CN106609298B - 鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂与印度南瓜蔓长分子标记 - Google Patents

鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂与印度南瓜蔓长分子标记 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂与印度南瓜蔓长分子标记。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂，由引物对A1和A2组成；A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，P1为与SEQ ID No.1的第93位上游特异结合的单链DNA，P2为与SEQ ID No.1的第1341位下游特异结合的单链DNA；A2由名称为P3的单链DNA和P2组成，P3为与SEQ ID No.1的第93‑1341位间特异结合的单链DNA。实验证明，可以利用本发明的鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂通过鉴定印度南瓜的RR、RS和SS基因型来鉴定印度南瓜是长蔓印度南瓜或短蔓印度南瓜。

Description

鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂与印度南瓜蔓 长分子标记
技术领域
本发明涉及生物技术领域中鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂与印度南瓜蔓长分子标记。
背景技术
印度南瓜是世界范围内普遍栽培的重要葫芦科蔬菜，在我国的种植面积近年来逐渐增加，印度南瓜既可菜用又可籽用，还是黄瓜、西瓜等嫁接用砧木的重要来源。印度南瓜的生产对提高种植农户收入，调整农业产业结构具有非常重要的意义。
矮生是提高农作物产量的重要性状。短蔓印度南瓜可以增加种植密度，提早开花座果，增加产量，节约劳动力，适宜集中采收，是印度南瓜育种的重要选择性状之一。
但是，利用传统育种方法选育短蔓优良印度南瓜品种的效率较低，表型性状的选择易受育种材料遗传背景及环境条件的干扰。基因标记或者紧密连锁的分子标记可以加速优良品种的选育进程，提高选择的准确性，拓宽目标基因的应用范围，是分子标记辅助选择育种的必要条件。但目前国内外对印度南瓜短蔓性状的研究多限于遗传规律的探讨(Denna等，1963)。最近Wang等(2014)利用AFLP技术获得了与印度南瓜短蔓基因连锁的分子标记，但由于标记与短蔓基因连锁不够紧密，且AFLP标记难以直接实际应用于基因型筛查等原因，很难在实际育种中应用。因此，开发与短蔓性状紧密连锁的分子标记，对于提高印度南瓜短蔓性状育种效率，拓展短蔓基因应用范围，促进印度南瓜产业的健康发展具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定印度南瓜的蔓长性状。根据印度南瓜的蔓长性状将印度南瓜分为三类，短蔓印度南瓜、非短蔓印度南瓜和半短蔓印度南瓜，所述短蔓印度南瓜是指1-25节时(或定植60天(2-3片真叶时定植))主蔓长小于等于100cm的南瓜，所述非短蔓印度南瓜是指1-25节时(或定植60天(2-3片真叶时定植))主蔓长大于200cm的南瓜，所述半短蔓印度南瓜是指1-25节时(或定植60天(2-3片真叶时定植))主蔓长大于100cm小于等于200cm的南瓜。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂，由名称为分别为A1和A2的引物对组成；
所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.1的第93位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第1341位下游特异结合的单链DNA；所述A2由名称为P3的单链DNA和所述P2组成，所述P3为与SEQ ID No.1的第93-1341位间特异结合的单链DNA。
上述成套试剂中，所述P1可为SEQ ID No.1的第1-25位所示的单链DNA，所述P2可为与SEQ ID No.1的第1429-1452位反向互补的单链DNA，所述P3可为SEQ ID No.1的第307-328位所示的单链DNA。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的引物对。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的引物对，为所述A1或所述A2。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的系统，由P1和P2组成；所述P1为所述成套试剂、所述A1或所述A2，所述P2为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。
上述系统中，所述进行PCR扩增所需的试剂可含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTPs、Taq DNA聚合酶和/或PCR反应缓冲液，也可仅为所述dNTP混合物、所述Taq DNA聚合酶和/或所述PCR反应缓冲液；所述进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。所述dNTPs具体可为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。所述Taq DNA聚合酶具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为R001Q。所述10×buffer具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为9151A。所述PCR仪具体可为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。
上述系统中，所述成套试剂、所述A1和所述A2以及所述进行PCR扩增所需的试剂均可独立包装。所述成套试剂、所述A1和所述A2中的各引物对和/或各引物对的两条单链DNA均可独立包装。进行PCR扩增所需的各试剂均可独立包装。
上述鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的系统也可为仅含有所述成套试剂和所述进行PCR扩增所需的试剂的试剂或试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂的制备方法。
本发明所提供的所述成套试剂的制备方法，包括将各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述引物对的制备方法。
本发明所提供的所述引物对的制备方法，包括将所述A1或所述A2的所述两条单链DNA分别单独包装。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定印度南瓜基因型的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定印度南瓜基因型的方法，所述基因型为RR基因型、RS基因型和SS基因型，所述方法为如下Ⅰ或Ⅱ：
Ⅰ、包括如下K1)和K2)：
K1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述成套试剂进行PCR扩增得到PCR产物；
K2)检测步骤K1)得到的PCR产物，根据所述PCR产物确定印度南瓜基因型：
所述PCR产物为两条均含有SEQ ID No.1的第93-1341位的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为RR基因型；所述PCR产物为两条DNA片段，一条不含有SEQ ID No.1的第93-1341位所示的DNA片段，另一条含有SEQ ID No.1的第93-1341位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为RS基因型；所述PCR产物为一条不含SEQ ID No.1的第93-1341位的DNA片段的所述待印度测南瓜的基因型为SS基因型；
Ⅱ、包括如下L1)和L2)：
L1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述成套试剂进行PCR扩增得到PCR产物；
L2)下述L21)或L22)：
L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物的大小确定印度南瓜基因型：
所述PCR产物为1452bp和1146bp的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为RR基因型；所述PCR产物为203bp和1146bp的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为RS基因型；所述PCR产物为203bp的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为SS基因型；
L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物的大小确定印度南瓜基因型：
所述PCR产物为SEQ ID No.1所示的DNA片段和SEQ ID No.1的第307-1452位所示的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为RR基因型；如果所述PCR产物为SEQ ID No.2所示的DNA片段和SEQ ID No.1的第307-1452位所示的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为RS基因型；如果所述PCR产物为SEQ ID No.2所示的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为SS基因型。
其中，所述RR基因型印度南瓜的蔓长分别长于所述RS基因型印度南瓜和所述SS基因型印度南瓜的蔓长，所述RS基因型印度南瓜的蔓长长于所述SS基因型印度南瓜的蔓长。
上述鉴定或辅助鉴定印度南瓜基因型的方法中，利用所述成套试剂进行PCR扩增时，可采用一个PCR反应体系进行，也可采用两个PCR反应体系进行。采用一个PCR反应体系进行PCR扩增时，该反应体系含有所述A1和所述A2，将该体系命名为A1+A2体系。采用两个PCR反应体系进行PCR扩增时，一个PCR反应体系中仅含有所述A1，将该体系命名为A1体系；另一个PCR反应体系中仅含有所述A2，将该体系命名为A2体系。
上述鉴定或辅助鉴定印度南瓜基因型的方法中，每15μL的A1+A2体系可含有：10×buffer 1.5微升，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs 0.3微升，Taq DNA聚合酶0.2微升，所述P1，所述P2，所述P3，待测印度南瓜基因组DNA 30ng，以无菌的超纯水补足15微升，使所述P1和所述P3的终浓度均为0.2μM，使所述P2的终浓度均为0.4μM。所述A1+A2体系进行PCR扩增的反应条件可为：95℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，循环36次；72℃延伸10min。
每15μL的A1体系可含有：10×buffer 1.5微升，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs 0.3微升，Taq DNA聚合酶0.2微升，P1，P2，待测印度南瓜基因组DNA 30ng，以无菌的超纯水补足15微升，使所述P1和所述P2的终浓度均为0.2μM。所述A1体系进行PCR扩增的反应条件可为：95℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，循环36次；72℃延伸10min。
每15μL的A2体系可含有：10×buffer 1.5微升，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs 0.3微升，Taq DNA聚合酶0.2微升，P2，P3，待测印度南瓜基因组DNA 30ng，以无菌的超纯水补足15微升，使所述P2和所述P3的终浓度均为0.2μM。所述A2体系进行PCR扩增的反应条件可为：95℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，循环36次；72℃延伸10min。
上述鉴定或辅助鉴定印度南瓜基因型的方法中，所述dNTPs具体可为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。所述Taq DNA聚合酶具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为R001Q。所述10×buffer具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为9151A。所述PCR仪具体可为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的方法，为如下1)、2)、3)、4)或5)：
1)包括如下M1)和M2)：
M1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述成套试剂进行PCR扩增得到PCR产物；
M2)检测步骤M1)得到的PCR产物，如果所述PCR产物为两条均含有SEQ ID No.1的第93-1341位的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为非短蔓印度南瓜(即RR基因型印度南瓜)；如果所述PCR产物为两条DNA片段，一条不含有SEQ ID No.1的第93-1341位所示的DNA片段，另一条含有SEQ ID No.1的第93-1341位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓印度南瓜(即RS基因型印度南瓜)；如果所述PCR产物为一条不含SEQ ID No.1的第93-1341位的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为短蔓印度南瓜(即SS基因型印度南瓜)；
2)包括如下N1)和N2)：
N1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述成套试剂进行PCR扩增得到PCR产物；
N2)如下N21)或N22)：
N21)检测步骤N1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物为1452bp和1146bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为非短蔓印度南瓜(即RR基因型印度南瓜)；如果所述PCR产物为203bp和1146bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓印度南瓜(即RS基因型印度南瓜)；如果所述PCR产物为203bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为短蔓印度南瓜(即SS基因型印度南瓜)；
N22)检测步骤N1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物为SEQ ID No.1所示的DNA片段和SEQ ID No.1的第307-1452位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为非短蔓印度南瓜(即RR基因型印度南瓜)；如果所述PCR产物为SEQ ID No.2所示的DNA片段和SEQ ID No.1的第307-1452位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓印度南瓜(即RS基因型印度南瓜)；如果所述PCR产物为SEQ ID No.2所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为短蔓印度南瓜(即SS基因型印度南瓜)；
3)包括如下O1)和O2)：
O1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
O2)检测步骤O1)得到的PCR产物，如果所述PCR产物为一条含有SEQ ID No.1的第93-1341位的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为非短蔓印度南瓜(即RR基因型印度南瓜)；如果所述PCR产物为一条不含SEQ ID No.1的第93-1341位的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓或短蔓印度南瓜(即RS或SS基因型印度南瓜)；
4)包括如下P1)和P2)：
P1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
P2)如下P21)或P22)：
P21)检测步骤P1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物为1452bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为非短蔓印度南瓜(即RR基因型印度南瓜)；如果所述PCR产物为203bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓或短蔓印度南瓜(即RS或SS基因型印度南瓜)；
P22)检测步骤P1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物为SEQ ID No.1所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为非短蔓印度南瓜(即RR基因型印度南瓜)；如果所述PCR产物为SEQ ID No.2所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓或短蔓印度南瓜(即RS或SS基因型印度南瓜)；
5)包括如下Q1)和Q2)：
Q1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述A2进行PCR扩增得到PCR产物；
Q2)检测步骤Q1)得到的PCR产物，如果所述PCR产物无DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓或短蔓印度南瓜(即SS基因型印度南瓜)。
上述鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的方法中，1)和2)的方法中进行PCR扩增时，均可采用所述A1+A2体系以及相应的反应条件，也均可采用所述A1体系和所述A2体系以及对应的反应条件。3)和4)的方法中进行PCR扩增时，可采用所述A1体系以及相应的反应条件。5)的方法中进行PCR扩增时，可采用所述A2体系以及相应的反应条件。
为解决上述技术问题，本发明还提供了印度南瓜蔓长分子标记。
本发明所提供的印度南瓜蔓长分子标记，为以印度南瓜的基因组DNA为模板，采用所述A1进行扩增得到的DNA分子。
上述印度南瓜蔓长分子标记的多态性可为所述印度南瓜蔓长分子标记对应于SEQID No.1的第93-1341位为SEQ ID No.1的第93-1341位或缺失SEQ ID No.1的第93-1341位。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述H1-H10中任一应用：
H1、所述成套试剂、所述引物对或所述系统在制备鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的试剂或试剂盒中的应用；
H2、所述成套试剂、所述引物对或所述系统在鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状中的应用；
H3、所述成套试剂、所述引物对或所述系统在鉴定或辅助鉴定蔓长性状稳定遗传印度南瓜中的应用；
H4、所述成套试剂、所述引物对或所述系统在印度南瓜育种中的应用；
H5、所述鉴定印度南瓜基因型的方法或所述鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的方法在鉴定或辅助鉴定蔓长性状稳定遗传印度南瓜中的应用；
H6、所述鉴定印度南瓜基因型的方法或所述鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的方法在印度南瓜育种中的应用；
H7、所述鉴定印度南瓜基因型的方法在鉴定印度南瓜蔓长性状中的应用；
H8、所述印度南瓜蔓长分子标记在鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状中的应用；
H9、所述印度南瓜蔓长分子标记在鉴定或辅助鉴定蔓长性状稳定遗传印度南瓜中的应用；
H10、所述印度南瓜蔓长分子标记在印度南瓜育种中的应用。
上述应用中，所述印度南瓜育种具体可为选育短蔓印度南瓜。
上述应用中，所述RR基因型印度南瓜的长蔓性状和SS基因型印度南瓜的短蔓性状均可稳定遗传。所述鉴定或辅助鉴定蔓长性状稳定遗传印度南瓜具体可按照所述鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的方法进行鉴定。
上述应用中，所述RR基因型印度南瓜的蔓长分别长于所述RS基因型印度南瓜和所述SS基因型印度南瓜的蔓长，所述RS基因型印度南瓜的蔓长长于所述SS基因型印度南瓜的蔓长。
为解决上述技术问题，本发明还提供了印度南瓜育种方法。
本发明所提供的印度南瓜育种方法，按照所述鉴定印度南瓜基因型的方法鉴定印度南瓜的基因型，选择SS或RS基因型的印度南瓜作为亲本进行育种。
本发明中，所述成套试剂中的摩尔数可为1:1。所述A1的两条单链DNA的的摩尔数可为1:1。所述A2的两条单链DNA的的摩尔数可为1:1。
本发明中，所述蔓长具体可为主蔓长。
本发明中，在检测PCR产物的大小时，可通过电泳检测，1452bp的DNA片段可表现为在1000bp和1500bp间有一条带，1146bp的DNA片段可表现为在1000bp和1500bp间有一条带，203bp的DNA片段可表现为在200bp和300bp间有一条带。
实验证明，利用本发明的鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂定义的三种印度南瓜——RR、RS和SS基因型印度南瓜与印度南瓜的蔓长具有相关性：在相同的生长环境中，RR基因型印度南瓜的蔓长均极显著长于RS和SS基因型印度南瓜的蔓长，可以利用本发明的鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂通过鉴定印度南瓜的RR、RS和SS基因型来鉴定印度南瓜是非短印度蔓南瓜、半短蔓印度南瓜或短蔓印度南瓜。
在印度南瓜育种中，可以利用本发明的鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂选择目的蔓长性状，还可以选择目的蔓长性转稳定遗传的植株，从而应用于印度南瓜的分子标记辅助育种，为印度南瓜蔓长性状的改良提供有力的技术支持，进而实现对蔓长性状的快速准确改良。
印度南瓜种质资源中蕴含丰富的基因资源，高效充分的利用这些基因资源对于印度南瓜育种具有重要作用。本发明利用印度南瓜蔓长分子标记辅助选择，经杂交及回交转育，成功使印度南瓜优良自交系Rimu获得了短蔓性状。在传统育种方法中，由于缺乏与短蔓性状连锁的分子标记，短蔓性状育种每代均需要鉴定，费时费力、易受环境影响，本发明的印度南瓜蔓长分子标记可以简便准确的筛选短蔓单株及短蔓性状稳定遗传的单株，大大节省目标育种材料的筛选时间和劳动量，提高选择的准确性、提高新品种的培育速度和科技含量。
附图说明
图1为鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂对各印度南瓜的鉴定结果。M表示分子量标准，P1表示长蔓自交系Rimu，P2表示短蔓自交系SQ026，F1表示长蔓自交系Rimu与短蔓自交系SQ026杂交一代，1表示短蔓红栗，3表示早熟京绿栗，4表示新短蔓京绿栗，5表示黑丰，6表示黄金二号，7表示黑晶，9表示南瓜7号，10表示黑贝贝，11表示正大33，13表示金蜜宝，15表示红星，17表示红秀，2、8、12、14、16、18、19、20和21均表示长蔓自交系Rimu与短蔓自交系SQ026杂交一代(F1)的自交后代(F2)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的长蔓自交系Rimu和短蔓自交系SQ026公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的dNTPs为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。TaqDNA聚合酶为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为R001Q。10×buffer为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为9151A。PCR仪为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。
下述实施例中各印度南瓜的生长环境相同，均为在北京市农林科学院蔬菜研究中心延庆农场种植，5月10号在印度南瓜秧苗2-3片真叶时定植于露地，单蔓整枝，常规管理。
实施例1、鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂可以鉴定印度南瓜蔓长
鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂由名称为分别为A1和A2的引物对组成；A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，P1为SEQ ID No.1的第1-25位所示的单链DNA，P2为与SEQ ID No.1的第1429-1452位反向互补的单链DNA；A2由名称为P3的单链DNA和P2组成，P3为SEQ ID No.1的第307-328位所示的单链DNA。
1、待鉴定印度南瓜如下，每种印度南瓜均选择50株进行试验：
P1：长蔓自交系Rimu，其表型为长蔓，定植60天时的1-25节蔓长为252cm。
P2：短蔓自交系SQ026，其表型为短蔓，定植60天时的1-25节蔓长为75cm。
F1：长蔓自交系Rimu与短蔓自交系SQ026杂交一代，其表型为半短蔓，定植60天时的1-25节蔓长为154cm。长蔓自交系Rimu与短蔓自交系SQ026杂交一代是将长蔓自交系Rimu与短蔓自交系SQ026进行杂交得到的杂交一代。
F2：长蔓自交系Rimu与短蔓自交系SQ026杂交二代(即F1的自交一代)。
早熟京绿栗，为北京京研益农科技发展中心产品。
新短蔓京绿栗，为北京京研益农科技发展中心产品。
短蔓红栗，为北京京域威尔农业科技有限公司产品。
黑丰，为安徽江淮园艺科技有限公司产品。
黄金二号，为安徽江淮园艺科技有限公司产品。
黑晶，为安徽荃银高科产品。
黑贝贝，为北京君川种业科技有限公司产品。
南瓜7号，为北京世农种苗有限公司产品。
正大33,为东方正大产品。
金蜜宝，为酒泉夏禾种业产品。
红秀，为新疆昌吉市艾格瑞特种业有限公司产品。
红星，为上海惠和种业有限公司产品。
2、印度南瓜蔓长的鉴定
用CTAB法(Sue Porebski L.,1997)提取上述各印度南瓜幼嫩叶片的基因组DNA，分别利用引物对A1和A2进行PCR扩增。
利用引物对A1进行PCR扩增的15μL反应体系为：10×buffer 1.5微升，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs 0.3微升，Taq DNA聚合酶0.2微升，P1，P2，印度南瓜基因组DNA 30ng，以无菌的超纯水补足15微升，使P1和P2的终浓度均为0.2μM。在PCR仪中进行PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，循环36次；72℃延伸10min。将反应产物一部分进行测序，一部分在1.0％的琼脂糖凝胶上100V电泳35min，经GoldView核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。
利用引物对A2进行PCR扩增的15μL反应体系为：10×buffer 1.5微升，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs 0.3微升，Taq DNA聚合酶0.2微升，P2，P3，印度南瓜基因组DNA 30ng，以无菌的超纯水补足15微升，使P3和P2的终浓度均为0.2μM。在PCR仪中进行PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，循环36次；72℃延伸10min。将反应产物一部分进行测序，一部分在1.0％的琼脂糖凝胶上100V电泳35min，经GoldView核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。
在以不同印度南瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增时，A1可扩增出两种大小的PCR产物，即1452bp的PCR产物(SEQ ID No.1所示的DNA片段)和203bp的PCR产物(SEQ ID No.2所示的DNA片段)，A2可扩增出1146bp的PCR产物(SEQ ID No.1的第307-1452位所示的DNA片段)，也可能得不到PCR产物，根据A1与A2的扩增产物大小及有无定义印度南瓜的基因型，如表1所示，其中RR基因型表示印度南瓜的两条同源染色体对应于SEQ ID No.1均为SEQ IDNo.1，RS基因型表示印度南瓜的一条同源染色体对应于SEQ ID No.1为SEQ ID No.1，另一条同源染色体对应于SEQ ID No.1为SEQ ID No.2，SS基因型表示印度南瓜的两条同源染色体对应于SEQ ID No.1均为SEQ ID No.2。其中，RR基因型和SS基因型均可稳定遗传。
将以印度南瓜的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行PCR扩增得到的DNA分子命名为印度南瓜蔓长分子标记，印度南瓜蔓长分子标记的多态性为印度南瓜基因组中对应于SEQ ID No.1为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2。
表1、PCR产物与基因型
以上各印度南瓜的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，将PCR产物进行测序，结果如表2所示，表2中1452bp的PCR产物表示SEQ ID No.1所示的DNA片段，1146bp的PCR产物表示SEQ ID No.1的第307-1452位所示的DNA片段，203bp的PCR产物表示SEQ ID No.2所示的DNA片段。在印度南瓜定植60天时测量1-25节的蔓长作为待测印度南瓜的蔓长，印度南瓜基因型与表型的关系如表2所示。
表2、印度南瓜基因型与表型的关系
编号 A1 PCR产物 A2 PCR产物 基因型 蔓长(cm) 表型
P1 1452bp 1146bp RR 252±7.8 长蔓
P2 203bp 无 SS 75±4.6 短蔓
F1 203bp 1146bp RS 147±9.1 半短蔓
1 203bp 无 SS 78±6.7 短蔓
2 203bp 无 SS 72±5.0 短蔓
3 1452bp 1146bp RR 269±11.4 长蔓
4 203bp 1146bp RS 163±8.6 半短蔓
5 203bp 1146bp RS 150±7.9 半短蔓
6 1452bp 1146bp RR 271±10.3 长蔓
7 203bp 1146bp RS 143±6.0 半短蔓
8 203bp 无 SS 81±3.9 短蔓
9 203bp 1146bp RS 164±7.2 半短蔓
10 1452bp 1146bp RR 280±11.2 长蔓
11 1452bp 1146bp RR 271±9.6 长蔓
12 203bp 无 SS 84±5.7 短蔓
13 203bp 1146bp RS 138±8.1 半短蔓
14 203bp 无 SS 71±5.1 短蔓
15 1452bp 1146bp RR 264±10.9 长蔓
16 1452bp 1146bp RR 278±13.2 长蔓
17 203bp 1146bp RS 170±9.5 半短蔓
18 203bp 1146bp RS 144±5.7 半短蔓
19 1452bp 1146bp RR 259±8.6 长蔓
20 203bp 无 SS 78±6.3 短蔓
21 203bp 1146bp RS 146±6.4 半短蔓
注：表2中，1表示短蔓红栗，3表示早熟京绿栗，4表示新短蔓京绿栗，5表示黑丰，6表示黄金二号，7表示黑晶，9表示南瓜7号，10表示黑贝贝，11表示正大33，13表示金蜜宝，15表示红星，17表示红秀，2、8、12、14、16、18、19、20和21均表示F2单株。
结果显示，在相同的生长环境下，RR基因型的印度南瓜的蔓长均超过250cm，RS基因型的印度南瓜的蔓长均在100-200cm间，SS基因型的印度南瓜的蔓长均小于100cm，RR基因型的印度南瓜的蔓长均极显著长于RS和SS基因型的印度南瓜的蔓长，RS基因型的印度南瓜的蔓长介于RR基因型与SS基因型印度南瓜之间，表明，可以利用鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂通过鉴定印度南瓜的RR、RS和SS基因型来鉴定印度南瓜是长蔓或短蔓。
实施例2、鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂在培育短蔓印度南瓜中的应用
本实施例利用回交转育的方法，选用短蔓自交系SQ026作为非轮回亲本(短蔓性状供体)，长蔓自交系Rimu为轮回亲本，定向改良长蔓优良自交系Rimu的蔓长性状，具体操作步骤如下：
将短蔓自交系SQ026与长蔓自交系Rimu杂交，得到杂交一代F1，将杂交一代F1与长蔓自交系Rimu进行回交得到回交一代BC1F1，利用本发明的鉴定印度南瓜基因型的成套试剂从回交一代BC1F1中选择RS基因型的印度南瓜与长蔓自交系Rimu进行回交得到回交二代BC2F1，利用本发明的鉴定印度南瓜基因型的成套试剂从回交二代BC2F1中选择RS基因型的印度南瓜与长蔓自交系Rimu进行回交得到回交三代BC3F1，利用本发明的鉴定印度南瓜基因型的成套试剂从回交三代BC3F1中选择RS基因型的印度南瓜与长蔓自交系Rimu进行回交得到回交四代BC4F1，利用本发明的鉴定印度南瓜基因型的成套试剂从回交四代BC4F1中选择RS基因型的印度南瓜进行自交得到BC4F2，利用本发明的鉴定印度南瓜基因型的成套试剂从BC4F2中选择SS基因型的印度南瓜，将其命名为改良后的自交系。改良后的自交系在定植60天时的1-25节的蔓长为86±6.2cm(短蔓自交系SQ026定植60天时的1-25节的蔓长为75±4.6cm，长蔓自交系Rimu定植60天时的1-25节的蔓长为252±7.8cm)，表明改良后的自交系具有短蔓性状，并且其他农艺性状与长蔓自交系Rimu基本一致。说明利用本发明的印度南瓜蔓长分子标记，能够对蔓长基因的基因型进行选择，进而实现对蔓长性状的快速准确改良。
在印度南瓜育种中，可以利用本发明的鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套试剂选择目的蔓长性状，从而应用于印度南瓜的分子标记辅助育种，为印度南瓜蔓长性状的改良提供有力的技术支持，进而实现对蔓长性状的快速准确改良。

Claims (9)

1.鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的成套引物组，由名称分别为A1和A2的引物对组成；
所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.1的第93位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第1341位下游特异结合的单链DNA；所述A2由名称为P3的单链DNA和所述P2组成，所述P3为与SEQ ID No.1的第93-1341位间特异结合的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的成套引物组，其特征在于：所述P1为SEQ ID No.1的第1-25位所示的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第1429-1452位反向互补的单链DNA，所述P3为SEQ ID No.1的第307-328位所示的单链DNA。
3.鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的引物对，为权利要求1或2所述A1或所述A2。
4.鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的系统，由X1和X2组成；所述X1为权利要求1或2所述成套引物组、所述A1或所述A2，所述X2为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。
5.鉴定或辅助鉴定印度南瓜基因型的方法，所述基因型为RR基因型、RS基因型和SS基因型，所述方法为如下Ⅰ或Ⅱ：
Ⅰ、包括如下K1）和K2）：
K1）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述成套引物组进行PCR扩增得到PCR产物；
K2）检测步骤K1）得到的PCR产物，根据所述PCR产物确定印度南瓜基因型：
所述PCR产物的两条DNA片段均含有SEQ ID No.1的第93-1341位的所示的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为RR基因型；所述PCR产物的两条DNA片段，仅有一条含有SEQ IDNo.1的第93-1341位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为RS基因型；所述PCR产物的两条DNA片段，均不含SEQ ID No.1的第93-1341位的DNA，所述待测印度南瓜的基因型为SS基因型；
Ⅱ、包括如下L1）和L2）：
L1）采用权利要求2所述成套引物组进行PCR扩增得到PCR产物，所述PCR产物为1452bp和1146bp的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为RR基因型；采用权利要求2所述成套引物组进行PCR扩增得到PCR产物，所述PCR产物为203bp和1146bp的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为RS基因型；采用权利要求2所述A1扩增时，所述PCR产物为203bp的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为SS基因型；
L2）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求2所述成套引物组进行PCR扩增得到PCR产物； 所述PCR产物为SEQ ID No.1所示的DNA片段和SEQ ID No.1的第307-1452位所示的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为RR基因型；如果所述PCR产物为SEQ ID No.2所示的DNA片段和SEQ ID No.1的第307-1452位所示的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为RS基因型；如果所述PCR产物为SEQ ID No.2所示的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为SS基因型。
6.鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的方法，为如下1）、2）、3）、4）、5）或6）：
1）包括如下M1）和M2）：
M1）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求2所述成套引物组进行PCR扩增得到PCR产物；
M2）检测步骤M1）得到的PCR产物，如果所述PCR产物为两条均含有SEQ ID No.1的第93-1341位的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为非短蔓印度南瓜；如果所述PCR产物为一条仅含有SEQ ID No.1的第93-1341位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓印度南瓜；如果所述PCR产物为两条均不含SEQ ID No.1的第93-1341位的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为短蔓印度南瓜；
2）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求2所述成套引物组进行PCR扩增得到PCR产物，如果所述PCR产物为1452bp和1146bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为非短蔓印度南瓜；采用权利要求2所述成套引物组进行PCR扩增得到PCR产物，如果所述PCR产物为203bp和1146bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓印度南瓜；采用权利要求2所述A1扩增时，如果所述PCR产物为203bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为短蔓印度南瓜；
3）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求2所述成套引物组进行PCR扩增得到PCR产物，如果所述PCR产物为SEQ ID No.1所示的DNA片段和SEQ ID No.1的第307-1452位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为非短蔓印度南瓜；如果所述PCR产物为SEQID No.2所示的DNA片段和SEQ ID No.1的第307-1452位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓印度南瓜；如果所述PCR产物为SEQ ID No.2所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为短蔓印度南瓜；
4）包括如下O1）和O2）：
O1）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求 2所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
O2）检测步骤O1）得到的PCR产物，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.1的第93-1341位的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为非短蔓印度南瓜；如果所述PCR产物不含SEQ IDNo.1的第93-1341位的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓或短蔓印度南瓜；
5）包括如下P1）和P2）：
P1）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求2所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
P2）如下P21）或P22）：
P21）检测步骤P1）得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物为1452bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为非短蔓印度南瓜；如果所述PCR产物为203bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓或短蔓印度南瓜；
P22）检测步骤P1）得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物为SEQ ID No.1所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为非短蔓印度南瓜；如果所述PCR产物为SEQ ID No.2所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓或短蔓印度南瓜；
6）包括如下Q1）和Q2）：
Q1）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求2所述A2进行PCR扩增得到PCR产物；
Q2）检测步骤Q1）得到的PCR产物，如果所述PCR产物无DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为半短蔓或短蔓印度南瓜。
7.印度南瓜蔓长分子标记，为以印度南瓜的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述A1进行扩增得到的DNA分子。
8.下述H1-H10中任一应用：
H1、权利要求1或2所述成套引物组、权利要求3所述引物对或权利要求4所述系统在制备鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状的试剂或试剂盒中的应用；
H2、权利要求1或2所述成套引物组、权利要求3所述引物对或权利要求4所述系统在鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状中的应用；
H3、权利要求1或2所述成套引物组、权利要求3所述引物对或权利要求4所述系统在鉴定或辅助鉴定蔓长性状稳定遗传印度南瓜中的应用；
H4、权利要求1或2所述成套引物组、权利要求3所述引物对或权利要求4所述系统在印度南瓜育种中的应用；
H5、权利要求5或6所述方法在鉴定或辅助鉴定蔓长性状稳定遗传印度南瓜中的应用；
H6、权利要求5或6所述方法在印度南瓜育种中的应用；
H7、权利要求5所述鉴定印度南瓜基因型的方法在鉴定印度南瓜蔓长性状中的应用；
H8、权利要求7所述印度南瓜蔓长分子标记在鉴定或辅助鉴定印度南瓜蔓长性状中的应用；
H9、权利要求7所述印度南瓜蔓长分子标记在鉴定或辅助鉴定蔓长性状稳定遗传印度南瓜中的应用；
H10、权利要求7所述印度南瓜蔓长分子标记在印度南瓜育种中的应用。
9.印度南瓜育种方法，按照权利要求5所述的方法鉴定印度南瓜的基因型，选择RR或RS基因型的印度南瓜作为亲本进行育种。
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