘抗条锈新病基因并高效转育到现有品种中已经成为我国小麦抗条锈病育种中的重要任务。

利用分子标记对抗性基因进行精确定位，将有助于抗源的有效利用。利用分子标记进行基因定位具有简单、快速、精确等优点。目前，主要利用RAPD、SSR、AFLP、RGAP、RFLP等几种DNA分子标记技术在50个正式命名的抗条锈病主效基因和暂定名的抗条锈主效基因中已经找到了与48个抗条锈基因连锁的分子标记。在所有的标记技术中，利用SSR和RGAP技术进行条锈病抗性基因定位已成为两种主要方式。其中，由于SSR标记技术具有数量丰富、多态性、遗传上通常为共显性、操作简便、结果可靠和易于交流等优点，目前利用该技术已成功筛选和鉴定多个条锈病抗性基因（如Yr2、Yr5等）。另外，一种基于抗病基因保守序列设计引物，进而扩增植物抗病基因的一种分子标记技术——RGAP（抗病基因类似序列扩增多态性）已日渐成为标记条锈病抗性基因的主要技术手段，利用该技术已对Yr5、Yr9、Yr39、Yr43、Yr44、YrExp1、YrExp2、等基因进行了标记。但基于单一或少数组合的分离群体而得到的条锈病抗性基因连锁标记，通用性常受品种背景的限制；而且多数标记距目标基因较远，导致这些标记在育种中的应用不多。

引自国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）的小麦新种质HRMSN-81，经多年多点田间条锈病抗性鉴定表明，该种质对我国目前条锈病菌流行生理小种具有良好抗性。遗传分析表明，HRMSN-81含有一对抗我国条中31、32和33混合生理小种的显性基因。因此，筛选该抗性基因连锁分子标记，可望直接应用于小麦抗病品种的选育，以提高选择效率和加快小麦抗病育种进程。

发明内容

为了解决上述问题，本申请的发明人提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供及与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记。

本发明的再一目的是提供获得上述与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记的方法。

本发明的另一目的是提供上述与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记的应用。

本发明针对上述研究背景，以HRMSN-81/台长29的F₂群体为作图群体，通过抗病性鉴定结果和RGAP标记数据间的连锁分析，获得了与小麦条锈病抗性基因连锁的标记Xwgp_-160bp，该标记可应用于小麦条锈病抗病品种的辅助选择育种。

根据本发明的与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记，通过使用简并引物：上游引物：5’-AAGTGGAACAAGGTTACG-3’；下游引物：5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’扩增而得，所述分子标记的大小为160bp，其定位在小麦2D短臂上，遗传距离为3.4cM。

本发明还提供了上述分子标记在鉴定小麦抗条锈病方面的应用。根据本发明的具体实施例方式，以抗病品种HRMSN-81与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F5）单个小麦株系（L1-L5）对象，通过检测其特异分子标记Xwgp_-160bp的带型数据，结合田间抗病鉴定表型数据，可以预测该株系对小麦条锈病的抗性。

根据本发明的鉴定小麦抗条锈病的方法包括使用简并引物：上游引物：5’-AAGTGGAACAAGGTTACG-3’；下游引物：5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’进行扩增的步骤。

根据本发明的获得与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）以感病小麦品种台长29为母本，抗病品种HRMSN-81为父本，构建F₂遗传作图群体，构建的F₂群体为抗条锈病基因遗传作图群体；

（2）用提取小麦亲本幼苗及其F₂群体单株DNA；

（3）采用抗病基因类似序列多态性分子标记技术进行小麦条锈病抗性分子标记的筛选，其中，使用简并引物：上游引物：5’-AAGTGGAACAAGGTTACG-3’；下游引物：5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’扩增抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池以及它们的F₂遗传作图群体得到RGAP特异分子标记Xwgp_-160bp，经过连锁性鉴定，发现该标记与小麦条锈病抗性基因连锁。

根据本发明的获得与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记的方法，其中，采用RGAP分子标记进行筛选与小麦抗条锈病基因相连锁分子标记的方法是：

（1）使用RGAP引物在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池以及它们的F2遗传作图群体中进行DNA多态性分析；

（2）分子标记的连锁性分析：对HRMSN-81与感病亲本台长29杂交获得的F₂单株抗性进行田间鉴定，调查F₂单株抗病性，分别提取F₂单株DNA，用与步骤（1）同样的反应体系、引物及程序进行单株PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值计算标记与抗条锈病基因之间的遗传距离。

根据本发明的具体实施方式，本发明所提供的与小麦条锈病抗性基因连锁的RGAP标记Xwgp_-160bp，是通过以下方法获得的：

1）以感病小麦品种台长29为母本，抗病品种HRMSN-81为父本，构建F₂遗传作图群体，分单株收获F_2:3家系的种子用于抗性鉴定；

2）以SDS方法提取亲本、抗病基因池、感病基因池及F₂代的DNA。

3）根据Shi等在2001年发表的引物相关信息（2001，Genome 44：509-516）合成RGAP引物，PCR后采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，获得分子标记数据；

4）利用条中31、32和条中33条锈病生理混合小种对HRMSN-81与感病亲本台长29杂交、自交获得的F₂单株抗性进行田间鉴定，条锈病接种在两叶一心的小麦苗，将条锈病菌人工接种至病害鉴定圃的诱发行上，通过自然传播接种，当诱发行完全发病时，测定F₂单株抗病性，调查级别分为高抗（HR）、抗（R）、中抗（MR）、感（S）和高感（HS）五级。其中，测定病级为高抗（HR）、抗（R）或中抗的单株确定为抗病，而测定病级为中感或高感的单株确定为感病。

5）利用条中31、32和条中33条锈病生理混合小种对HRMSN-81与感病亲本台长29杂交、自交获得的F_2：3株系抗性进行田间鉴定，条锈病接种在分蘖期的小麦苗，将条锈病菌人工接种至病害鉴定圃的诱发行上，通过自然传播接种，当诱发行完全发病时，测定F_2：3株系各单株抗病性，调查级别分为高抗（HR）、抗（R）、中抗（MR）、感（S）和高感（HS）五级。其中，测定病级为高抗（HR）、抗（R）或中抗（MR）的单株确定为抗病，而测定病级为感（S）或高感（HS）的单株确定为感病。

6）结合4）和5）结果，确定F₂单株抗病性及携带抗病基因杂合性。

7）用SDS法提取小麦亲本幼苗及其F₂群体单株DNA；并根据6）结果，分别筛选15个抗病基因纯合F₂单株和15个感病基因纯合F₂单株等量DNA混合，构建抗病基因池和感病基因池。

8）采用RGAP分子标记方法进行小麦条锈病抗性基因分子标记的筛选，其具体获得与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记的方法是：

（1）RGAP引物在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及其它们的F₂单株间DNA多态性分析：

用RGAP标记技术筛选，根据Shi等在2001年发表的RGAP引物序列合成的引物（2001，Genome 44：509-516），在ABI-9700PCR仪上进行PCR扩增，PCR扩增反应体系：25ng/μl小麦基因组DNA 2.5μl,10×PCR Buffer 2.5μl，25mM MgCl₂3μl，2.5mMdNTP 1.5μl，100μM引物0.5μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.6μl，ddH₂O 14.4μl，总体系25μl。扩增反应程序：94℃变性5分钟，94℃变性30秒，45℃退火45秒，72℃延伸1分钟，45个循环，最后72℃延伸10分钟；产物检测：8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，点击缓冲液为1×TBE，恒定功率90瓦。凝胶染色采用硝酸银染色；照相并在白光灯箱上记录实验结果。

（2）分子标记的连锁性鉴定：

根据连锁遗传定律，按照MapmakerEXP3.0b软件要求，将抗病亲本HRMSN-81和抗病基因池相同的带型赋值为“A”，与感病亲本台长29和感病基因池相同的带型赋值为“B”，同时扩增出抗病亲本、抗病基因池和感病亲本、感病基因池两种带型的赋值为“H”，带型不清楚或缺失的赋值为“-”，结合4）田间抗病性鉴定结果，用Kosambi函数算出遗传距离。

9）筛选出一个RGAP分子标记Xwgp_-160bp，由抗病基因类似序列简并引物（上游引物：AAGTGGAACAAGGTTACG；下游引物：5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’）扩增抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池以及它们的F₂遗传作图群体，发现在160bp处存在一标记，经过连锁性鉴定，发现该标记与小麦条锈病抗性基因连锁。

进而，将上述与小麦条锈病抗性基因相连锁RGAP分子标记Xwgp_-160bp定位于小麦2D染色体短臂上，其具体定位的方法是：

（1）以SDS方法提取抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及一套小麦缺体-四体（包括：N1AT1D、N1BT1D、N1DT1B、N2AT2D、N2BT2D、N2DT2A、N3AT3D、N3BT3D、N3DT3A、N4AT4D、N5AT5D、N5DT5A、N6AT6D、N6BT6D、N7AT7D、N7BT7D、N7DT7A）及2D染色体双端体（Dt2DS和Dt2DL）遗传材料DNA。

（2）分子标记Xwgp_-160bp在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及一套小麦缺体-四体及2D染色体双端体遗传材料间DNA多态性分析：

抗病基因类似序列简并引物（上游引物：5’-AAGTGGAACAAGGTTACG-3’；下游引物：5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’），在ABI-9700PCR仪上进行PCR扩增，PCR扩增反应体系：25ng/μl小麦基因组DNA 2.5μl,10×PCR Buffer 2.5μl，25mMMgCl₂3μl，2.5mM dNTP 1.5μl，100μM引物0.5μl，2.5U/μl TaqDNA聚合酶0.6μl，ddH₂O 14.4μl，总体系25μl。扩增反应程序：94℃变性5分钟，94℃变性30秒，45℃退火45秒，72℃延伸1分钟，45个循环，最后72℃延伸10分钟；产物检测：8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，点击缓冲液为1×TBE，恒定功率90瓦。凝胶染色采用硝酸银染色；照相并在白光灯箱上记录实验结果。

（3）分子标记Xwgp_-160bp在染色体上的定位鉴定：

在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及一套小麦缺体-四体及2D染色体双端体遗传材料间扩增出的DNA谱带中找到一条160bp大小的多态性带纹，该谱带在一套小麦缺体-四体及2D染色体双端体遗传材料中表现缺失的染色体或染色体臂即被定位到相应的染色体和染色体臂上。

10)分子标记Xwgp_-160bp在抗性基因辅助选择的应用，其具体的方法是：

（1）利用条中31、32和条中33条锈病生理混合小种对抗病品种HRMSN-81与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F₅）5个小麦株系（L1-L5）、11个与抗病品种HRMSN-81无亲缘关系的小麦育成品种（包括：内麦8号、内麦9号、科成麦2号、川麦47、川麦42、川农16、绵麦4号、绵阳3号、绵阳26、绵阳29、川辐5号）抗性进行田间鉴定，条锈病接种在两叶一心的小麦苗，将条锈病菌人工接种至病害鉴定圃的诱发行上，通过自然传播接种，当诱发行完全发病时，测定F₂单株抗病性，调查级别分为高抗（HR）、抗（R）、中抗（MR）、感（S）和高感（HS）五级。其中，测定病级为高抗（HR）、抗（R）或中抗的单株确定为抗病，而测定病级为中感或高感的单株确定为感病。

（2）用SDS法提取（1）提及小麦材料DNA；

（3）分子标记Xwgp_-160bp在（2）DNA多态性分析：

抗病基因类似序列简并引物（上游引物：5’AAGTGGAACAAGGTTACG-3’；下游引物：5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’），在ABI-9700PCR仪上进行PCR扩增，PCR扩增反应体系：25ng/μl小麦基因组DNA 2.5μl,10×PCR Buffer 2.5μl，25mM MgCl₂3μl，2.5mM dNTP 1.5μl，100μM引物0.5μl，2.5U/μlTaq DNA聚合酶0.6μl，ddH₂O 14.4μl，总体系25μl。扩增反应程序：94℃变性5分钟，94℃变性30秒，45℃退火45秒，72℃延伸1分钟，45个循环，最后72℃延伸10分钟；产物检测：8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，点击缓冲液为1×TBE，恒定功率90瓦。凝胶染色采用硝酸银染色；照相并在白光灯箱上记录实验结果。

（4）利用分子标记Xwgp_-160bp对抗性基因的鉴定：

在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及抗病品种HRMSN-81与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F₅）5个小麦株系（L1-L5）、11个与抗病品种HRMSN-81无亲缘关系的小麦育成品种（包括：内麦8号、内麦9号、科成麦2号、川麦47、川麦42、川农16、绵麦4号、绵阳3号、绵阳26、绵阳29、川辐5号）材料间扩增出的DNA谱带中找到一条160bp大小的多态性带纹，该谱带在感病亲本、感病基因池和11个与抗病品种HRMSN-81无亲缘关系的小麦育成品种（包括：内麦8号、内麦9号、科成麦2号、川麦47、川麦42、川农16、绵麦4号、绵阳3号、绵阳26、绵阳29、川辐5号）中表现缺失，而在抗病亲本、抗病基因池及抗病品种HRMSN-81与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F₅）5个抗病小麦株系（L1-L5）中表现存在，结合田间表型抗性鉴定结果，从而证实该抗性基因特异分子标记Xwgp_-160bp可以预测抗性基因在小麦材料中的存在。

本发明的积极性效果及应用如下：

1、本发明使用的PCR体系，不需要特殊的PCR仪器和特殊的反应试剂，普通商业公司生产的产品均能达到要求。

2、本发明获得的与条锈病抗性基因紧密连锁的分子标记，是在对我国条锈病高抗的小麦新种质HRMSN-81及其遗传作图群体中获得的新的标记，该标记与抗性基因遗传距离近，PCR扩增重复性好，稳定性强，可以用于小麦条锈病品种鉴定和小麦抗病后代的分子辅助选择，进而加快抗病品种的育种进程。

3、为克隆小麦抗条锈病基因、基因序列分析以及转抗条锈病基因小麦研究奠定了良好的基础。

附图说明

图1显示RGAP标记Xwgp_-160bp在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及其F2群体中的扩增。（RP为抗病亲本HRMSN-81；SP为感病亲本台长29；RB为抗病基因池；SB为感病基因池；R为抗病表型；S为感病表型；“+”为具有特异标记；“-”为无特异标记带；箭头表示RGAP标记Xwgp_-160bp）。

图2显示RGAP标记Xwgp_-160bp在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及小麦缺体-四体和2D双端体遗传材料中的PCR扩增。（RP为抗病亲本HRMSN-81；SP为感病亲本台长29；RB为抗病基因池；SB为感病基因池；黑色实心箭头表示RGAP标记Xwgp_-160bp；白色空心箭头表示特异标记带缺失染色体或染色体臂）。

图3显示RGAP标记Xwgp_-160bp在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及抗病品种HRMSN-81与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F₅）5个小麦株系（L1-L5）、11个与抗病品种HRMSN-81无亲缘关系的小麦育成品种（包括：内麦8号、内麦9号、科成麦2号、川麦47、川麦42、川农16、绵麦4号、绵阳3号、绵阳26、绵阳29、川辐5号的PCR扩增。（RP为抗病亲本HRMSN-81；SP为感病亲本台长29；RB为抗病基因池；SB为感病基因池；黑色实心箭头表示RGAP标记Xwgp_-160bp）。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：与小麦条锈病抗性基因连锁的RGAP分子标记Xwgp_-160bp的获得

1、供试材料

植物材料：以感病品种台长29为母本，抗病新种质HRMSN-81为父本，构建F₂遗传作图群体。2010年正季将F₂群体的148个单株种植于四川农业大学成都校区温江试验基地病害鉴定圃，用于抗性鉴定。苗期取各单株的部分叶片，用于RGAP分析。成熟时，收获F_2:3家系的种子，晾干保存，2011年用于抗性鉴定。

条锈病菌混合生理小种：用于F₂群体及F_2:3家系抗性鉴定的条锈病菌混合生理小种由条中31、32和33三个小种等量混合组成。

2、抗性鉴定

田间试验设计：2010年及2011年正季，四川农业大学成都校区温江试验基地病害鉴定圃分别将感病品种台长29、抗病新种质HRMSN-81及其F₂群体和F_2:3家系单粒播种，行长2.0m，行距20cm，每行播种10粒，每间隔20行设置一行感病对照品种SY95-71，在鉴定圃周围分别种植1行用于条锈病诱发感病品种SY95-71和Taichung29。

抗性鉴定：采用人工接种方式进行田间抗性鉴定。当小麦幼苗长至二叶一心时用涂抹法对条锈病诱发感病品种SY95-71和感病亲本Taichung29进行单株人工接种。待感病亲本台长29发病充分后，记载抗病性。按以下标准进行条锈病抗性鉴定：

高抗（HR）：无可见侵染；

抗（R）：仅产生枯死斑点或失绿反应，无夏孢子堆；

中抗（MR）：夏孢子堆较小，周围有枯死或失绿反应；

感（S）：夏孢子堆中等，周围无枯死或失绿反应；

高感（HS）：夏孢子堆大，周围无枯死或失绿反应。

鉴定结果发现F₂群体中表现为感病的有35株，其后代F_2:3株系表现均为感病；F₂表现为抗病的有113株，其对应的F_2:3中全部植株表现为抗性的有38个株系，而表现为抗感分离的株系有75个。F₂群体抗感分离比符合3:1，F_2:3株系抗感分离比符合1:2:1，说明抗病新种质HRMSN-81携带了一个显性主效抗条锈病基因。

3、基因组DNA提取

采用CTAB法提取基因组DNA。取2g新鲜幼嫩叶片,液氮研磨成细粉后加预热至65℃的2×CTAB提取液(2%CTAB，1.4M NaCl，0.1MTris-HCl（pH8.0），0.1M EDTA（pH8.0），临用前加2%β-巯基乙醇15ml，混匀。

65℃水浴30-45min，其间轻摇混匀。

冷却至室温后加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000rpm离心10min。

取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA。

勾出DNA，用70%酒精洗2次，无水乙醇洗一次，气干DNA，溶于适量pH8.0的TE溶液中。

0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。紫外分光光度法测定各样品DNA浓度，将各样品DNA稀释至25ng/μl备用。

4、RGAP分析

从Shi等在2001年发表论文的引物相关信息（2001，Genome 44：509-516）获得13条引物序列（由上海英俊生物技术有限公司合成），这些引物共组成78对引物组合。PCR反应体系和扩增程序参照Shi等（2001）的方法，具体如下：

1）PCR反应体系（25μl）

PCR反应在ABI9700热循环仪中进行，扩增产物置4℃备用。

3）电泳检测

用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，用银染的方法进行显色，照相并在白光灯箱上记录实验结果（图1）。

5、分子标记连锁性鉴定

利用亲本、基因池多态性检测筛选出的RGAP标记对148个F₂单株进行分析，按照MAPMAKER软件（Lander et al.,1987）的要求，将抗病亲本HRMSN-81和抗病基因池相同的带型赋值为“A”，与感病亲本台长29和感病基因池相同的带型赋值为“B”，同时扩增出抗病亲本、抗病基因池和感病亲本、感病基因池两种带型的赋值为“H”，带型不清楚或缺失的赋值为“-”。用Kosambi函数算出遗传距离。经计算，获得一个RGAP分子标记Xwgp_-160bp，由抗病基因类似序列简并引物（上游引物：5’-AAGTGGAACAAGGTTACG-3’；下游引物：5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’）扩增抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池以及它们的F₂遗传作图群体，发现在160bp处存在一标记，与小麦条锈病抗性基因连锁，遗传距离为3.4cM。

实施例2：特异RGAP分子标记Xwgp-160bp的染色体定位

1、供试材料

中国春、中国春缺体-四体（包括：N1AT1D、N1BT1D、N1DT1B、N2AT2D、N2BT2D、N2DT2A、N3AT3D、N3BT3D、N3DT3A、N4AT4D、N5AT5D、N5DT5A、N6AT6D、N6BT6D、N7AT7D、N7BT7D、N7DT7A）及2D染色体双端体（Dt2DS和Dt2DL）遗传材料。

2、基因组DNA提取同实施例1。

3、特异分子标记Xwgp_-160bp的RGAP分析

筛选出一个与小麦抗条锈病基因连锁的分子标记Xwgp_-160bp，是由扩增抗病基因类似序列简并引物（上游引物：5’-AAGTGGAACAAGGTTACG-3’；下游引物：5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’）获得的。利用该简并引物对，对上述中国春、中国春缺体-四体及2D染色体双端体遗传材料进行RGAP分析，RGAP分析实施例1。

4、特异分子标记Xwgp_-160bp在染色体上的定位鉴定

在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及一套小麦缺体-四体及2D染色体双端体遗传材料间扩增出的DNA谱带中找到一条160bp大小的多态性带纹，该谱带在一套小麦缺体-四体及2D染色体双端体遗传材料中表现缺失的染色体或染色体臂即被定位到相应的染色体和染色体臂上。扩增条带观察表明，该分子标记被定位在小麦2D短臂上（图2）。

实施例3：小麦条锈病抗性基因分子辅助选择

1、供试材料

植物材料：感病品种台长29、抗病新种质HRMSN-81，抗病品种HRMSN-81与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F₅）5个小麦株系（L1-L5）、11个与抗病品种HRMSN-81无亲缘关系的小麦育成品种，包括：内麦8号、内麦9号、科成麦2号、川麦47、川麦42、川农16、绵麦4号、绵阳3号、绵阳26、绵阳29、川辐5号。2011年正季将上述材料种植于四川农业大学成都校区温江试验基地病害鉴定圃，用于抗性鉴定。苗期取各单株的部分叶片，用于RGAP分析。

条锈病菌混合生理小种：用于抗性鉴定的条锈病菌混合生理小种由条中31、32和33三个小种等量混合组成。

2、抗性鉴定

同实施例1。

3、基因组DNA提取

同实施例1。

4、特异分子标记Xwgp_-160bp的RGAP分析

筛选出一个与小麦抗条锈病基因连锁的分子标记Xwgp_-160bp，是由扩增抗病基因类似序列简并引物（上游引物：5’-AAGTGGAACAAGGTTACG-3’；下游引物：5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’）获得的。利用该简并引物对，对上述感病品种台长29、抗病新种质HRMSN-81，抗病品种HRMSN-81与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F₅）5个小麦株系（L1-L5）、11个与抗病品种HRMSN-81无亲缘关系的小麦育成品种，包括：内麦8号、内麦9号、科成麦2号、川麦47、川麦42、川农16、绵麦4号、绵阳3号、绵阳26、绵阳29、川辐5号进行RGAP分析，RGAP分析同实施例1。

5、抗条锈病基因特异分子标记Xwgp_-160bp的辅助选择

在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及抗病品种HRMSN-81与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F5）5个小麦株系（L1-L5）、11个与抗病品种HRMSN-81无亲缘关系的小麦育成品种（包括：内麦8号、内麦9号、科成麦2号、川麦47、川麦42、川农16、绵麦4号、绵阳3号、绵阳26、绵阳29、川辐5号）材料间扩增出的DNA谱带中找到一条160bp大小的多态性带纹，该谱带在感病亲本、感病基因池和11个与抗病品种HRMSN-81无亲缘关系的小麦育成品种（包括：内麦8号、内麦9号、科成麦2号、川麦47、川麦42、川农16、绵麦4号、绵阳3号、绵阳26、绵阳29、川辐5号）中表现缺失，而在抗病亲本、抗病基因池及抗病品种HRMSN-81与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F5）5个抗病小麦株系（L1-L5）中表现存在，结合田间表型抗性鉴定结果，从而证实该抗性基因特异分子标记Xwgp-160bp可以预测抗性基因在小麦材料中的存在。（图3）。

Claims

1.与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记，其特征在于，使用简并引物：上游引物：5’-AAGTGGAACAAGGTTACG-3’；下游引物：5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’扩增抗病品种HRMSN-81而得。

2.权利要求1所述的分子标记在鉴定小麦抗条锈病方面的应用。