CN108085404B - 印度南瓜强雌性状分子标记与鉴定印度南瓜强雌性状的引物对 - Google Patents

印度南瓜强雌性状分子标记与鉴定印度南瓜强雌性状的引物对 Download PDF

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Abstract

本发明公开了印度南瓜强雌性状分子标记与鉴定印度南瓜强雌性状的引物对。本发明所提供的印度南瓜强雌性状分子标记，为以印度南瓜的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.3的第204位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.3的第219位下游特异结合的单链DNA。实验证明，可以利用鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的引物对A1和印度南瓜强雌性状分子标记鉴定印度南瓜的强雌性状情况。

Description

印度南瓜强雌性状分子标记与鉴定印度南瓜强雌性状的引 物对
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及印度南瓜强雌性状分子标记与鉴定印度南瓜强雌性状的引物对。
背景技术
我国是印度南瓜的主要栽培国，栽培面积及产量均居世界前列，特别是近年来我国印度南瓜设施栽培面积不断扩大，居民消费小型印度南瓜的市场逐渐培育形成并不断扩大，印度南瓜的种植已成为农民增收、农业结构调整的重要途径。
印度南瓜为典型的雌雄异花同株作物，植株上仅有雄花或雌花，间隔生长，没有两性花的存在，是典型的单性花植物。强雌性状是南瓜育种与生产的有利农艺性状，植株雌花出现早、数量多和分布均匀，是南瓜座果率提高、早熟、高产、稳产的基础。同时，印度南瓜杂种优势明显，在杂交种生产过程中必须人工将母本植株中的雄花去除，耗费大量的人力、物力，强雌性状的利用可以在生产杂交种中免去或减少母本去雄过程，简化南瓜制种程序，节约成本，提高杂交种纯度，是南瓜杂交种生产技术提高的重要措施。因此，对强雌性状快速利用，选育具有强雌性状的印度南瓜自交系用于新品种选育或生产具有广阔的应用前景及巨大经济价值。
目前，强雌印度南瓜育种材料非常稀少，同时传统育种方法存在强雌性状转育效率低，性状鉴别费时费力，育种周期长等问题。紧密连锁的分子标记可以拓宽这一有利性状的应用，加速育种进程、提高选择的准确性，是分子标记辅助选择育种的必要条件。而与印度南瓜强雌性状紧密连锁的分子标记国内外尚未见相关研究报道。因此，开发印度南瓜强雌性状紧密连锁的分子标记，对于提高印度南瓜育种效率，拓展强雌基因应用范围，提高印度南瓜的座果率及田间产量具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定印度南瓜的强雌性状。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了印度南瓜强雌性状连锁分子标记。
本发明所提供的印度南瓜强雌性状连锁分子标记，为以印度南瓜的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.3的第204位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.3的第219位下游特异结合的单链DNA。
上述印度南瓜分子标记的多态性可为印度南瓜基因组中对应于SEQ ID No.3第204-219位为SEQ ID No.3第204-219位或缺失SEQ ID No.3第204-219位。
上述印度南瓜分子标记中，
所述P1为SEQ ID No.1所示的单链DNA，其为SEQ ID No.3的第1-20位所示的单链DNA；
所述P2为SEQ ID No.2所示的单链DNA，其为与SEQ ID No.3的第246-265位反向互补的单链DNA。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定印度南瓜强雌性状基因型的方法。
本发明所提供的鉴定印度南瓜强雌性状基因型的方法，所述基因型为FF基因型、Ff基因型和ff基因型，所述方法为如下Ⅰ或Ⅱ：
Ⅰ、包括如下K1)和K2)：
K1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
K2)检测步骤K1)得到的PCR产物，根据所述PCR产物确定印度南瓜基因型：
所述PCR产物对应于SEQ ID No.3为一条含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为FF基因型；所述PCR产物含有一条不含有SEQ IDNo.3的第204-219位所示的DNA片段和一条含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为Ff基因型；所述PCR产物对应于SEQ ID No.3为一条不含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为ff基因型；
Ⅱ、包括如下L1)和L2)：
L1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
L2)下述L21)或L22)：
L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物的大小确定印度南瓜基因型：
所述PCR产物含有265bp和249bp的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为Ff基因型；所述PCR产物含有265bp的DNA片段且不含有249bp的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为FF基因型；所述PCR产物不含有265bp的DNA片段且含有249bp的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为ff基因型；
L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物确定印度南瓜基因型：
所述PCR产物含有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的DNA片段的所述待测印度南瓜的基因型为Ff基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.3所示的DNA片段且不含SEQ ID No.4所示的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为FF基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.4所示的DNA片段且不含SEQ ID No.3所示的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为ff基因型。
上述鉴定印度南瓜基因型的方法中，进行所述PCR扩增的体系可含有：10×buffer，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs，Taq DNA聚合酶，所述P1，所述P2，待测印度南瓜基因组DNA。所述体系中dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均可为0.05mM，SEQ IDNo.1和2所示单链DNA的终浓度均可为0.2μM，待测南瓜基因组DNA的浓度可为30ng/μL。
进行所述PCR扩增的反应条件可为：95℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，循环36次；72℃延伸10min。
上述鉴定印度南瓜基因型的方法中，所述dNTPs具体可为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。所述Taq DNA聚合酶具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为R001Q。所述10×buffer具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为9151A。
上述鉴定印度南瓜基因型的方法中，所述FF基因型印度南瓜和所述Ff基因型印度南瓜均表现为正常花型，雄花与雌花间隔生长；所述ff基因型印度南瓜表现为强雌性状，植株3-5节后只发育形成雌花。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的方法，为如下1)或2)：
1)包括如下M1)和M2)：
M1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
M2)检测步骤M1)得到的PCR产物，如果所述PCR产物含有一条不含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段和一条含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为正常花型印度南瓜；如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.3为一条含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为正常花型印度南瓜；如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.3为一条不含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为强雌性状印度南瓜；
2)包括如下N1)和N2)：
N1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
N2)如下N21)或N22)：
N21)检测步骤N1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有265bp和249bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为正常花型印度南瓜；如果所述PCR产物含有265bp的DNA片段且不含249bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为正常花型印度南瓜；如果所述PCR产物不含有265bp的DNA片段且含有249bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为强雌性状印度南瓜；
N22)检测步骤N1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为正常花型印度南瓜；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.3所示的DNA片段且不含SEQ ID No.4所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为正常花型印度南瓜；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.4所示的DNA片段且不含SEQ ID No.3所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为强雌性状印度南瓜。
上述鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的方法中进行所述PCR扩增的体系可为上述鉴定印度南瓜基因型的方法中进行所述PCR扩增的体系，进行所述PCR扩增的反应条件可为上述鉴定印度南瓜基因型的方法中进行所述PCR扩增的反应条件。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的引物对。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的引物对，为所述A1。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的系统，由X1和X2组成；所述X1为所述A1，所述X2为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。
上述系统中，所述进行PCR扩增所需的试剂可含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTPs、Taq DNA聚合酶和/或PCR反应缓冲液，也可仅为所述dNTP混合物、所述Taq DNA聚合酶和/或所述PCR反应缓冲液；所述进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。所述dNTPs具体可为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。所述Taq DNA聚合酶具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为R001Q。所述10×buffer具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为9151A。所述PCR仪具体可为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。
上述系统中，所述A1和所述进行PCR扩增所需的试剂均可独立包装。所述A1中的各引物对的两条单链DNA可独立包装。进行PCR扩增所需的各试剂均可独立包装。
上述鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的系统也可为仅含有所述A1和所述进行PCR扩增所需的试剂或试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述H1-H10中任一应用：
H1、所述印度南瓜强雌性状分子标记在鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状中的应用；
H2、所述印度南瓜强雌性状分子标记在鉴定或辅助鉴定强雌性状稳定遗传印度南瓜中的应用；
H3、所述印度南瓜强雌性状分子标记在印度南瓜育种中的应用；
H4、所述鉴定印度南瓜基因型的方法或鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的方法在鉴定或辅助鉴定强雌性状稳定遗传印度南瓜中的应用；
H5、所述鉴定印度南瓜基因型的方法或鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的方法在印度南瓜育种中的应用；
H6、所述鉴定印度南瓜基因型的方法在鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状中的应用；
H7、所述A1或所述系统在制备鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的试剂或试剂盒中的应用；
H8、所述A1或所述系统在鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状中的应用；
H9、所述A1或所述系统在鉴定或辅助鉴定强雌性状稳定遗传印度南瓜中的应用；
H10、所述A1或所述系统在印度南瓜育种中的应用。
上述应用中，所述FF基因型印度南瓜和所述Ff基因型印度南瓜均为正常花型，所述ff基因型印度南瓜均为强雌型。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定强雌性状稳定遗传印度南瓜的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定强雌性状稳定遗传印度南瓜的方法，为如下(3)或(4)：
(3)包括如下S1)和S2)：
S1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
S2)检测步骤M1)得到的PCR产物，如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.3为一条不含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为强雌性状稳定遗传印度南瓜；
(4)包括如下T1)和T2)：
T1)以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
T2)如下T21)或T22)：
T21)检测步骤T1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有249bp的DNA片段且不含有265bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为强雌性状稳定遗传印度南瓜；
T22)检测步骤T1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.4所示的DNA片段且不含SEQ ID No.3所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为强雌性状稳定遗传印度南瓜。
上述鉴定或辅助鉴定强雌性状稳定遗传印度南瓜的方法中进行所述PCR扩增的体系可为上述鉴定印度南瓜基因型的方法中进行所述PCR扩增的体系，进行所述PCR扩增的反应条件可为上述鉴定印度南瓜基因型的方法中进行所述PCR扩增的反应条件。
为解决上述技术问题，本发明还提供了印度南瓜育种方法。
本发明所提供的印度南瓜育种方法，按照所述鉴定印度南瓜基因型的方法鉴定印度南瓜的基因型，选择ff基因型的印度南瓜作为亲本进行育种。
本发明中，所述强雌性状印度南瓜是指植株基部3-5节之后均为雌花的印度南瓜，所述正常花型印度南瓜是指植株3-5节之后仍然有雄花生长的印度南瓜。
本发明中，所述A1的两条单链DNA的摩尔数可为1:1。
本发明中，在检测PCR产物的大小时，可通过电泳检测，所述PCR产物含有265bp和249bp的DNA片段可表现为在200bp和300bp间有两条带，所述PCR产物含有265bp的DNA片段且不含有249bp的DNA片段可表现为在200bp和300bp间有一条接近300bp的条带，所述PCR产物不含有265bp的DNA片段且含有249bp的DNA片段可表现为在200bp和300bp间有一条接近200bp的条带。
实验证明，利用本发明的印度南瓜强雌性状分子标记可以鉴定印度南瓜的强雌性状，以有和无强雌性状的印度南瓜基因组为模板，利用本发明的鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的引物对，进行PCR扩增时得到的三种PCR产物，对应于不同的印度南瓜强雌性状，当印度南瓜的PCR产物含有SEQ ID No.3所示的DNA片段(265bp)且不含有SEQ ID No.4所示的DNA片段(249bp)时，印度南瓜表现为正常花型，当印度南瓜的PCR产物含有SEQ ID No.3所示的DNA片段(265bp)和SEQ ID No.4所示的DNA片段(249bp)，该印度南瓜表现为正常花型，当印度南瓜的PCR产物含有SEQ ID No.4所示的DNA片段(249bp)且不含有SEQ ID No.3所示的DNA片段(265bp)，该印度南瓜表现为强雌性状。表明可以利用鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的引物对A1和印度南瓜强雌性状分子标记鉴定印度南瓜的强雌性状情况。
本发明在强雌自交系LC-03中发现了一个强雌性状隐性控制基因Cmaf，其优异的雌花连续着生表现在印度南瓜育种中具有重要的利用价值。本发明获得了与强雌性状紧密连锁的分子标记C101。利用获得的分子标记进行辅助选择，成功的将强雌性状控制基因通过杂交、回交转育的方法导入印度南瓜优良自交系1-14中，使其获得强雌性状。
附图说明
图1为分子标记C101与印度南瓜抗病基因Cmaf的遗传连锁图，左边为标记间的图距。
图2为分子标记C101扩增带型。其中P1为正常花型亲本自交系1-14，P2为强雌自交系LC-03，F1为杂交一代；1-28为以自交系1-14为轮回亲本的回交单株；M：Trans DNAmarkerII，箭头所指为249bp特异扩增条带。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的强雌自交系LC-03和自交系1-14均在文献“Utilization of aStrongly Female Mutant in Seed-Pumpkin Germplasm of Cucurbita maxima Duchesnefor Increased Production and Facilitate Hybrid Seed Production”中公开过，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的dNTPs为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。TaqDNA聚合酶为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为R001Q。10×buffer为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为9151A。PCR仪为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。
实施例1、与印度南瓜强雌基因Cmaf紧密连锁的SSR分子标记的获得
本实施例获得了与印度南瓜强雌基因Cmaf紧密连锁的SSR分子标记C101。具体获得方法包括以下步骤：
(一)强雌自交系LC-03与自交系1-14F2代的创建与表型鉴定：
(1)自交系1-14(父本，P1)与强雌自交系LC-03(母本，P2)进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2代群体，F1分别与P1及P2回交产生BC1P1和BC1P2群体。
(2)不同群体的单株种植于大田，单蔓整枝，正常管理，调查记录每个单株每节的花的性型。统计分析结果见表1。
表1、强雌自交系LC-03和自交系1-14六世代花性状表现
Figure BDA0001157655450000071
(3)F2代单株进行性状调查后将强雌性状植株自交所得种子分单株保存，为F3家系。每个F3家系中选择10粒种子进行子代单株每节位的花性型分析，以验证F2代强雌单株是否携带纯合强雌基因。
(4)通过对六世代群体的遗传分析，发现强雌自交系LC-03携带一个隐性强雌性状控制基因。
(二)多态性分子标记筛选
(5)将10株强雌F2单株的叶片等量混成池f，10株正常花型F2单株的叶片等量混成池F。用CTAB法(Sue Porebski L.,1997)提取强雌亲本LC-03、正常亲本自交系1-14、F池和f池的DNA，应用简单重复序列标记SSR与BSA(Bulk Segregant Analysis)结合的方法进行多态性分子标记筛选。
(6)首先利用708对SSR引物对强雌亲本LC-03、正常亲本自交系1-14、F池和f池进行多态性筛选；
PCR反应体积为15μL，其中10×buffer 1.5μL，2.5mM dNTPs 0.3μL，Tag酶(5单位/μL)0.2μL，10μM引物(F/R)各0.3μL，模版DNA 30ng，加ddH2O至15μL；
SSR反应条件为DNA 95℃预变性3min后，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，循环36次，最后72℃延伸10min；
在PCR扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染后照相记录结果；
选择在亲本间和F2代群体的F、f池间扩增出相同有多态型的引物，与抗病基因Cmaf连锁的候选分子标记共3个；
(三)紧密连锁分子标记的获得
(7)根据连锁交换规律，利用3个候选分子标记在纯合强雌性状单株间的基因型资料与单株的强雌性状资料，构建分子标记与Cmaf基因的连锁图谱，所用软件为Mapmaker/EXP 3.0，获得了与抗病基因Cmaf紧密连锁的分子标记C101，遗传连锁距离为0.6cM(图1)；分子标记C101的引物序列如下：
C101-F:TATTGGCATGGCCAAGAGTT(SEQ ID No.1)；
C101-R:CGTAATGAAAACGTCCACCC(SEQ ID No.2)。
(四)抗病基因Cmaf向正常花型印度南瓜自交系的转移
(8)利用获得的与抗病基因Cmaf紧密连锁的分子标记C101，分别以正常花型亲本自交系1-14(P1)、强雌自交系LC-03(P2)、F1和以自交系1-14为轮回亲本的回交单株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，并对PCR扩增产物进行电泳和测序。
测序结果表明：PCR产物共有三种情况：第一种情况是PCR产物含有SEQ ID No.3所示的DNA片段(265bp)且不含有SEQ ID No.4所示的DNA片段(249bp)，第二种情况是PCR产物含有SEQ ID No.4所示的DNA片段(249bp)且不含有SEQ ID No.3所示的DNA片段(265bp)，第三种情况是PCR产物含有SEQ ID No.3所示的DNA片段(265bp)和SEQ ID No.4所示的DNA片段(249bp)。根据PCR扩增产物定义印度南瓜的基因型，其中，将PCR扩增产物含有SEQ IDNo.3所示的DNA片段且不含有SEQ ID No.4所示的DNA片段的印度南瓜的基因型记作FF基因型；将PCR扩增产物含有SEQ ID No.4所示的DNA片段且不含有SEQ ID No.3所示的DNA片段的印度南瓜的基因型记作ff基因型；将PCR扩增产物含有SEQ ID No.3所示的DNA片段和SEQID No.4所示的DNA片段的印度南瓜的基因型记作Ff基因型。其中，FF基因型和ff基因型均可稳定遗传。
电泳结果如图2所示。从图中可以看出：正常花型亲本自交系1-14(P1)的PCR产物含有大小为265bp的条带且不含有大小为249bp的条带，强雌自交系LC-03(P2)的PCR产物含有大小为249bp的条带且不含有大小为265bp的条带，F1代的PCR产物含有大小为265bp和249bp的条带。其中，265bp的PCR产物表示SEQ ID No.3所示的DNA片段，249bp的PCR产物表示SEQ ID No.4所示的DNA片段。
上述结果表明：通过杂交与回交转育将强雌基因导入印度南瓜正常花型优良自交系中，成功改良印度南瓜自交系1-14，使其携带Cmaf基因具备了强雌性状。
印度南瓜种质资源中蕴含丰富的基因资源，高效充分的利用这些基因资源对于印度南瓜新品种培育及生产具有重要作用。本发明通过将强雌自交系LC-03与正常花型自交系1-14杂交，经遗传分析确定强雌自交系LC-03材料中携带有一个隐性的强雌性状控制基因，通过构建强雌性状分离群体，经多态性分子标记筛选，构建了强雌基因Cmaf与分子标记C101的遗传连锁图谱。利用分子标记辅助选择，经杂交及回交转育，成功将强雌基因Cmaf转育到自交系1-14中，使其获得了强雌性状。传统育种方法中，由于缺乏与强雌基因连锁的分子标记，每代的强雌基因转移均需要进行统计鉴定，耗时耗力。因此，分子标记C101的开发可以在苗期简便准确的筛选含有强雌基因Cmaf的单株，大大节省强雌材料的筛选时间和育种劳动量，提高选择的准确性，加快了强雌性状新品种的培育速度。
本发明获得与印度南瓜强雌基因Cmaf紧密连锁的共显性分子标记C101。C101与强雌基因的遗传距离为0.6cM。利用该标记能够通过辅助选择鉴定将强雌基因成功导入其它印度南瓜优良自交系，使之获得强雌性状。分子标记具有扩增稳定、检测方便、快速准确等优点。用标记C101检测印度南瓜强雌基因Cmaf，可以确定强雌基因是否存在以及存在状态，并预测植株是否具有强雌性状，加快该性状的利用。本发明提出了利用印度南瓜强雌自交系LC-03中强雌基因的方法：利用分子标记筛选，通过杂交与回交转育将强雌基因导入印度南瓜优良的正常花型自交系1-14中，利用该方法成功将强雌基因Cmaf导入印度南瓜优良自交系1-14，使其获得了强雌性状。
实施例2、印度南瓜强雌性状的鉴定
本实施例利用实施例1获得的分子标记C101鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状。
一、印度南瓜供试材料的表型鉴定
待鉴定印度南瓜如下，每种印度南瓜均选择50株进行试验：
强雌自交系LC-03，其表型为强雌性状；
自交系1-14，其表型为正常花型；
黑晶一号，其表型为正常花型，为安徽荃银高科种业股份有限公司产品；
黑丰，其表型为正常花型，为安徽江淮园艺科技有限公司产品；
李白，其表型为正常花型，为上海惠和种业有限公司产品；
京域红栗，其表型为正常花型，为北京京域威尔农业科技有限公司产品；
短蔓红，其表型为正常花型，为北京君川种业科技有限公司产品；
美艳三号，其表型为正常花型，为沈阳现代农人农业科技有限公司产品；
南瓜1号，其表型为正常花型，为北京世农种苗有限公司产品；
贝贝2号，其表型为正常花型，为上海惠和种业有限公司产品；
大贝贝，其表型为正常花型，为北京中农绿亨种子科技有限公司产品；
皮特，其表型为正常花型，为新疆昌吉市艾格瑞特种业有限公司产品；
红栗2号，其表型为正常花型，为南湘(湖南)种苗有限公司产品；
短蔓金栗，其表型为正常花型，为安徽拓华农业有限公司产品。
二、印度南瓜供试材料的基因型鉴定
用CTAB法(Sue Porebski L.,1997)提取上述步骤一中各个印度南瓜幼嫩叶片的基因组DNA，分别利用分子标记C101进行PCR扩增。
利用分子标记C101进行PCR扩增的15μL反应体系为：10×buffer 1.5微升，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs 0.3微升，Taq DNA聚合酶0.2微升，C101-F，C101-R，印度南瓜基因组DNA 30ng，以无菌的超纯水补足15微升，使C101-F和C101-R的终浓度均为0.2μM。在PCR仪中进行PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，循环36次；72℃延伸10min。将反应产物一部分进行测序，一部分在1.0％的琼脂糖凝胶上100V电泳35min，经GoldView核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。
PCR产物与表型的关系如表2所示。从表2中的基因型和表型的结果可以看出，当印度南瓜的PCR产物为第一种情况(即印度南瓜的基因型为FF基因型)时，该印度南瓜表现为正常花型，当印度南瓜的PCR产物为第二种情况(即印度南瓜的基因型为ff基因型)，该印度南瓜表现为强雌性状。PCR产物的基因型情况(或印度南瓜的FF、ff基因型)与印度南瓜的花性别表型情况完全一致，表明可以利用鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的分子标记C101鉴定印度南瓜的强雌性状情况。表2、不同印度南瓜PCR产物和花性别表型分析结果
品种 表型 PCR产物 基因型
黑晶一号 正常花型 265bp FF
黑丰 正常花型 265bp FF
李白 正常花型 265bp FF
京域红栗 正常花型 265bp FF
短蔓红 正常花型 265bp FF
美艳三号 正常花型 265bp FF
南瓜1号 正常花型 265bp FF
贝贝2号 正常花型 265bp FF
大贝贝 正常花型 265bp FF
皮特 正常花型 265bp FF
红栗2号 正常花型 265bp FF
短蔓金栗 正常花型 265bp FF
强雌自交系LC-03 强雌性状 249bp ff
自交系1-14 正常花型 265bp FF
序列表
<110>北京市农林科学院
<120>印度南瓜强雌性状分子标记与鉴定印度南瓜强雌性状的引物对
<160>4
<210>1
<211>20bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
tattggcatg gccaagagtt 20
<210>2
<211>20bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
cgtaatgaaa acgtccaccc 20
<210>3
<211>265bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
tattgccaag agtggcatgt tagggttgac tttcagcata acttcataac ttatggtaaa 60
agatactcta cctcactaca ttccgtaaca atgacgacca attatattga tacggttagg 120
aatcatcttt gaaatctccc tttaagcttt cattgctaca caataatcca aaataaatgt 180
acctctctat atatatatat atatatatat atatatatat ttttaagtga tgagctcaga 240
gcctcgtttc attacggtgg acgtg 265
<210>4
<211>249bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
tattgccaag agtggcatgt tagggttgac tttcagcata acttcataac ttatggtaaa 60
agatactcta cctcactaca ttccgtaaca atgacgacca attatattga tacggttagg 120
aatcatcttt gaaatctccc tttaagcttt cattgctaca caataatcca aaataaatgt 180
acctctctat atatatatat atatttttaa gtgatgagct cagagcctcg tttcattacg 240
gtggacgtg 249

Claims (9)

1.印度南瓜强雌性状分子标记，为以印度南瓜的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.3的第204位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.3的第219位下游特异结合的单链DNA；
所述P1为SEQ ID No.1所示的单链DNA；
所述P2为SEQ ID No.2所示的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的印度南瓜强雌性状分子标记，其特征在于：所述印度南瓜强雌性状分子标记的多态性为印度南瓜基因组中对应于SEQ ID No.3第204-219位：存在SEQ IDNo.3第204-219位或缺失SEQ ID No.3第204-219位。
3.鉴定印度南瓜基因型的方法，所述基因型为FF基因型、Ff基因型和ff基因型，所述方法为如下Ⅰ或Ⅱ：
Ⅰ、包括如下K1）和K2）：
K1）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1或2中所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
K2）检测步骤K1）得到的PCR产物，根据所述PCR产物确定印度南瓜基因型：
如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.3为一条含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为FF基因型；如果所述PCR产物含有一条不含有SEQID No.3的第204-219位所示的DNA片段和一条含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为Ff基因型；如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.3为一条不含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为ff基因型；
Ⅱ、包括如下L1）和L2）：
L1）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1或2中所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
L2）下述L21）或L22）：
L21）检测步骤L1）得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物的大小确定印度南瓜基因型：
如果所述PCR产物含有265 bp和249 bp的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为Ff基因型；如果所述PCR产物含有265 bp的DNA片段且不含有249 bp的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为FF基因型；如果所述PCR产物不含有265 bp的DNA片段且含有249 bp的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为ff基因型；
L22）检测步骤L1）得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物确定印度南瓜基因型：
如果所述PCR产物含有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为Ff基因型；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.3所示的DNA片段且不含SEQ IDNo.4所示的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为FF基因型；如果所述PCR产物含有SEQID No.4所示的DNA片段且不含SEQ ID No.3所示的DNA片段，所述待测印度南瓜的基因型为ff基因型。
4.鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的方法，为如下1）或2）：
1）包括如下M1）和M2）：
M1）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1或2中所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
M2）检测步骤M1）得到的PCR产物，如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.3为一条含有SEQID No.3的第204-219位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为正常花型印度南瓜；如果所述PCR产物含有一条不含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段和一条含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为正常花型印度南瓜；如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.3为一条不含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为强雌性状印度南瓜；
2）包括如下N1）和N2）：
N1）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1中所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
N2）如下N21）或N22）：
N21）检测步骤N1）得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物不含有249 bp的DNA片段且含有265 bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为正常花型印度南瓜；如果所述PCR产物含有265 bp和249 bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为正常花型印度南瓜；如果所述PCR产物含有249 bp的DNA片段且不含有265 bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为强雌性状印度南瓜；
N22）检测步骤N1）得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为正常花型印度南瓜；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.3所示的DNA片段且不含SEQ ID No.4所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为正常花型印度南瓜；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.4所示的DNA片段且不含SEQID No.3所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为强雌性状印度南瓜。
5.鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的引物对，为权利要求1或2中所述A1。
6.鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的系统，由X1和X2组成；所述X1为权利要求1或2中所述A1，所述X2为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。
7.下述H1-H10中任一应用：
H1、权利要求1或2所述印度南瓜强雌性状分子标记在鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状中的应用；
H2、权利要求1或2所述印度南瓜强雌性状分子标记在鉴定或辅助鉴定强雌性状稳定遗传印度南瓜中的应用；
H3、权利要求1或2所述印度南瓜强雌性状分子标记在印度南瓜育种中的应用；
H4、权利要求3或4所述方法在鉴定或辅助鉴定强雌性状稳定遗传印度南瓜中的应用；
H5、权利要求3或4所述方法在印度南瓜育种中的应用；
H6、权利要求3所述鉴定印度南瓜基因型的方法在鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状中的应用；
H7、权利要求5所述引物对或权利要求6所述系统在制备鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状的试剂或试剂盒中的应用；
H8、权利要求5所述引物对或权利要求6所述系统在鉴定或辅助鉴定印度南瓜强雌性状中的应用；
H9、权利要求5所述引物对或权利要求6所述系统在鉴定或辅助鉴定强雌性状稳定遗传印度南瓜中的应用；
H10、权利要求5所述引物对或权利要求6所述系统在印度南瓜育种中的应用。
8.鉴定或辅助鉴定强雌性状稳定遗传印度南瓜的方法，为如下（3）或（4）：
（3）包括如下S1）和S2）：
S1）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1或2中所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
S2）检测步骤S1）得到的PCR产物，如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.3为一条不含有SEQ ID No.3的第204-219位所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为强雌性状稳定遗传印度南瓜；
（4）包括如下T1）和T2）：
T1）以待测印度南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1或2中所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
T2）如下T21）或T22）：
T21）检测步骤T1）得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有249bp的DNA片段且不含有265bp的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为强雌性状稳定遗传印度南瓜；
T22）检测步骤T1）得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.4所示的DNA片段且不含SEQ ID No.3所示的DNA片段，所述待测印度南瓜为或候选为强雌性状稳定遗传印度南瓜。
9.印度南瓜育种方法，按照权利要求3所述的方法鉴定印度南瓜的基因型，选择ff基因型的印度南瓜作为亲本进行育种。
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