JP2017163899A - 植物ウイルスの接種方法、植物ウイルスによる病害に対する抵抗性を付与された植物の生産方法、および植物ウイルスによる病害に抵抗性の植物の検出方法 - Google Patents
植物ウイルスの接種方法、植物ウイルスによる病害に対する抵抗性を付与された植物の生産方法、および植物ウイルスによる病害に抵抗性の植物の検出方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 本発明の植物ウイルスの接種方法は、植物ウイルスを種子内に導入することにより、前記植物ウイルスを前記種子に接種する接種工程を含むことを特徴とする。本発明の接種方法は、例えば、前記植物ウイルスを含むウイルス液の存在下、前記種子内の空隙の空気を排出することにより、前記植物ウイルスを前記種子内に導入する。
【選択図】 なし
Description
前記付与工程が、前記本発明の接種方法により実施されることを特徴とする。
前記対象種子を生育させ、生育させた植物における前記植物ウイルスの感染を検出する検出工程を含み、
前記感染工程が、前記本発明の接種方法により実施されることを特徴とする。
本発明の植物ウイルスの接種方法は、前述のように、植物ウイルスを種子内に導入することにより、前記植物ウイルスを前記種子に接種する接種工程を含むことを特徴とする。本発明の接種方法は、前記植物ウイルスを前記種子内に導入することにより、前記植物ウイルスを前記種子に接種する接種工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は特に制限されない。
(1)TYLCVと、ナス科植物(例えば、トマト)との組合せ
(2)CMVと、ナス科植物、ウリ科植物、アブラナ科植物、またはキク科植物との組合せ
(3)ZYMVと、ウリ科植物との組合せ
(4)WMVと、ウリ科植物またはマメ科植物との組合せ
(5)PRSVと、ウリ科植物との組合せ
(6)TuMVと、アブラナ科植物との組合せ
(7)TMVと、ナス科植物、マメ科植物、またはキク科植物との組合せ
(8)ToMVと、ナス科植物(トマト)との組合せ
(9)PMMoVと、ナス科植物(例えば、ピーマンまたはトウガラシ)との組合せ
本発明の植物ウイルスによる病害に対する抵抗性を付与された植物の生産方法は、前述のように、弱毒化植物ウイルスを種子に接種することにより、前記植物ウイルスの病害に対する抵抗性を前記種子に付与する付与工程を含み、前記付与工程が、前記本発明の接種方法により実施されることを特徴とする。本発明の生産方法は、前記付与工程が、前記本発明の接種方法により実施されることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の生産方法によれば、例えば、簡便に植物に植物ウイルスに対する抵抗性を付与できる。このため、本発明の生産方法によれば、例えば、前記植物ウイルスに対する抵抗性により、前記植物ウイルスによる病害が防除された種子等の植物を生産できる。本発明の生産方法は、例えば、前記本発明の接種方法の説明を援用できる。前記弱毒化植物ウイルスは、例えば、前記植物ウイルスでもよい。
本発明の植物ウイルスによる病害に抵抗性の植物の検出方法は、前述のように、植物ウイルスを対象種子に接種することにより、前記対象種子に前記植物ウイルスを感染させる感染工程、および前記対象種子を生育させ、生育させた植物における前記植物ウイルスの感染を検出する検出工程を含み、前記感染工程が、前記本発明の接種方法により実施されることを特徴とする。本発明の検出方法は、前記感染工程が、前記本発明の接種方法により実施されることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の検出方法によれば、例えば、簡便に植物に植物ウイルスに対する抵抗性の植物を検出できる。このため、本発明の検出方法によれば、例えば、前記対象種子から生育させた植物の前記植物ウイルスに対する抵抗性の有無または程度を簡便に検出できる。また、本発明の検出方法によれば、例えば、前記植物ウイルスに対する抵抗性の有無または程度を簡便に検出できるため、例えば、前記植物ウイルスによる病害に抵抗性の植物をスクリーニングできる。このため、本発明の検出方法は、例えば、植物ウイルスによる病害に抵抗性の植物のスクリーニング方法ということもできる。本発明の検出方法は、例えば、前記本発明の接種方法の説明を援用できる。
本発明の接種方法により、植物ウイルスを種子に導入できることを確認した。
ポリエチレン製磨砕袋(高尾製作所社製)に、1重量部の凍結保存したTYLCV感染トマトの根と、2重量部0.1mol/L リン酸カリウム緩衝液とを添加後、磨砕した。得られた磨砕液を15mLマイクロチューブに移し、遠心分離機(MX−160、TOMY社製)を用い、20631gの条件下で遠心した。前記遠心後、上清をウイルス液として回収し、他のマイクロチューブに移した。
シャーレ(Φ9cm)に滅菌水で湿らせた濾紙(定性濾紙No.2、ADVANTEC社製)を配置し、市販のトマトの乾燥種子(ハウス桃太郎、タキイ種苗社製)をシャーレあたり40粒、濾紙上に播種した。前記播種後、恒温器を用い、24℃、暗黒条件下で3日保温し、前記トマト種子を発根させた。つぎに、昆虫微針(志賀昆虫普及社製)を用い、各発根種子について、幼根を2〜3カ所刺傷した。
前記ウイルス液を有するマイクロチューブに、前記刺傷後の発根種子を導入後、遠心式濃縮機(DNA mini、Heto社製)を用い、陰圧(約0.001MPa(デフォルトの設定:大気圧から0.1MPa減圧))条件下で10分遠心することにより、前記ウイルス液を前記種子内に導入した。
ニッピ(日本肥料社製)およびナウエル(イセキ社製)を等量混合した育苗培土に、前記導入後の種子を播種し、前記恒温器を用い、25℃の条件下で育苗した。前記播種後、14〜30日目に上位葉の葉片を採取した。そして、前記葉片について、下記参考文献の方法に準じて、全DNAを抽出し、PCRを実施した。得られた増幅断片について、2%アガロースゲルを用い電気泳動後、Sybr(登録商標)Safe(Thermo Fisher Scientific社製)で染色し、イルミネーター下で観察することで、TYLCVの感染の有無を確認した(n=13)。また、同様の接種を再度行い、TYLCVの感染の有無を確認した(n=13)。これらの結果を表1に示す。
参考文献:Gian Paolo Accotto et.al., “Typing of tomato yellow leaf curl viruses in Europe”, European Journal of Plant Pathology, 2000, vol.106, pages.179-186
つぎに、1重量部の凍結保存したTYLCV感染トマトの根と、10重量部0.1mol/L リン酸カリウム緩衝液とを添加することでウイルス液を調製した以外は、前記(1)〜(4)と同様にして、TYLCVの感染の有無を確認した(n=21)。また、同様の接種を2回行い、TYLCVの感染の有無を確認した(n=24または20)。これらの結果を表2に示す。
つぎに、1重量部の凍結保存したTYLCV感染トマトの根と、10重量部0.06mol/L ヒスチジン緩衝液とを添加することでウイルス液を調製した以外は、前記(1)〜(4)と同様にして、TYLCVの感染の有無を確認した(n=15)。また、同様の接種を2回行い、TYLCVの感染の有無を確認した(n=10または14)。これらの結果を表3に示す。
TYLCV感染トマトの根に代えて、TYLCV感染トマトの葉を用い、1重量部のTYLCV感染トマトの葉と、10重量部0.1mol/L リン酸カリウム緩衝液とを添加することでウイルス液を調製した以外は、前記(1)〜(4)と同様にして、TYLCVの感染の有無を確認した(n=20)。また、同様の接種を2回行い、TYLCVの感染の有無を確認した(n=22または20)。これらの結果を表4に示す。
ウイルス液と種子とを含む導入系について減圧することにより、植物ウイルスを種子に導入できることを確認した。
ウイルス液は、前記実施例1(1)と同様にして、調製した。
前記恒温器において、2日保温し、吸水させた以外は、前記実施例1(2)と同様にし、吸水種子を調製した。
前記ウイルス液を有するマイクロチューブに、前記吸水種子を導入後、前記マイクロチューブを真空ゲージ付きデシケーター内に配置した。そして、ダイヤフラム式真空ポンプ(DAH−60、ULVAC社製)を用いて脱気し、大気圧(A)から0.1MPaを減圧し、前記圧力条件(A−0.1MPa)で10分間処理することにより、前記ウイルス液を前記種子内に導入した。
前記導入後の種子について、前記実施例1(4)と同様にして、TYLCVの感染の有無を確認した(n=20)。また、同様の接種を2回行い、TYLCVの感染の有無を確認した(n=20または19)。これらの結果を表5に示す。
ウイルス液の温度を、減圧時の導入系の圧力において、水の沸点以上の温度とすることにより、植物ウイルスを種子に導入する効率のばらつきが抑制されることを確認した。
本発明の接種方法により、植物ウイルスを乾燥種子に導入できることを確認した。
ウイルス液は、前記実施例1(1)と同様にして、調製した。
前記ウイルス液を有するマイクロチューブに、前記トマト種子を浸漬後、前記浸漬後の種子を回収し、他のマイクロチューブに導入した。そして、前記吸水種子を導入したマイクロチューブに代えて、前記浸漬後の種子を導入したマイクロチューブを用いた以外は、前記実施例2(3)と同様にして、TYLCVの感染の有無を確認した(n=17)。この結果を表7に示す。
本発明の接種方法により、異なる植物ウイルスを種子に導入できることを確認した。
弱毒化CMVのウイルス液および弱毒化WMVのウイルス液は、それぞれ、弱毒化CMV感染を感染させたキュウリ(相模半白節成、タキイ種苗社製)の葉および弱毒化WMV感染キュウリの葉から調製したウイルス液を30倍に濃縮した濃縮ウイルス液から、調製した。具体的には、前記濃縮ウイルス液を、0.1mol/L リン酸カリウム緩衝液を10倍(容量比)に希釈することで調製した。また、弱毒化ZYMVのウイルス液は、弱毒化ZYMVの製剤(キュービオZY−02、微生物化学研究所社製)を、蒸留水で10倍(重量比)に希釈することで調製した。
前記トマト種子に代えて、キュウリ種子(相模半白節成、タキイ種苗社製)を用い、前記実施例1(1)のウイルス液に代えて、前記実施例5(1)のウイルス液をそれぞれ用いた以外は、前記実施例1(2)および(3)と同様にして、発根種子の調製および植物ウイルスの導入を実施した。
前記導入後のトマト種子に代えて、前記導入後のキュウリ種子を用いた以外は、前記実施例1(4)と同様にして、前記播種後、14〜30日目に上位葉の葉片を採取した。そして、前記葉片について、CMV、WMVおよびZYMVのそれぞれに特異的な抗体を用いて、二重抗体サンドイッチ法(Das−ELISA法)により、CMV、WMVおよびZYMVを、それぞれ検出した(CMV:n=20、WMV:n=19、ZYMV:n=17)。なお、各ウイルスに対する精製抗体および酵素標識抗体は、各ウイルスの抗血清から自家調製したものを用いた。これらの結果を表8に示す。
Claims (16)
- 植物ウイルスを種子内に導入することにより、前記植物ウイルスを前記種子に接種する接種工程を含むことを特徴とする、植物ウイルスの接種方法。
- 前記植物ウイルスを含むウイルス液の存在下、前記種子内の空隙の空気を排出することにより、前記植物ウイルスを前記種子内に導入する、請求項1記載の接種方法。
- 前記種子および前記ウイルス液を含む導入系の圧力を、大気圧未満の圧力に減圧することにより、前記植物ウイルスを前記種子内に導入する、請求項2記載の接種方法。
- さらに、前記導入系の圧力を解放することにより、前記導入系の圧力を大気圧に戻す解放工程を含む、請求項3記載の接種方法。
- 前記ウイルス液の温度が、前記減圧時の導入系の圧力において、水の沸点以上の温度である、請求項3または4記載の接種方法。
- 前記種子内の空隙が、前記種子の種皮より内側の空隙である、請求項2から5のいずれか一項に記載の接種方法。
- 前記種子が、被傷された種子である、請求項1から6のいずれか一項に記載の接種方法。
- 前記種子が、乾燥種子、吸水種子、および発根種子からなる群から選択された少なくとも1つである、請求項1から7のいずれか一項に記載の接種方法。
- 前記種子が、ナス科植物、ウリ科植物、アブラナ科植物、ヒユ科植物、セリ科植物、およびマメ科植物からなる群から選択された少なくとも1つの植物の種子である、請求項1から8のいずれか一項に記載の接種方法。
- 前記植物ウイルスが、ジェミニウイルス科ウイルス、ブロモウイルス科ウイルス、ポティウイルス科ウイルス、およびヒルガウイルス科ウイルスからなる群から選択された少なくとも1つである、請求項1から9のいずれか一項に記載の接種方法。
- さらに、前記種子を生育させる生育工程を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の接種方法。
- さらに、前記植物ウイルスを調製する調製工程を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の接種方法。
- 弱毒化植物ウイルスを種子に接種することにより、前記植物ウイルスの病害に対する抵抗性を前記種子に付与する付与工程を含み、
前記付与工程が、請求項1から12のいずれか一項に記載の接種方法により実施されることを特徴とする、植物ウイルスによる病害に対する抵抗性を付与された植物の生産方法。 - 植物ウイルスを対象種子に接種することにより、前記対象種子に前記植物ウイルスを感染させる感染工程、および
前記対象種子を生育させ、生育させた植物における前記植物ウイルスの感染を検出する検出工程を含み、
前記感染工程が、請求項1から12のいずれか一項に記載の接種方法により実施されることを特徴とする、植物ウイルスによる病害に抵抗性の植物の検出方法。 - さらに、前記生育させた植物における感染の検出により、前記植物ウイルスによる病害に対する抵抗性を判断する判断工程を含む、請求項14記載の検出方法。
- さらに、前記植物ウイルスによる病害に抵抗性の植物を選抜する選抜工程を含む、請求項14または15記載の検出方法。
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