CN114381539B - 西葫芦zymv病毒病分子标记与鉴定西葫芦zymv病毒病抗性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种西葫芦ZYMV病毒病分子标记与鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性的方法，所述ZYMV病毒病分子标记多态性为西葫芦基因组中是否缺失序列表中SEQ ID No.1中第172‑196位所示的DNA片段。本发明获得了与抗病基因紧密连锁的分子标记7547962。利用获得的分子标记进行辅助选择，成功的将抗病基因通过杂交、回交转育的方法导入西葫芦优良自交系Teizer58中，使其获得ZYMV病毒病抗性。

Description

西葫芦ZYMV病毒病分子标记与鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性的 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中西葫芦ZYMV病毒病分子标记与鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的引物对。
背景技术
西葫芦(Cucurbita pepo L.)是我国重要的瓜类蔬菜，近年来栽培面积逐年扩大，保护地栽培面积仅次于黄瓜，已成为农民增收、农业结构调整的重要种植作物。
小西葫芦黄化花叶病毒病(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)是目前危害西葫芦等葫芦科作物生产的主要病害之一。植株感染ZYMV后会产生花叶、植株矮化畸形，果实表面瘤状凸凹不平、果肉僵硬且味苦涩等症状，使果实失去商品价值，导致产量损失可达60％以上，严重者甚至绝产。ZYMV病毒在世界范围内传播蔓延迅速，在我国西葫芦生产和制种中的危害也日趋严重和广泛(刘勇等2019)。
目前还没有防治ZYMV病毒病的有效试剂和措施，田间生产中主要依靠防治蚜虫、及时拔除掩埋发病植株来降低病毒病的传播与危害。培育和推广抗病品种是减少病毒病危害最为经济、安全、有效的措施。但目前，由于通过人工接种进行抗性鉴定存在操作繁琐、性状鉴定准确性差、易于杂染其它病毒致使育种中途选择失败等问题，导致抗性性状转育困难，抗病育种效率低、周期长、易失败等问题，生产上抗病品种少。与抗病基因紧密连锁的分子标记可以提高选择的准确性、加速抗病育种进程，在抗病育种中起到关键作用。因此，获得与西葫芦ZYMV抗病基因紧密连锁的分子标记，对提高西葫芦抗病育种效率，培育抗病新品种，保障西葫芦产业的健康发展具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或者辅助鉴定西葫芦的ZYMV病毒病抗性性状。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了西葫芦ZYMV病毒病分子标记。
本发明所提供的西葫芦ZYMV病毒病分子标记，为以西葫芦的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.1的第172位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第196位下游特异结合的单链DNA。
上述西葫芦分子标记的多态性可为西葫芦基因组中对应于SEQ ID No.1第172-196位为SEQ ID No.1第172-196位或缺失SEQ ID No.1第172-196位。
上述西葫芦分子标记中，所述P1可为SEQ ID No.1的第1-21位所示的单链DNA，所述P2可为与SEQ ID No.1的第297-316位反向互补的单链DNA。
本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性的方法，检测西葫芦的基因型鉴定或辅助鉴定西葫芦的ZYMV病毒病抗性；所述基因型为西葫芦基因组中ZYMV病毒病分子标记多态性的基因型，所述ZYMV病毒病分子标记多态性为西葫芦基因组中是否缺失序列表中SEQ ID No.1中第172-196位所示的DNA片段。
所述西葫芦基因组中ZYMV病毒病分子标记多态性的基因型为：以待测西葫芦基因组DNA为模板以A1为因为进行PCR扩增得到PCR产物，当PCR产物均为有否缺失序列表中SEQID No.1中第172-196位所示的DNA片段的DNA分子时，命名为RR基因型；当PCR产物均为含有序列表中SEQ ID No.1中第172-196位所示的DNA片段的DNA分子时，命名为SS基因型；当PCR产物同时具有含有序列表中SEQ ID No.1中第172-196位所示的DNA片段的DNA分子和缺失序列表中SEQ ID No.1中第172-196位所示的DNA片段的DNA分子时，命名为RR基因型；所述基因型为SS的西葫芦为感ZYMV病毒型西葫芦；所述所述基因型为RR或者RS的西葫芦为抗ZYMV病毒型西葫芦；
所述A1为由名称为P1和P2的单链DNA组成的引物对，所述P1为与SEQ ID No.1的第172位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第196位下游特异结合的单链DNA。
其中，所述P1为SEQ ID No.1的第1-21位所示的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第297-316位反向互补的单链DNA。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定西葫芦基因型的方法。
本发明所提供的鉴定西葫芦基因型的方法，所述基因型为RR基因型、RS基因型和SS基因型，所述方法为如下Ⅰ或Ⅱ：
Ⅰ、包括如下K1)和K2)：
K1)以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
K2)检测步骤K1)得到的PCR产物，根据所述PCR产物确定西葫芦基因型：
所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条不含有SEQ ID No.1的第172-196位所示的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为RR基因型；所述PCR产物含有一条不含有SEQ IDNo.1的第172-196位所示的DNA片段和一条含有SEQ ID No.1的第172-196位所示的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为RS基因型；所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条含有SEQID No.1的第172-196位所示的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为SS基因型；
Ⅱ、包括如下L1)和L2)：
L1)以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
L2)下述L21)或L22)：
L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物的大小确定西葫芦基因型：
所述PCR产物含有316bp和291bp的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为RS基因型；所述PCR产物含有316bp的DNA片段、不含有291bp的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为SS基因型；所述PCR产物不含有316bp的DNA片段、含有291bp的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为RR基因型；
L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物确定西葫芦基因型：
所述PCR产物含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为RS基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的的DNA片段，所述待测西葫芦的基因型为RR基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ ID No.2所示的的DNA片段，所述待测西葫芦的基因型为SS基因型。
上述鉴定西葫芦基因型的方法中，进行所述PCR扩增的体系可含有：10×buffer，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs，Taq DNA聚合酶，所述P1，所述P2，待测西葫芦基因组DNA。所述体系中dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均可为0.05mM，SEQ ID No.1和2所示单链DNA的终浓度均可为0.2μM，待测西葫芦基因组DNA的浓度可为30ng/μL。
进行所述PCR扩增的反应条件可为：95℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸25s，循环36次；72℃延伸10min。
上述鉴定西葫芦基因型的方法中，所述dNTPs具体可为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。所述Taq DNA聚合酶及10×buffer具体可为北京全式金生物技术有限公司产品，货号为AP101-01。
上述鉴定西葫芦基因型的方法中，所述RR基因型西葫芦和所述RS基因型西葫芦的抗ZYMV病毒病性均高于所述SS基因型西葫芦的抗ZYMV病毒病性。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的方法，可以具体为如下1)或2)：
1)包括如下M1)和M2)：
M1)以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
M2)检测步骤M1)得到的PCR产物，如果所述PCR产物含有一条不含有SEQ ID No.1的第172-196位所示的DNA片段和一条含有SEQ ID No.1的第172-196位所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗ZYMV病毒病西葫芦；如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条不含有SEQ ID No.1的第172-196位所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗ZYMV病毒病西葫芦；如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条含有SEQ ID No.1的第172-196位所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为非抗ZYMV病毒病西葫芦；
2)包括如下N1)和N2)：
N1)以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
N2)如下N21)或N22)：
N21)检测步骤N1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有316bp和291bp的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗ZYMV病毒病西葫芦；如果所述PCR产物含有291bp的DNA片段、不含316bp的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗ZYMV病毒病西葫芦；如果所述PCR产物不含有291bp的DNA片段、含有316bp的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为非抗ZYMV病毒病西葫芦；
N22)检测步骤N1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗ZYMV病毒病西葫芦；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗ZYMV病毒病西葫芦；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ ID No.2所示的的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为非抗ZYMV病毒病西葫芦。
上述鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的方法中进行所述PCR扩增的体系可为上述鉴定西葫芦基因型的方法中进行所述PCR扩增的体系，进行所述PCR扩增的反应条件可为上述鉴定西葫芦基因型的方法中进行所述PCR扩增的反应条件。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定抗ZYMV病毒病性状稳定遗传西葫芦的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定抗ZYMV病毒病性状稳定遗传西葫芦的方法，为如下I或II：
I、包括如下M1)和M2)：
M1)以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
M2)检测步骤M1)得到的PCR产物，如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条不含有SEQ ID No.1的第172-196位所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗ZYMV病毒病性状稳定遗传西葫芦；
II、包括如下N1)和N2)：
N1)以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
N2)如下N21)或N22)：
N21)检测步骤N1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有291bp的DNA片段、不含316bp的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗ZYMV病毒病性状稳定遗传西葫芦；
N22)检测步骤N1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗ZYMV病毒病性状稳定遗传西葫芦。
上述鉴定或辅助鉴定抗ZYMV病毒病性状稳定遗传西葫芦的方法中进行所述PCR扩增的体系可为上述鉴定西葫芦基因型的方法中进行所述PCR扩增的体系，进行所述PCR扩增的反应条件可为上述鉴定西葫芦基因型的方法中进行所述PCR扩增的反应条件。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的引物对。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的引物对，为所述A1。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的系统，由X1和X2组成；所述X1为所述A1，所述X2为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。
上述系统中，所述进行PCR扩增所需的试剂可含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTPs、Taq DNA聚合酶和/或PCR反应缓冲液，也可仅为所述dNTP混合物、所述Taq DNA聚合酶和/或所述PCR反应缓冲液；所述进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。所述dNTPs具体可为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。所述Taq DNA聚合酶及10×buffer具体可为北京全式金生物技术有限公司产品，货号为AP101-01。所述PCR仪具体可为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。
上述系统中，所述A1和所述进行PCR扩增所需的试剂均可独立包装。所述A1中的各引物对的两条单链DNA可独立包装。进行PCR扩增所需的各试剂均可独立包装。
上述鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的系统也可为仅含有所述A1和所述进行PCR扩增所需的试剂或试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述H1-H10中任一应用：
H1、所述西葫芦ZYMV病毒病分子标记在鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状中的应用；
H2、所述西葫芦ZYMV病毒病分子标记在鉴定或辅助鉴定ZYMV病毒病抗性性状稳定遗传西葫芦中的应用；
H3、所述西葫芦ZYMV病毒病分子标记在西葫芦育种中的应用；
H4、所述鉴定西葫芦基因型的方法或鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的方法在鉴定或辅助鉴定ZYMV病毒病抗性性状稳定遗传西葫芦中的应用；
H5、所述鉴定西葫芦基因型的方法或鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的方法在西葫芦育种中的应用；
H6、所述鉴定西葫芦基因型的方法在鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状中的应用；
H7、所述A1或所述系统在制备鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的试剂或试剂盒中的应用；
H8、所述A1或所述系统在鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状中的应用；
H9、所述A1或所述系统在鉴定或辅助鉴定ZYMV病毒病抗性性状稳定遗传西葫芦中的应用；
H10、所述A1或所述系统在西葫芦育种中的应用。
上述应用中，所述RR基因型西葫芦和所述RS基因型西葫芦的抗ZYMV病毒病性均高于所述SS基因型西葫芦的抗ZYMV病毒病性。
为解决上述技术问题，本发明还提供了西葫芦育种方法。
本发明所提供的西葫芦育种方法，按照所述鉴定西葫芦基因型的方法鉴定西葫芦的基因型，选择RR或RS基因型的西葫芦作为亲本进行育种。
本发明中，所述抗ZYMV病毒病西葫芦是指人工接种ZYMV病毒病后植株无病害症状或者表现轻微花叶的西葫芦，所述非抗ZYMV病毒病西葫芦是指人工接种ZYMV病毒病后植株高度花叶或叶片皱缩卷曲的西葫芦。
本发明中，所述A1的两条单链DNA的的摩尔数可为1:1。
本发明中，在检测PCR产物的大小时，可通过电泳检测，所述PCR产物含有316bp和291bp的DNA片段可表现为在200bp和400bp间有两条带，所述PCR产物含有291bp的DNA片段、不含316bp的DNA片段可表现为在200bp和300bp间有一条接近300bp的条带，所述PCR产物不含有291bp的DNA片段、含有316bp的DNA片段可表现为在300bp和400bp间有一条接近300bp的条带。
实验证明，利用本发明的西葫芦ZYMV病毒病分子标记可以鉴定西葫芦的ZYMV病毒病的抗性性状，以有不同ZYMV病毒病抗性性状的西葫芦基因组为模板，利用本发明的鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的引物对进行PCR扩增时得到的三种PCR产物对应于不同的西葫芦ZYMV病毒病抗性性状，当西葫芦的PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(316bp)不含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(291bp)时，西葫芦表现为感ZYMV病毒病，当西葫芦的PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(291bp)不含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(316bp)，该西葫芦表现为抗ZYMV病毒病，当西葫芦的PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(316bp)和SEQ ID No.2所示的DNA片段(291bp)，该西葫芦表现为抗ZYMV病毒病。表明可以利用鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的引物对A1和西葫芦ZYMV病毒病分子标记鉴定西葫芦的ZYMV病毒病的抗性情况。
本发明在西葫芦自交系葫8父中发现了一个ZYMV病毒病显性抗病基因CpZYMV，其优异的抗病表现在西葫芦抗病育种中具有重要的利用价值。本发明获得了与抗病基因紧密连锁的分子标记7547962。利用获得的分子标记进行辅助选择，成功的将抗病基因通过杂交、回交转育的方法导入西葫芦优良自交系Teizer58中，使其获得ZYMV病毒病抗性。
附图说明
图1为分子标记7547962与西葫芦抗病基因CpZYMV的遗传连锁图，左边为标记间的图距。
图2为分子标记7547962扩增带型。其中P1为抗病亲本葫8父，P2为感病亲本Teizer58，F1为杂交一代；1-23为F2单株；M：Trans DNA markerI。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的西葫芦自交系葫8父和西葫芦自交系Teizer58，在《利用分子标记和单倍体技术进行西葫芦抗ZYMV的种质创新研究》中公开，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的dNTPs为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。TaqDNA聚合酶及10×buffer具体可为北京全式金生物技术有限公司产品，货号为AP101-01。PCR仪为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。
实施例1、西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的鉴定
本实施例利用鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的引物对A1对西葫芦的ZYMV病毒病抗性性状进行鉴定，A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，P1为SEQ ID No.1的第1-21位所示的单链DNA(P1：7547962F，TGCACTCCAGAAGATCGTCAT)，P2为与SEQ ID No.1的第297-316位反向互补的单链DNA(P2：7547962R，CTGCTTGAGCTTGCTATCCC)。
1、待鉴定西葫芦如下，每种西葫芦均选择50株进行试验：
西葫芦自交系Teizer58，其表型为感ZYMV病毒病；
西葫芦自交系葫8父，其表型为抗ZYMV病毒病；
爱绿1号，其表型为感ZYMV病毒病，为北京爱普绿农业科技有限公司产品；
亮丽，其表型为感ZYMV病毒病，为济南学超种业有限公司产品；
春韵二号，其表型为感ZYMV病毒病，为东方正大种子有限公司产品；
欣瑞1438，其表型为抗ZYMV病毒病，为济南天瑞种子有限公司产品；
406西葫芦，其表型为抗ZYMV病毒病，为中国种子集团有限公司产品；
玉钻，其表型为抗ZYMV病毒病，为昌吉市艾格瑞特种业有限公司产品；
万盛碧秀2号，其表型为抗ZYMV病毒病，为寿光万盛种业有限公司产品；
西玉，其表型为抗ZYMV病毒病，为北京中川绿禾农业科技有限公司产品；
法国夏绿，其表型为抗ZYMV病毒病，为北农亨利种子有限公司产品；
法国丽莎，其表型为感ZYMV病毒病，为北农亨利种子有限公司产品；
瑞丰九号F1，其表型为抗ZYMV病毒病，为北京中农绿亨种子科技有限公司产品；
绿美人，其表型为抗ZYMV病毒病，为昆明市坤华种子有限公司产品；
京葫42，其表型为抗ZYMV病毒病，为京研益农(北京)科技种业有限公司产品。
京葫36，其表型为感ZYMV病毒病，为京研益农(北京)科技种业有限公司产品；
绿帅二号，其表型为抗ZYMV病毒病，为北京帅天农业有限公司产品。
2、西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的鉴定
用CTAB法(Sue Porebski L.,1997)提取上述各西葫芦幼嫩叶片的基因组DNA，分别利用引物对A1进行PCR扩增。
利用引物对A1进行PCR扩增的15μL反应体系为：10×buffer 1.5微升，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs 0.3微升，Taq DNA聚合酶0.2微升，P1，P2，西葫芦基因组DNA 30ng，以无菌的超纯水补足15微升，使P1和P2的终浓度均为0.2μM。在PCR仪中进行PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸25s，循环36次；72℃延伸10min。将反应产物一部分进行测序，一部分在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上160V电泳70min，经银染后于灯箱下观察，记载。
以上各西葫芦的PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序结果如表1所示，表1中316bp的PCR产物表示SEQ ID No.1所示的DNA片段，291bp的PCR产物表示SEQ ID No.2所示的DNA片段。然后鉴定各西葫芦的ZYMV病毒病抗性的情况，PCR产物与表型的关系如表1所示。
利用A1在以不同西葫芦基因组DNA为模板进行PCR扩增时，PCR产物共有三种情况：第一种情况是PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(316bp)不含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(291bp)，第二种情况是PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(291bp)不含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(316bp)，第三种情况是PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(316bp)和SEQ ID No.2所示的DNA片段(291bp)。根据PCR扩增产物定义西葫芦的基因型，将PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(316bp)不含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(291bp)的情况命名为SS基因型；将PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(291bp)不含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(316bp)命名为RR基因型；将PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(316bp)和SEQ ID No.2所示的DNA片段(291bp)命名为RS基因型。其中，RR基因型和SS基因型均可稳定遗传。
将以西葫芦的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行PCR扩增得到的DNA分子命名为西葫芦ZYMV病毒病分子标记，西葫芦ZYMV病毒病分子标记的多态性为西葫芦基因组中对应于SEQ ID No.1为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2。
表1、不同西葫芦PCR产物和ZYMV病毒病抗性表型分析结果
结果表明，当西葫芦的PCR产物为第一种情况(即西葫芦的基因型为SS基因型)时，该西葫芦表现为感ZYMV病毒病，当西葫芦的PCR产物为第二种情况(即西葫芦的基因型为RR基因型)，该西葫芦表现为抗ZYMV病毒病，当西葫芦的PCR产物为第三种情况(即RS基因型)时，该西葫芦表现为抗ZYMV病毒病。PCR产物的三种情况(或西葫芦的SS、RR和RS基因型)与西葫芦的ZYMV病毒病的抗性情况完全一致，表明可以利用鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状的引物对A1鉴定西葫芦ZYMV病毒病的抗性情况。
实施例2、与西葫芦ZYMV病毒病显性抗病基因CpZYMV紧密连锁的InDel分子标记的获得方法
将实施例1的西葫芦ZYMV病毒病分子标记命名为分子标记7547962，本实施例具体描述了所述的与西葫芦ZYMV病毒病显性抗病基因CpZYMV紧密连锁的InDel分子标记7547962的获得方法，包括以下步骤：
(一)西葫芦自交系葫8父与Teizer58F2代的创建与表型鉴定：
(1)西葫芦自交系葫8父(母本，P1)与Teizer58(父本，P2)进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2代群体。
(2)将192株F2代群体单株种植于温室营养钵内，外罩防虫网，子叶完全展开后接种ZYMV病毒病，接种15天后进行抗病性状调查。
用CTAB法(Sue Porebski L.,1997)提取上述将192株F2代群体单株的幼嫩叶片的基因组DNA，分别利用引物对A1进行PCR扩增。
利用引物对A1进行PCR扩增的15μL反应体系为：10×buffer 1.5微升，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs 0.3微升，Taq DNA聚合酶0.2微升，P1，P2，西葫芦基因组DNA 30ng，以无菌的超纯水补足15微升，使P1和P2的终浓度均为0.2μM。在PCR仪中进行PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸25s，循环36次；72℃延伸10min。将反应产物一部分进行测序，一部分在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上160V电泳70min。鉴定结果见表2和表3所示。
表2、接种ZYMV病毒病后Teizer58×葫8父F2代群体遗传分析
抗、感分别代表抗病单株、感病单株。χ2 0.05,1＝3.84。
表3、192株F2代群体单株PCR产物和ZYMV病毒病抗性表型分析结果
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(3)F2代单株进行性状调查后将感病植株移栽于温室种植，自交所得种子为F3家系。每个F3家系中选择10粒种子进行子代抗病性测验，以验证F2代感病单株是否携带纯合感病基因。
(4)通过对F2代单株进行遗传分析，发现西葫芦自交系葫8父携带一个显性抗病基因。
(二)多态性分子标记筛选
(5)将10株抗病F2单株的叶片等量混成抗池，10株感病F2单株的叶片等量混成感池。用CTAB法(Sue Porebski L.,1997)提取抗病亲本葫8父、感病亲本Teizer58、抗池和感池的DNA，应用InDel分子标记与BSA(Bulk Segregant Analysis)结合的方法进行多态性分子标记筛选。
(6)首先利用本课题组在西葫芦20条染色体上设计合成的756对InDel标记引物，对葫8父、Teizer58、抗池和感池进行多态性筛选；
PCR反应体积为15μL，其中10×buffer 1.5μL，2.5mM dNTPs 0.3μL，Tag酶(5单位/μL)0.2μL，10μM引物(F/R)各0.3μL，模版DNA 30ng，加ddH2O至15μL；
InDel标记的反应条件为DNA 95℃预变性3min后，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸25s，循环36次，最后72℃延伸10min；
在PCR扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染后照相记录结果；
选择在亲本间和F2代群体的抗、感池间扩增出相同有多态型的引物，与抗病基因CpZYMV连锁的候选分子标记共3个；
(三)紧密连锁分子标记的获得
(7)根据连锁交换规律，利用3个候选分子标记在纯合感病单株间的基因型资料与单株的抗性资料，构建分子标记与CpZYMV基因的连锁图谱，所用软件为Mapmaker/EXP 3.0，获得了与抗病基因CpZYMV紧密连锁的分子标记7547962，遗传连锁距离为0.3cM(图1)；
(四)抗病基因CpZYMV向感病西葫芦自交系的转移
(8)利用获得的与抗病基因CpZYMV紧密连锁的分子标记7547962，通过杂交、回交转育及自交纯化将抗病基因导入西葫芦优良感病自交系中(图2)。利用上述策略，成功改良西葫芦优良感病自交系Teizer58，使其携带CpZYMV抗病基因具备了ZYMV病毒病抗性。
西葫芦种质资源中蕴含丰富的基因资源，高效充分的利用这些基因资源对于西葫芦新品种培育具有重要作用。本发明通过将抗病种质葫8父与感病自交系Teizer58杂交，经遗传分析确定抗病材料中携带有一个显性的抗病基因，通过构建抗病性状分离群体，经多态性分子标记筛选，构建了抗病基因CpZYMV与分子标记7547962的遗传连锁图谱。利用分子标记辅助选择，经杂交及回交转育，成功将抗病基因CpZYMV转育到西葫芦优良感病自交系Teizer58中，使其获得了ZYMV病毒病抗性。在传统育种方法中，由于缺乏与ZYMV病毒病抗病基因连锁的分子标记，每代的抗病基因转移均需要进行抗性接种鉴定，耗时耗力，且常常由于鉴定准确性差的问题导致选育失败。因此，分子标记7547962的开发可以在苗期简便准确的筛选含有抗病基因CpZYMV的单株，大大节省抗病材料的筛选时间和育种劳动量，提高选择的准确性，加快了抗ZYMV病毒病新品种的培育速度。
本发明获得与西葫芦ZYMV病毒病抗病基因CpZYMV紧密连锁的共显性InDel分子标记7547962。InDel标记7547962与抗病基因的遗传距离为0.3cM。利用该标记能够通过辅助选择鉴定将抗病基因成功导入其它西葫芦感病优良自交系，使之获得抗病性状。分子标记具有扩增稳定、检测方便、快速准确等优点。用标记7547962检测西葫芦抗病基因CpZYMV，可以确定抗病基因是否存在以及存在状态，并预测植株对ZYMV病毒病的抗性，加快该抗病基因的利用。本发明提出了利用西葫芦ZYMV病毒病抗病种质资源葫8父中抗病基因的方法：利用分子标记筛选，通过杂交与回交转育将抗病基因导入西葫芦优良的感病自交系中，利用该方法成功将抗病基因CpZYMV导入西葫芦优良自交系Teizer58，使其获得了ZYMV病毒病抗性，并能稳定遗传(见表4)。
表4西葫芦ZYMV抗病基因CpZYMV向优良自交系Teizer58的转育
注：H，指选择抗病、PCR产物为316pb+291bp、基因型为RS的单株；R，指选择抗病、PCR产物为291bp、基因型为RR的单株
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 西葫芦ZYMV病毒病分子标记与鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 316
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcactccag aagatcgtca ttaatgcaaa agtttttgta ggagataatc tcgtcctcca 60
taattggaat gctattattg aggaaattgt cttcaatatc atcaaattca tctacagcat 120
catagaaaat ttctcctgaa aaatggcatt gaaaatgaaa ttgtgaagtg gacactttcg 180
agaccatcgc tggcgaactg aaacatctta gtagccagag gaaaagaaag caaaagtgat 240
tcccgtagta gcggcaagcg aaatgggagc agcctaaacc gtgaaaatgg ggttgtggga 300
tagcaagctc aagcag 316
<210> 2
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcactccag aagatcgtca ttaatgcaaa agtttttgta ggagataatc tcgtcctcca 60
taattggaat gctattattg aggaaattgt cttcaatatc atcaaattca tctacagcat 120
catagaaaat ttctcctgaa aaatggcatt gaaaatgaaa ttgtgaagtg gactgaaaca 180
tcttagtagc cagaggaaaa gaaagcaaaa gtgattcccg tagtagcggc aagcgaaatg 240
ggagcagcct aaaccgtgaa aatggggttg tgggatagca agctcaagca g 291

Claims (5)

1.一种鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性的方法，其特征在于，检测西葫芦的基因型鉴定或辅助鉴定西葫芦的ZYMV病毒病抗性；所述基因型为西葫芦基因组中ZYMV病毒病分子标记多态性的基因型，所述分子标记由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成；
所述西葫芦基因组中ZYMV病毒病分子标记多态性的基因型为：以待测西葫芦基因组DNA为模板以A1为引物进行PCR扩增得到PCR产物，当PCR产物均为序列表中SEQ ID NO:2所示的DNA分子时，命名为RR基因型；当PCR产物均为序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子时，命名为SS基因型；当PCR产物同时具有含有序列表中SEQ ID No.1和序列表中SEQ ID NO:2所示的DNA分子时，命名为RS基因型；所述基因型为SS的西葫芦为感ZYMV病毒型西葫芦；所述所述基因型为RR或者RS的西葫芦为抗ZYMV病毒型西葫芦；
所述A1为由名称为P1和P2的单链DNA组成的引物对，P1为SEQ ID No.1的第1-21位所示的单链DNA，P2为与SEQ ID No.1的第297-316位反向互补的单链DNA。
2.西葫芦ZYMV病毒病分子标记，其特征在于，所述分子标记由SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2组成，如果西葫芦基因组含有SEQ ID NO:2的DNA片段，所述西葫芦为或候选为抗ZYMV病毒病的西葫芦。
3.一种西葫芦的育种方法，其特征在于，按照权利要求1中所述的鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性的方法检测西葫芦的基因型，选取基因型为RR或RS的西葫芦作为亲本进行育种。
4.下述H1-H3中任一应用：
H1、权利要求1所述方法或权利要求2所述西葫芦ZYMV病毒病分子标记在鉴定或辅助鉴定西葫芦ZYMV病毒病抗性性状中的应用；
H2、权利要求1所述方法或权利要求2所述西葫芦ZYMV病毒病分子标记在鉴定或辅助鉴定ZYMV病毒病抗性性状稳定遗传西葫芦中的应用；
H3、权利要求1所述方法或权利要求2所述西葫芦ZYMV病毒病分子标记在西葫芦育种中的应用。
5.一种鉴定或辅助鉴定抗ZYMV病毒病性状稳定遗传西葫芦的方法，包括如下N1）和N2）：
N1）以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用权利要求1所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；
N2）如下N21）或N22）：
N21）检测步骤N1）得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有291bp的DNA片段、不含316bp的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗ZYMV病毒病性状稳定遗传西葫芦；
N22）检测步骤N1）得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗ZYMV病毒病性状稳定遗传西葫芦。
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