CN106609297B - 中国南瓜白粉病分子标记与鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的引物对 - Google Patents

中国南瓜白粉病分子标记与鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的引物对 Download PDF

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Abstract

本发明公开了中国南瓜白粉病分子标记与鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的引物对。本发明所提供的中国南瓜白粉病分子标记，为以中国南瓜的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.1的第65位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第82位下游特异结合的单链DNA。实验证明，可以利用鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的引物对A1和中国南瓜白粉病分子标记鉴定中国南瓜的白粉病的抗性情况。

Description

中国南瓜白粉病分子标记与鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的 引物对
技术领域
本发明涉及生物技术领域中中国南瓜白粉病分子标记与鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的引物对。
背景技术
我国是中国南瓜的主要栽培国，栽培面积及产量均居世界前列，特别是近年来我国南方地区中国南瓜的栽培面积不断增加，已成为农民增收、农业结构调整的重要栽培作物。
白粉病是危害中国南瓜中后期生产的重要病害之一，植株感染白粉病后光合作用严重降低，植株生长缓慢，降低产量与品质，产量损失可达40％左右。中国南瓜白粉病主要由单囊壳菌(Sphaerotheca fuliginea)和二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)侵染导致，中国南瓜对白粉病没有免疫类型，高抗材料也很少，随着栽培面积的扩大与连续重茬栽培，白粉病的发生变的越来越为严重，已经成为中国南瓜生产和制种的主要障碍。尽管白粉病可采用化学药物防治，但由于危害中国南瓜的白粉病菌生理小种较多，分化快，化学药剂很难有效保障生产，而且化学防治污染环境，危害消费者健康。因此，培育和推广抗白粉病品种是解决这一问题最经济、安全、有效的措施。但目前，传统抗病育种存在抗病基因转育困难，抗病性状鉴别准确性差，抗病育种效率低、周期长等问题，导致生产中抗病品种少，不能满足生产需要。紧密连锁的分子标记可以加速抗病育种进程、提高选择的准确性，是分子标记辅助选择育种的必要条件。而与瓜类白粉病抗性连锁的分子标记的研究主要集中在西瓜、甜瓜及黄瓜上，国内外至今未见中国南瓜的相关研究报道。因此，开发中国南瓜白粉病抗病的分子标记，对于提高中国南瓜抗病育种效率，拓展抗病基因应用范围，保障中国南瓜的健康生产具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定中国南瓜的白粉病抗性性状。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了中国南瓜白粉病分子标记。
本发明所提供的中国南瓜白粉病分子标记，为以中国南瓜的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.1的第65位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第82位下游特异结合的单链DNA。
上述中国南瓜分子标记的多态性可为中国南瓜基因组中对应于SEQ ID No.1第65-82位为SEQ ID No.1第65-82位或缺失SEQ ID No.1第65-82位。
上述中国南瓜分子标记中，所述P1可为SEQ ID No.1的第1-20位所示的单链DNA，所述P2可为与SEQ ID No.1的第171-191位反向互补的单链DNA。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定中国南瓜基因型的方法。
本发明所提供的鉴定中国南瓜基因型的方法，所述基因型为RR基因型、RS基因型和SS基因型，所述方法为如下Ⅰ或Ⅱ：
Ⅰ、包括如下K1)和K2)：
K1)以待测中国南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
K2)检测步骤K1)得到的PCR产物，根据所述PCR产物确定中国南瓜基因型：
所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条不含有SEQ ID No.1的第65-82位所示的DNA片段的所述待测中国南瓜的基因型为RR基因型；所述PCR产物含有一条不含有SEQ IDNo.1的第65-82位所示的DNA片段和一条含有SEQ ID No.1的第65-82位所示的DNA片段的所述待测中国南瓜的基因型为RS基因型；所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条含有SEQ IDNo.1的第65-82位所示的DNA片段的所述待测中国南瓜的基因型为SS基因型；
Ⅱ、包括如下L1)和L2)：
L1)以待测中国南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
L2)下述L21)或L22)：
L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物的大小确定中国南瓜基因型：
所述PCR产物含有191bp和173bp的DNA片段的所述待测中国南瓜的基因型为RS基因型；所述PCR产物含有191bp的DNA片段、不含有173bp的DNA片段的所述待测中国南瓜的基因型为SS基因型；所述PCR产物不含有191bp的DNA片段、含有173bp的DNA片段的所述待测中国南瓜的基因型为RR基因型；
L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物确定中国南瓜基因型：
所述PCR产物含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA片段的所述待测中国南瓜的基因型为RS基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的的DNA片段，所述待测中国南瓜的基因型为RR基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ ID No.2所示的的DNA片段，所述待测中国南瓜的基因型为SS基因型。
上述鉴定中国南瓜基因型的方法中，进行所述PCR扩增的体系可含有：10×buffer，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs，Taq DNA聚合酶，所述P1，所述P2，待测中国南瓜基因组DNA。所述体系中dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均可为0.05mM，SEQIDNo.1和2所示单链DNA的终浓度均可为0.2μM，待测中国南瓜基因组DNA的浓度可为30ng/μL。
进行所述PCR扩增的反应条件可为：95℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，循环36次；72℃延伸10min。
上述鉴定中国南瓜基因型的方法中，所述dNTPs具体可为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。所述Taq DNA聚合酶具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为R001Q。所述10×buffer具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为9151A。
上述鉴定中国南瓜基因型的方法中，所述RR基因型中国南瓜和所述RS基因型中国南瓜的抗白粉病性均高于所述SS基因型中国南瓜的抗白粉病性。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的方法，为如下1)或2)：
1)包括如下M1)和M2)：
M1)以待测中国南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
M2)检测步骤M1)得到的PCR产物，如果所述PCR产物含有一条不含有SEQ ID No.1的第65-82位所示的DNA片段和一条含有SEQ ID No.1的第65-82位所示的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病中国南瓜；如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条不含有SEQ ID No.1的第65-82位所示的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病中国南瓜；如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条含有SEQ ID No.1的第65-82位所示的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为非抗白粉病中国南瓜；
2)包括如下N1)和N2)：
N1)以待测中国南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
N2)如下N21)或N22)：
N21)检测步骤N1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有191bp和173bp的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病中国南瓜；如果所述PCR产物含有173bp的DNA片段、不含191bp的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病中国南瓜；如果所述PCR产物不含有173bp的DNA片段、含有191bp的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为非抗白粉病中国南瓜；
N22)检测步骤N1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病中国南瓜；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病中国南瓜；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ ID No.2所示的的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为非抗白粉病中国南瓜。
上述鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的方法中进行所述PCR扩增的体系可为上述鉴定中国南瓜基因型的方法中进行所述PCR扩增的体系，进行所述PCR扩增的反应条件可为上述鉴定中国南瓜基因型的方法中进行所述PCR扩增的反应条件。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定抗白粉病性状稳定遗传中国南瓜的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定抗白粉病性状稳定遗传中国南瓜的方法，为如下I或II：
I、包括如下M1)和M2)：
M1)以待测中国南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
M2)检测步骤M1)得到的PCR产物，如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条不含有SEQ ID No.1的第65-82位所示的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病性状稳定遗传中国南瓜；
II、包括如下N1)和N2)：
N1)以待测中国南瓜基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
N2)如下N21)或N22)：
N21)检测步骤N1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有173bp的DNA片段、不含191bp的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病性状稳定遗传中国南瓜；
N22)检测步骤N1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病性状稳定遗传中国南瓜。
上述鉴定或辅助鉴定抗白粉病性状稳定遗传中国南瓜的方法中进行所述PCR扩增的体系可为上述鉴定中国南瓜基因型的方法中进行所述PCR扩增的体系，进行所述PCR扩增的反应条件可为上述鉴定中国南瓜基因型的方法中进行所述PCR扩增的反应条件。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的引物对。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的引物对，为所述A1。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的系统，由X1和X2组成；所述X1为所述A1，所述X2为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。
上述系统中，所述进行PCR扩增所需的试剂可含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTPs、Taq DNA聚合酶和/或PCR反应缓冲液，也可仅为所述dNTP混合物、所述Taq DNA聚合酶和/或所述PCR反应缓冲液；所述进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。所述dNTPs具体可为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。所述Taq DNA聚合酶具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为R001Q。所述10×buffer具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为9151A。所述PCR仪具体可为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。
上述系统中，所述A1和所述进行PCR扩增所需的试剂均可独立包装。所述A1中的各引物对的两条单链DNA可独立包装。进行PCR扩增所需的各试剂均可独立包装。
上述鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的系统也可为仅含有所述A1和所述进行PCR扩增所需的试剂或试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述H1-H10中任一应用：
H1、所述中国南瓜白粉病分子标记在鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状中的应用；
H2、所述中国南瓜白粉病分子标记在鉴定或辅助鉴定白粉病抗性性状稳定遗传中国南瓜中的应用；
H3、所述中国南瓜白粉病分子标记在中国南瓜育种中的应用；
H4、所述鉴定中国南瓜基因型的方法或鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的方法在鉴定或辅助鉴定白粉病抗性性状稳定遗传中国南瓜中的应用；
H5、所述鉴定中国南瓜基因型的方法或鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的方法在中国南瓜育种中的应用；
H6、所述鉴定中国南瓜基因型的方法在鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状中的应用；
H7、所述A1或所述系统在制备鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的试剂或试剂盒中的应用；
H8、所述A1或所述系统在鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状中的应用；
H9、所述A1或所述系统在鉴定或辅助鉴定白粉病抗性性状稳定遗传中国南瓜中的应用；
H10、所述A1或所述系统在中国南瓜育种中的应用。
上述应用中，所述RR基因型中国南瓜和所述RS基因型中国南瓜的抗白粉病性均高于所述SS基因型中国南瓜的抗白粉病性。
为解决上述技术问题，本发明还提供了中国南瓜育种方法。
本发明所提供的中国南瓜育种方法，按照所述鉴定中国南瓜基因型的方法鉴定中国南瓜的基因型，选择RR或RS基因型的中国南瓜作为亲本进行育种。
本发明中，所述抗白粉病中国南瓜是指白粉病病情指数小于等于20的中国南瓜，所述非抗白粉病中国南瓜是指白粉病病情指数大于20的中国南瓜。
本发明中，所述A1的两条单链DNA的的摩尔数可为1:1。
本发明中，在检测PCR产物的大小时，可通过电泳检测，所述PCR产物含有191bp和173bp的DNA片段可表现为在100bp和200bp间有两条带，所述PCR产物含有173bp的DNA片段、不含191bp的DNA片段可表现为在100bp和200bp间有一条接近100bp的条带，所述PCR产物不含有173bp的DNA片段、含有191bp的DNA片段可表现为在100bp和200bp间有一条接近200bp的条带。
实验证明，利用本发明的中国南瓜白粉病分子标记可以鉴定中国南瓜的白粉病的抗性性状，以有不同白粉病抗性性状的中国南瓜基因组为模板，利用本发明的鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的引物对进行PCR扩增时得到的三种PCR产物对应于不同的中国南瓜白粉病抗性性状，当中国南瓜的PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(191bp)不含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(173bp)时，中国南瓜表现为感白粉病，当中国南瓜的PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(173bp)不含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(191bp)，该中国南瓜表现为抗白粉病，当中国南瓜的PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(191bp)和SEQ ID No.2所示的DNA片段(173bp)，该中国南瓜表现为抗白粉病。表明可以利用鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的引物对A1和中国南瓜白粉病分子标记鉴定中国南瓜的白粉病的抗性情况。
本发明在中国南瓜自交系BCmo3中发现了一个白粉病显性抗病基因CmoPm1，其优异的抗病表现在中国南瓜抗病育种中具有重要的利用价值。本发明获得了与抗病基因紧密连锁的分子标记Pm103。利用获得的分子标记进行辅助选择，成功的将抗病基因通过杂交、回交转育的方法导入中国南瓜优良自交系BCmo27中，使其获得白粉病抗性。
附图说明
图1为分子标记Pm103与中国南瓜抗病基因CmoPm1的遗传连锁图，左边为标记间的图距。
图2为分子标记Pm103扩增带型。其中P1为感病亲本BCmo27，P2为抗病亲本BCmo3，F1为杂交一代；1-24为以BCmo27为轮回亲本的回交单株；M：Trans DNA markerII,箭头所指为173bp特异扩增条带。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的中国南瓜自交系BCmo27和中国南瓜自交系BCmo3公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的dNTPs为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。TaqDNA聚合酶为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为R001Q。10×buffer为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为9151A。PCR仪为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。
实施例1、中国南瓜白粉病抗性性状的鉴定
本实施例利用鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的引物对A1对中国南瓜的白粉病抗性性状进行鉴定，A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，P1为SEQ ID No.1的第1-20位所示的单链DNA，P2为与SEQ ID No.1的第171-191位反向互补的单链DNA。
1、待鉴定中国南瓜如下，每种中国南瓜均选择50株进行试验：
中国南瓜自交系BCmo27，其表型为感白粉病；
中国南瓜自交系BCmo3，其表型为抗白粉病；
汕美2号，其表型为感白粉病，为汕头市金韩种业有限公司产品；
汕美23号，其表型为感白粉病，为汕头市金韩种业有限公司产品；
汕美33号，其表型为感白粉病，为汕头市金韩种业有限公司产品；
黄冠，其表型为抗白粉病，为新疆昌吉市艾格瑞特种业有限公司产品；
金法兰，其表型为感白粉病，为沈阳现代农人农业科技有限公司产品；
五山蜜本中国南瓜A，其表型为抗白粉病，为广州华绿种子有限公司产品；
嘉禾大果蜜本，其表型为抗白粉病，为合肥嘉禾种业有限公司产品；
蜜本3号，其表型为感白粉病，为广东省农科院蔬菜研究所产品；
超级墨本799，其表型为抗白粉病，为广东省良种引进服务公司产品；
PS326，其表型为抗白粉病，为北京中农绿亨种子科技有限公司产品；
PS327，其表型为抗白粉病，为北京中农绿亨种子科技有限公司产品；
圆绿，其表型为抗白粉病，为北京中农绿亨种子科技有限公司产品。
2、中国南瓜白粉病抗性性状的鉴定
用CTAB法(Sue Porebski L.,1997)提取上述各中国南瓜幼嫩叶片的基因组DNA，分别利用引物对A1进行PCR扩增。
利用引物对A1进行PCR扩增的15μL反应体系为：10×buffer 1.5微升，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs 0.3微升，Taq DNA聚合酶0.2微升，P1，P2，中国南瓜基因组DNA 30ng，以无菌的超纯水补足15微升，使P1和P2的终浓度均为0.2μM。在PCR仪中进行PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，循环36次；72℃延伸10min。将反应产物一部分进行测序，一部分在1.0％的琼脂糖凝胶上100V电泳35min，经GoldView核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。
以上各中国南瓜的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序结果如表1所示，表1中191bp的PCR产物表示SEQ ID No.1所示的DNA片段，173bp的PCR产物表示SEQ ID No.2所示的DNA片段。然后鉴定各中国南瓜的白粉病抗性的情况，PCR产物与表型的关系如表1所示。
利用A1在以不同中国南瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增时，PCR产物共有三种情况：第一种情况是PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(191bp)不含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(173bp)，第二种情况是PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(173bp)不含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(191bp)，第三种情况是PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(191bp)和SEQ ID No.2所示的DNA片段(173bp)。根据PCR扩增产物定义中国南瓜的基因型，其中RR基因型表示中国南瓜的两条同源染色体对应于SEQ ID No.1均为SEQ IDNo.2，RS基因型表示中国南瓜的一条同源染色体对应于SEQ ID No.1为SEQ ID No.1，另一条同源染色体对应于SEQ ID No.1为SEQ ID No.2，SS基因型表示中国南瓜的两条同源染色体对应于SEQ ID No.1均为SEQ ID No.1。其中，RR基因型和SS基因型均可稳定遗传。
将以中国南瓜的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行PCR扩增得到的DNA分子命名为中国南瓜白粉病分子标记，中国南瓜白粉病分子标记的多态性为中国南瓜基因组中对应于SEQ ID No.1为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2。
表1、不同中国南瓜PCR产物和白粉病抗性表型分析结果
品种 表型 PCR产物 基因型
中国南瓜自交系BCmo27 感病 191bp SS
中国南瓜自交系Bcmo3 抗病 173bp RR
汕美2号 感病 191bp SS
汕美23号 感病 191bp SS
汕美33号 感病 191bp SS
黄冠 抗病 191bp+173bp RS
金法兰 感病 191bp SS
五山蜜本中国南瓜A 抗病 191bp+173bp RS
嘉禾大果蜜本 抗病 191bp+173bp RS
蜜本3号 感病 191bp SS
超级墨本799 抗病 191bp+173bp RS
PS326 抗病 191bp+173bp RS
PS327 抗病 191bp+173bp RS
圆绿 抗病 191bp+173bp RS
结果表明，当中国南瓜的PCR产物为第一种情况(即中国南瓜的基因型为SS基因型)时，该中国南瓜表现为感白粉病，当中国南瓜的PCR产物为第二种情况(即中国南瓜的基因型为RR基因型)，该中国南瓜表现为抗白粉病，当中国南瓜的PCR产物为第三种情况(即RS基因型)时，该中国南瓜表现为抗白粉病。PCR产物的三种情况(或中国南瓜的SS、RR和RS基因型)与中国南瓜的白粉病的抗性情况完全一致，表明可以利用鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的引物对A1鉴定中国南瓜白粉病的抗性情况。
实施例2、与中国南瓜白粉病显性抗病基因CmoPm1紧密连锁的SSR分子标记的获得方法
将实施例1的中国南瓜白粉病分子标记命名为分子标记Pm103，本实施例具体描述了所述的与中国南瓜白粉病显性抗病基因CmoPm1紧密连锁的SSR分子标记Pm103的获得方法，包括以下步骤：
(一)中国南瓜自交系BCmo27与BCmo3F2代的创建与表型鉴定：
(1)中国南瓜自交系BCmo27(母本，P1)与BCmo3(父本，P2)进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2代群体。
(2)F2代群体单株种植于温室营养钵内，外罩防虫网，子叶完全展开后接种白粉病菌孢子，接种15天后进行抗病性状调查。鉴定结果见表2。
表2、接种白粉病后BCmo27×BCmo3F2代群体遗传分析
R、S分别代表抗病单株、感病单株。χ2 0.05,1＝3.84。
(3)F2代单株进行性状调查后将感病植株移栽于温室种植，自交所得种子为F3家系。每个F3家系中选择10粒种子进行子代抗病性测验，以验证F2代感病单株是否携带纯合感病基因。
(4)通过对F2代单株进行遗传分析，发现中国南瓜自交系BCmo3携带一个显性抗病基因。
(二)多态性分子标记筛选
(5)将10株抗病F2单株的叶片等量混成抗池，10株感病F2单株的叶片等量混成感池。用CTAB法(Sue Porebski L.,1997)提取抗病亲本BCmo3、感病亲本BCmo27、抗池和感池的DNA，应用简单重复序列标记SSR与BSA(Bulk Segregant Analysis)结合的方法进行多态性分子标记筛选。
(6)首先利用584对SSR引物(Amine Zraidi,Gertraud Stift,Martin Pachner,Abdolali Shojaeiyan,Li Gong,Tamas Lelley(2007)A consensus map for Cucurbitapepo.Mol.Breeding 20(4):375-388；Gong L,Stift G,Kofler R,Pachner M,Lelley T(2008)Microsatell ites for the genus Cucurbita and an SSR-based geneticlinkage map of Cucurbita and an SSR-based genetic linkage mao of Cucurbitapepo L.Theor Appl Genet 117:37-48；Blanca J,J,Roig C,Ziarsolo P,Nuez F,PicóB.(2011)Transcriptome characterization and high throughput SSRsand SNPs discovery in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae).BMC Genomics 12:104)对BCmo3、BCmo27、抗池和感池进行多态性筛选；
PCR反应体积为15μL，其中10×buffer 1.5μL，2.5mM dNTPs 0.3μL，Tag酶(5单位/μL)0.2μL，10μM引物(F/R)各0.3μL，模版DNA 30ng，加ddH2O至15μL；
SSR反应条件为DNA 95℃预变性3min后，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，循环36次，最后72℃延伸10min；
在PCR扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染后照相记录结果；
选择在亲本间和F2代群体的抗、感池间扩增出相同有多态型的引物，与抗病基因CmoPm1连锁的候选分子标记共6个；
(三)紧密连锁分子标记的获得
(7)根据连锁交换规律，利用6个候选分子标记在纯合感病单株间的基因型资料与单株的抗性资料，构建分子标记与CmoPm1基因的连锁图谱，所用软件为Mapmaker/EXP 3.0，获得了与抗病基因CmoPm1紧密连锁的分子标记Pm103，遗传连锁距离为1.9cM(图1)；
(四)抗病基因CmoPm1向感病中国南瓜自交系的转移
(8)利用获得的与抗病基因CmoPm1紧密连锁的分子标记Pm103，通过杂交与回交转育将抗病基因导入中国南瓜优良感病自交系中(图2)。利用上述策略，成功改良中国南瓜优良感病自交系BCmo27，使其携带CmoPm1抗病基因具备了白粉病抗性。
中国南瓜种质资源中蕴含丰富的基因资源，高效充分的利用这些基因资源对于中国南瓜新品种培育具有重要作用。本发明通过将抗病种质BCmo3与感病自交系BCmo27杂交，经遗传分析确定抗病材料中携带有一个显性的抗病基因，通过构建抗病性状分离群体，经多态性分子标记筛选，构建了抗病基因CmoPm1与分子标记Pm103的遗传连锁图谱。利用分子标记辅助选择，经杂交及回交转育，成功将抗病基因CmoPm1转育到中国南瓜优良感病自交系BCmo27中，使其获得了白粉病抗性。在传统育种方法中，由于缺乏与白粉病抗病基因连锁的分子标记，每代的抗病基因转移均需要进行抗性接种鉴定，耗时耗力，且常常由于鉴定准确性差的问题导致选育失败。因此，分子标记Pm103的开发可以在苗期简便准确的筛选含有抗病基因CmoPm1的单株，大大节省抗病材料的筛选时间和育种劳动量，提高选择的准确性，加快了抗白粉病新品种的培育速度。
本发明获得与中国南瓜白粉病抗病基因CmoPm1紧密连锁的共显性分子标记Pm103。Pm103与抗病基因的遗传距离为1.9cM。利用该标记能够通过辅助选择鉴定将抗病基因成功导入其它中国南瓜感病优良自交系，使之获得抗病性状。分子标记具有扩增稳定、检测方便、快速准确等优点。用标记Pm103检测中国南瓜抗病基因CmoPm1，可以确定抗病基因是否存在以及存在状态，并预测植株对白粉病的抗性，加快该抗病基因的利用。本发明提出了利用中国南瓜白粉病抗病种质资源BCmo3中抗病基因的方法：利用分子标记筛选，通过杂交与回交转育将抗病基因导入中国南瓜优良的感病自交系中，利用该方法成功将抗病基因CmoPm1导入中国南瓜优良自交系BCmo27，使其获得了白粉病抗性。

Claims (11)

1.中国南瓜白粉病分子标记，为以中国南瓜的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.1的第65位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第82位下游特异结合的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的中国南瓜白粉病分子标记，其特征在于：所述中国南瓜分子标记的多态性为中国南瓜基因组中含有或缺失SEQ ID No.1第65-82位。
3.根据权利要求1所述的中国南瓜白粉病分子标记，其特征在于：所述P1为SEQ IDNo.1的第1-20位所示的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第171-191位反向互补的单链DNA。
4.鉴定中国南瓜基因型的方法，所述基因型为RR基因型、RS基因型和SS基因型，所述方法包括如下K1）和K2）：
K1）以待测中国南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1-3中任一所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
K2）检测步骤K1）得到的PCR产物，根据所述PCR产物确定中国南瓜基因型：
所述PCR产物为2条均不含有SEQ ID No.1的第65-82位所示的DNA片段，则所述待测中国南瓜的基因型为RR基因型；所述PCR产物为仅一条含有SEQ ID No.1的第65-82位所示的DNA片段，则所述待测中国南瓜的基因型为RS基因型；所述PCR产物为2条均含有SEQ IDNo.1的第65-82位所示的DNA片段，则所述待测中国南瓜的基因型为SS基因型。
5.鉴定中国南瓜基因型的方法，所述基因型为RR基因型、RS基因型和SS基因型，所述方法包括如下L1）和L2）：
L1）以待测中国南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求3中所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
L2）下述L21）或L22）：
L21）检测步骤L1）得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物的大小确定中国南瓜基因型：
所述PCR产物含有191bp和173bp的DNA片段的所述待测中国南瓜的基因型为RS基因型；所述PCR产物含有191bp的DNA片段、不含有173bp的DNA片段的所述待测中国南瓜的基因型为SS基因型；所述PCR产物不含有191bp的DNA片段、含有173bp的DNA片段的所述待测中国南瓜的基因型为RR基因型；
L22）检测步骤L1）得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物确定中国南瓜基因型：
所述PCR产物含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA片段的所述待测中国南瓜的基因型为RS基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的的DNA片段，所述待测中国南瓜的基因型为RR基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ ID No.2所示的的DNA片段，所述待测中国南瓜的基因型为SS基因型。
6.鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的方法包括如下M1）和M2）：
M1）以待测中国南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求1-3中任一所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
M2）检测步骤M1）得到的PCR产物，如果所述PCR产物为仅1条含有SEQ ID No.1的第65-82位所示的DNA片段，则所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病中国南瓜；如果所述PCR产物为2条均不含有SEQ ID No.1的第65-82位所示的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病中国南瓜；如果所述PCR产物为2条均含有SEQ ID No.1的第65-82位所示的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为非抗白粉病中国南瓜。
7.鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的方法，包括如下N1）和N2）：
N1）以待测中国南瓜基因组DNA为模板，采用权利要求3所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
N2）如下N21）或N22）：
N21）检测步骤N1）得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有191bp和173bp的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病中国南瓜；如果所述PCR产物含有173bp的DNA片段、不含191bp的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病中国南瓜；如果所述PCR产物不含有173bp的DNA片段、含有191bp的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为非抗白粉病中国南瓜；
N22）检测步骤N1）得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病中国南瓜；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为抗白粉病中国南瓜；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ ID No.2所示的DNA片段，所述待测中国南瓜为或候选为非抗白粉病中国南瓜。
8.鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的引物对，为权利要求1-3中任一所述A1。
9.鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的系统，由X1和X2组成；所述X1为权利要求1-3中任一所述A1，所述X2为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。
10.下述H1-H10中任一应用：
H1、权利要求1-3中任一所述中国南瓜白粉病分子标记在鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状中的应用；
H2、权利要求1-3中任一所述中国南瓜白粉病分子标记在鉴定或辅助鉴定白粉病抗性性状稳定遗传中国南瓜中的应用；
H3、权利要求1-3中任一所述中国南瓜白粉病分子标记在中国南瓜育种中的应用；
H4、权利要求4或5所述方法在鉴定或辅助鉴定白粉病抗性性状稳定遗传中国南瓜中的应用；
H5、权利要求4或5所述方法在中国南瓜育种中的应用；
H6、权利要求4所述鉴定中国南瓜基因型的方法在鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状中的应用；
H7、权利要求8所述引物对或权利要求9所述系统在制备鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状的试剂或试剂盒中的应用；
H8、权利要求8所述引物对或权利要求9所述系统在鉴定或辅助鉴定中国南瓜白粉病抗性性状中的应用；
H9、权利要求8所述引物对或权利要求9所述系统在鉴定或辅助鉴定白粉病抗性性状稳定遗传中国南瓜中的应用；
H10、权利要求8所述引物对或权利要求9所述系统在中国南瓜育种中的应用。
11.中国南瓜育种方法，按照权利要求4或5所述的方法鉴定中国南瓜的基因型，选择RR或RS基因型的中国南瓜作为亲本进行育种。
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