CN104498484B - 西葫芦白粉病显性抗病基因pm1的连锁分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与西葫芦白粉病显性抗病基因Pm1的连锁SSR分子标记（Pm‑136），属于蔬菜分子抗病育种技术领域，涉及白粉病显性抗病基因的连锁SSR分子标记及其应用。所述的分子标记Pm‑136与抗病基因的遗传距离为1.7 cm。利用分子标记Pm‑136可快速准确的检测抗病性状转育后代植株是否携带Pm1抗病基因，从而显著提高抗病育种效率，缩短育种周期。本发明获得的Pm‑136标记具有稳定可靠、操作简单、重复性好等优点，在鉴别抗、感品种和抗病转育单株时具有非常高的利用价值。

Description

西葫芦白粉病显性抗病基因pm1的连锁分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及蔬菜分子抗病育种技术领域，具体为一种与西葫芦（CucurbitapepoL.）白粉病显性抗病基因Pm1连锁的SSR分子标记，以及该标记在检测抗病植株中的应用。

背景技术

西葫芦是全球范围内普遍栽植的南瓜属重要蔬菜之一，在我国的栽培面积逐年增加，特别是近年来保护地设施栽培发展迅速，已成为继黄瓜之后的第二大栽培作物。西葫芦生产对农民增收、农业结构调整以及丰富人民的菜篮子有着重要意义。

白粉病是危害西葫芦中后期生产的重要病害之一，植株感染白粉病后光合作用严重降低，植株生长缓慢，降低产量与品质，产量损失可达40%左右。西葫芦白粉病主要由单囊壳菌（Sphaerothecafuliginea）和二孢白粉菌（Erysiphecichoracearum）侵染导致，西葫芦对白粉病没有免疫类型，高抗材料也非常少，随着保护地西葫芦生产面积的迅速增加，在高温高湿的环境下，白粉病的发生变的越来越为严重，已经成为西葫芦生产和制种的主要障碍。尽管白粉病可采用化学防治，但由于危害西葫芦白粉病的生理小种较多，分化快，化学药剂很难有效保证生产，而且化学防治污染环境，危害消费者健康。因此，培育和推广抗白粉病品种是解决这一问题最经济、安全、有效的措施。但目前，传统抗病育种存在抗病基因转育困难，抗病性状鉴别准确性差，抗病育种效率低、周期长等问题，导致生产中抗病品种少，不能满足生产需要。紧密连锁的分子标记可以加速抗病育种进程、提高选择的准确性，是分子标记辅助选择育种的必要条件。而与瓜类白粉病抗性连锁的分子标记的研究主要集中在西瓜、甜瓜及黄瓜上，国内外至今未见西葫芦的相关研究报道。因此，开发与西葫芦白粉病抗病基因紧密连锁的分子标记，对于提高西葫芦抗病育种效率，拓展抗病基因应用范围，保障西葫芦的健康生产具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有西葫芦白粉病抗病育种技术的上述不足，提供西葫芦白粉病显性抗病基因Pm1的分子标记。本发明的另一目的是提供该西葫芦白粉病抗病基因Pm1的分子标记应用。

本发明的一个目的提供西葫芦白粉病显性抗病基因Pm1的分子标记可通过如下技术方案实现：

西葫芦白粉病显性抗病基因Pm1的连锁 SSR分子标记，所述的分子标记为Pm-136，其具有分子序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。

为实现上述发明目的获得分子标记是通过以下方案实现的：

所述分子标记的获得方法包括如下步骤：

应用SSR-BSA技术：以西葫芦自交系BS15和BS9分别作为感病和抗病亲本配制F₂代分离群体，用SSR引物筛选与西葫芦白粉病显性抗病基因Pm1连锁的分子标记，得到共显性分子标记Pm-136，该标记与抗病基因Pm1的遗传连锁距离为1.7 cM。

本发明的另一目的是通过以下方案实现的。

一种所述分子标记在对西葫芦种质资源白粉病抗病基因的鉴定和转移中的应用。

本发明的另一目的是通过以下方案实现的。

一种检测西葫芦白粉病抗病基因Pm1的方法，用以下的一对分子标记引物PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物：

分子标记Pm-136：

左端引物序列为SEQ ID NO. 1，

右端引物序列为SEQ ID NO. 2，

如果用引物Pm-136能够扩增出131 bp的扩增片段，则标志着待检测西葫芦存在白粉病显性抗病基因Pm1。

检测方法的条件是：所述PCR反应体积为15μL，其中10×buffer 1.5μL，2.5 mMdNTPs 0.3μL，Tag酶0.2μL，10 μM引物各0.3μL，模版DNA 30 ng，加ddH₂O至15μL；PCR反应的条件为DNA 95℃预变性3min后，94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。

本发明的另一目的是通过以下方案实现的。

一种筛选抗白粉病抗病基因Pm1西葫芦的方法，用所述的分子标记对扩增待检西葫芦基因组DNA，用所述的分子标记Pm-136能够扩增出131 bp的扩增片段，则标志该待检西葫芦为存在Pm1抗病基因的抗白粉病毒病西葫芦。

筛选方法的条件是：所述PCR反应体积为15μL，其中10×buffer 1.5μL，2.5 mMdNTPs 0.3μL，Tag酶0.2μL，10 μM引物各0.3μL，模版DNA 30 ng，加ddH₂O至15μL；所述PCR反应的条件为DNA 95℃预变性3min后，94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。

有益效果：

本发明在西葫芦自交系BS9中发现了一个白粉病显性抗病基因Pm1，其优异的抗病表现在西葫芦抗病育种中具有重要的利用价值。获得了与抗病基因紧密连锁的分子标记Pm-136。利用获得的分子标记进行辅助选择，成功的将抗病基因通过杂交、回交转育的方法导入西葫芦优良自交系BS15中，使其获得白粉病抗性。

1、在西葫芦自交系BS9中鉴定了一个白粉病显性抗病基因Pm1。

2、获得与西葫芦白粉病抗病基因Pm1紧密连锁的共显性分子标记Pm-136。Pm-136与抗病基因的遗传距离为1.7 cm。利用该标记能够通过辅助选择鉴定将抗病基因成功导入其它西葫芦感病优良自交系，使之获得抗病性状。

3、鉴定方便。分子标记具有扩增稳定、检测方便、快速准确等优点。用标记Pm-136检测西葫芦抗病基因Pm1，可以确定抗病基因是否存在以及存在状态，并预测植株对白粉病的抗性，加快该抗病基因的利用。

4、本发明提出了利用西葫芦白粉病抗病种质资源BS9中抗病基因的方法：利用分子标记筛选，通过杂交与回交转育将抗病基因导入西葫芦优良的感病自交系中，利用该方法成功将抗病基因Pm1导入西葫芦优良自交系BS15，使其获得了白粉病抗性。

附图说明

图1为分子标记Pm-136与西葫芦抗病基因Pm1的遗传连锁图，左边为标记间的图距；

图2为分子标记扩增带型；

Pm-136扩增带型，其中P1为感病亲本BS15，P2为抗病亲本BS9，F1为杂交一代；1-23为以BS15为轮回亲本的回交单株；M：Trans DNA markerII, 箭头所指为131 bp特异扩增条带。

具体实施方式

实施例1

西葫芦白粉病显性抗病基因Pm1的连锁SSR分子标记，所述的分子标记为Pm-136，其具有序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。

所述的西葫芦白粉病显性抗病基因Pm1的连锁 SSR分子标记的获得方法，、包括如下步骤：

应用SSR-BSA技术：以西葫芦自交系BS15和BS9分别作为感病和抗病亲本配制F₂代分离群体，用SSR引物筛选与西葫芦白粉病显性抗病基因Pm1连锁的分子标记，得到共显性分子标记Pm-136，该标记与抗病基因Pm1的遗传连锁距离为1.7 cm。

所述的分子标记在对西葫芦种质资源白粉病抗病基因的鉴定和转移中的应用。

一种检测西葫芦白粉病抗病基因Pm1的方法，包括以下步骤：

用以下的一对分子标记引物PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物：

分子标记Pm-136：

左端引物序列为SEQ ID NO. 1，

右端引物序列为SEQ ID NO. 2，

用所述分子标记Pm-136能够扩增出131 bp的扩增片段，则标志着待检测西葫芦存在白粉病显性抗病基因Pm1。

进一步的，所述PCR反应体积为15μL，其中10×buffer 1.5μL，2.5 mM dNTPs 0.3μL，Tag酶0.2μL，10μM引物各0.3μL，模版DNA 30 ng，加ddH₂O至15μL。所述PCR反应的条件为DNA 95℃预变性3min后，94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。

一种筛选抗白粉病抗病基因Pm1西葫芦的方法，用所述的分子标记对扩增待检西葫芦基因组DNA，用所述的分子标记Pm-136能够扩增出131 bp的扩增片段，则标志该待检西葫芦为存在Pm1抗病基因的抗白粉病毒病西葫芦。

进一步的，所述PCR反应体积为15μL，其中10×buffer 1.5μL，2.5 mM dNTPs 0.3μL，Tag酶0.2μL，10 μM引物各0.3μL，模版DNA 30 ng，加ddH₂O至15μL。所述PCR反应的条件为DNA 95℃预变性3min后，94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。

实施例2

本实施例具体描述了所述的与西葫芦白粉病显性抗病基因Pm1的连锁SSR分子标记的获得方法，包括以下步骤：

（一）西葫芦自交系BS15与BS9 F2代的创建与表型鉴定：

（1）西葫芦自交系BS15（母本）与BS9（父本）进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2代群体。

（2）F2代群体单株种植于温室营养钵内，外罩防虫网，子叶完全展开后接种白粉病菌孢子，接种15天后进行抗病性状调查。鉴定结果见表1。

R、S分别代表抗病单株、感病单株。χ2_{0.05, 1}=3.84。

（3）F2代单株进行性状调查后将感病植株移栽于温室种植，自交所得种子为F3家系。每个F3家系中选择10粒种子进行子代抗病性测验，以验证F2代感病单株是否携带纯合感病基因。

（4）通过对F2代单株进行遗传分析，发现西葫芦自交系BS9携带一个显性抗病基因。

（二）多态性分子标记筛选

（5）将10株抗病F2单株的叶片等量混成抗池，10株感病F2单株的叶片等量混成感池。用CTAB法（Sue Porebski L., 1997）提取抗病亲本BS9、感病亲本BS15、抗池和感池的DNA，应用简单重复序列标记SSR与BSA（Bulk Segregant Analysis）结合的方法进行多态性分子标记筛选。

（6）首先利用584对SSR引物（Amine Zraidi, Gertraud Stift, Martin Pachner,Abdolali Shojaeiyan, Li Gong, Tamas Lelley (2007) A consensus map forCucurbita pepo. Mol. Breeding 20(4):375-388; Gong L, Stift G, Kofler R,Pachner M, Lelley T (2008) Microsatellites for the genus Cucurbita and anSSR-based genetic linkage map of Cucurbita and an SSR-based genetic linkagemao of Cucurbita pepo L. Theor Appl Genet 117: 37-48; Blanca J, Canizares J,Roig C, Ziarsolo P, Nuez F, Picó B. (2011) Transcriptome characterization andhigh throughput SSRs and SNPs discovery in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae).BMC Genomics 12: 104）对BS9、BS15、抗池和感池进行多态性筛选；

PCR反应体积为15μL，其中10×buffer 1.5μL，2.5 mM dNTPs 0.3μL，Tag酶（5单位/μL）0.2μL，10μM引物（F/R）各0.3μL，模版DNA 30 ng，加ddH₂O至15μL；

SSR反应条件为DNA 95℃预变性3min后，94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min；

在PCR扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染后照相记录结果;

选择在亲本间和F2代群体的抗、感池间扩增出相同有多态型的引物，与抗病基因Pm1连锁的候选分子标记共8对；

（三）紧密连锁分子标记的获得

（7）根据连锁交换规律，利用8个候选分子标记在纯合感病单株间的基因型资料与单株的抗性资料，构建分子标记与Pm1基因的连锁图谱，所用软件为Mapmaker/EXP 3.0，获得了与抗病基因Pm1紧密连锁的分子标记Pm-136，遗传连锁距离为1.7 cm（图1）；

（四）抗病基因Pm1向感病西葫芦自交系的转移

（8）利用获得的与抗病基因Pm1紧密连锁的分子标记Pm-136，通过杂交与回交转育将抗病基因导入西葫芦优良感病自交系中（图2）。利用上述策略，成功改良西葫芦优良感病自交系BS15，使其携带Pm1抗病基因具备了白粉病抗性。

西葫芦种质资源中蕴含丰富的基因资源，高效充分的利用这些基因资源对于西葫芦新品种培育具有重要作用。本发明通过将抗病种质BS9与感病自交系BS15杂交，经遗传分析确定抗病材料中携带有一个显性的抗病基因，通过构建抗病性状分离群体，经多态性分子标记筛选，构建了抗病基因Pm1与分子标记Pm-136的遗传连锁图谱。利用分子标记辅助选择，经杂交及回交转育，成功将抗病基因Pm1转育到西葫芦优良感病自交系BS15中，使其获得了白粉病抗性。在传统育种方法中，由于缺乏与白粉病抗病基因连锁的分子标记，每代的抗病基因转移均需要进行抗性接种鉴定，耗时耗力，且常常由于鉴定准确性差的问题导致选育失败。因此，分子标记Pm-136的开发可以在苗期简便准确的筛选含有抗病基因Pm1的单株，大大节省抗病材料的筛选时间和育种劳动量，提高选择的准确性，加快了抗白粉病新品种的培育速度。

Claims (8)

1.一种SSR分子标记在对西葫芦种质资源白粉病抗病基因的鉴定和转移中的应用，所述的分子标记为Pm-136，其具有如序列表SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的DNA序列，该标记与抗病基因Pm1的遗传连锁距离为1.7 cm，所述分子标记的长度为131 bp。

2.一种如权利要求1中所述的SSR分子标记的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：

应用SSR-BSA技术：以西葫芦自交系BS15和BS9分别作为感病和抗病亲本配制F₂代分离群体，用SSR引物筛选与西葫芦白粉病显性抗病基因Pm1连锁的分子标记，得到共显性分子标记Pm-136，该标记与抗病基因Pm1的遗传连锁距离为1.7 cm。

3.一种检测西葫芦白粉病抗病基因Pm1的方法，其特征在于，

用以下的一对分子标记引物PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物：

分子标记Pm-136：

左端引物序列如SEQ ID NO. 1所示，

右端引物序列如SEQ ID NO. 2所示，

用引物对SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2能够扩增出131 bp的扩增片段，则标志着待检测西葫芦存在白粉病显性抗病基因Pm1。

4.根据权利要求3所述的检测西葫芦白粉病抗病基因Pm1的方法，其特征在于，扩增反应体积为15μL，其中10×buffer 1.5μL，2.5 mM dNTPs 0.3μL，Tag酶0.2μL，10μM引物各0.3μL，模版DNA 30 ng，加ddH₂O至15μL。

5.根据权利要求3所述的检测西葫芦白粉病抗病基因Pm1的方法，其特征在于，扩增反应的条件为DNA 95℃预变性3min后，94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。

6.一种筛选存在抗白粉病抗病基因Pm1的西葫芦的方法，其特征在于，用权利要求3中所述的引物对扩增待检西葫芦基因组DNA，用所述的引物对能够扩增出131 bp的扩增片段，则标志该待检西葫芦为存在Pm1抗病基因的抗白粉病西葫芦。

7.根据权利要求6所述的筛选存在抗白粉病抗病基因Pm1的西葫芦的方法，其特征在于，扩增反应体积为15μL，其中10×buffer 1.5μL，2.5 mM dNTPs 0.3μL，Tag酶0.2μL，10 μM引物各0.3μL，模版DNA 30 ng，加ddH₂O至15μL。

8.根据权利要求6所述的筛选存在抗白粉病抗病基因Pm1的西葫芦的方法，其特征在于，扩增反应的条件为DNA 95℃预变性3min后，94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。