CN109777826A - 小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体，该侵染性克隆表达载体是由小西葫芦黄花叶病毒全基因组通过同源重组的方式克隆到含有花椰菜花叶病毒35S启动子的pCambia0390双元载体上制备得到；所述小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。本发明构建得到能通过农杆菌浸润方法接种并稳定高效侵染甜瓜、西葫芦等寄主植物的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆，该侵染性克隆同时还能高效表达外源蛋白。

Description

小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体及其构建方法。

背景技术

马铃薯Y病毒属(Potyvirus)是植物RNA病毒中最大的属，能够侵染约有27属170多种植物。小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)主要成员之一，能够侵染甜瓜、黄瓜、西葫芦、中国南瓜、笋瓜、丝瓜、西瓜等多种葫芦科作物，对农作物生产造成重大的经济损失。Potyvirus作为RNA病毒，不易分离纯化，也难以开展相关反向遗传学研究。而构建Potyvirus病毒的全长基因组cDNA侵染性克隆则克服了其难以进行遗传操作的难题，同时Potyvirus病毒采用多聚蛋白策略，可以利用该特点构建超表达载体。因此获得马铃薯Y病毒属的侵染性克隆表达载体具有广泛应用前景。

侵染性克隆是指将病毒全长基因组序列构建在特定载体上，且具有侵染宿主的功能。根据病毒基因组(DNA或RNA)类型不同，通常分为全长DNA侵染性克隆或全长cDNA侵染性克隆。但全长性的侵染性cDNA克隆构建技术性较强，构建工作中存在病毒基因组对大肠杆菌有毒性、构建克隆无侵染性以及载体不稳定等难题，已成为限制马铃薯Y病毒属病毒表达载体构建的瓶颈。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体及其构建方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体，命名为pCaZYMV，该侵染性克隆表达载体是由小西葫芦黄花叶病毒全基因组通过同源重组的方式克隆到改造过的pCambia0390双元载体pCa35S(在pCambia0390的基础上添加35S启动子)上制备得到；所述小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明的第二方面，提供上述小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)从感染小西葫芦黄花叶病毒的发病株中提纯病毒粒子，并提取病毒粒子中的RNA；

(2)以步骤(1)的RNA为模板进行反转录，以反转录产物为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列作为特异性引物进行PCR扩增，获得小西葫芦黄花叶病毒全基因组；

(3)通过同源重组的方法将小西葫芦黄花叶病毒全基因组连接到改造过的pCambia0390双元载体pCa35S(在pCambia0390的基础上添加35S启动子)，即得到小西葫芦黄花叶病毒全基因组侵染性克隆表达载体。

优选的，步骤(2)中，反转录的反应程序为：将模板RNA、Oligo d(T)₁₈、SEQ ID NO.2所示的引物、dNTP和RNase free dH₂O混合，65℃保温5min，迅速置于冰上冷却2min，瞬间离心；再加入5×SSIV Buffer(Thermo Fisher)、DDT、RNA酶抑制剂(RRI)和SuperScript IVReverse Transcriptase(Thermo Fisher)；55℃，45min；80℃，10min，终止反应；再加入RNase H，37℃，1min。

优选的，步骤(2)中，PCR扩增的反应体系包括：HF buffer 10μL、dNTP 1μL、SEQ IDNO.1所示的引物1μL、SEQ ID NO.2所示的引物1μL、模板2μL、Phusion高保真聚合酶0.3μL、dH₂O 34.7μL。

优选的，步骤(2)中，PCR扩增的反应程序为：

1)98℃，预变性，30s；

2)98℃，变性，10s；72℃，退火、延伸，5min 30s；共32个循环；

3)72℃，后延伸，10min。

利用RNA反转录酶，可能会由于反转录能力不足导致难以获得含有病毒全长的cDNA，本发明采用了反转录能力强的SuperScript IV Reverse Transcriptase(ThermoFisher)反转录酶，可以获得具有病毒全长的cDNA。DNA聚合酶构建基因组较长的病毒的侵染性克隆时，可能会在序列上产生错配，导致cDNA克隆丧失侵染性。本发明通过对PCR扩增体系的优化，利用本发明优化后PCR扩增体系，通过一个PCR反应就可扩增得到小西葫芦黄花叶病毒全基因组，极大降低了PCR过程中可能出现的差错率，保证了后续构建的cDNA克隆的侵染性；而改变反转录体系和PCR扩增体系的组成，则PCR过程中差错率大大提高。

优选的，步骤(3)中，利用同源重组方法将小西葫芦黄花叶病毒基因组连接到双元载体后，转化大肠杆菌，培养温度为28℃。

本发明的第三方面，提供上述小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体在表达外源蛋白中的应用。

根据上述应用，具体的应用方法为：将带有NIa蛋白酶识别位点的外源蛋白基因序列通过同源重组方法插入到所述小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体的NIb和CP之间，获得含有外源蛋白基因的侵染性克隆表达载体，然后转化农杆菌，再通过农杆菌浸润方法接种寄生植物，表达外源蛋白。

优选的，上述应用中，所述外源蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。

本发明的第四方面，提供上述小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体在使植株获得交叉保护中的应用。

本发明的第五方面，提供一种重组农杆菌菌株，由上述的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体或者含有外源蛋白基因的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体导入到农杆菌中获得。

本发明的有益效果：

(1)本发明构建得到能通过农杆菌浸润方法接种并稳定高效侵染甜瓜、西葫芦等寄主植物的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆。

(2)本发明制备的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆可以作为外源基因表达载体使用，能够高效表达外源蛋白。

附图说明

图1：pCaZYMV侵染性克隆表达载体构建策略(A)及应用示例(B)；

图2：pCaZYMV侵染性克隆的侵染性测定；

图3：pCaZYMV侵染性克隆侵染寄主后PCR检测结果；

图4：pCaZYMV侵染性克隆表达外源蛋白效果鉴定。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术中所介绍的，由于全长侵染性cDNA克隆的构建涉及的技术性较强，其构建工作仍是十分困难，存在诸多的技术难点，例如：1)由于不同植物病毒的基因组结构不同，构建病毒侵染性克隆时首先需要将病毒RNA反转录成cDNA，对于基因组较长的病毒来说，由于RNA纯度、反转录酶反转录能力及DNA聚合酶扩增效率等会影响全基因组的获得。2)在构建病毒侵染性克隆的过程中，在病毒基因组5′端和3′端引入非病毒核苷酸序列也会对转录物的侵染性产生很大影响，使侵染性降低甚至丧失。3)RNA病毒基因组转变为cDNA后需要克隆到载体中才能进行体外转录，但并不是任何载体都能克隆全长病毒基因组，因此载体的选择非常重要。4)含有病毒cDNA的双元载体转入宿主菌时，部分序列对宿主菌具有毒性导致载体很不稳定，本发明优选的低温条件减少了毒性问题。。基于上述原因，目前只有为数不多的植物病毒获得了侵染性克隆。

小西葫芦黄花叶病毒是马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的成员，病毒粒子为弯曲线状，无包膜，长度为750nm。基因组为长9.6kb的单链正义RNA，5′端具有一个共价结合基因组连接蛋白，3′端为20-160nt个腺苷酸组成的Poly(A)尾巴。

针对小西葫芦黄花叶病毒，本发明设计构建了小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体。在本发明的一个实施方案中，所给出的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体的构建方法具体如下：

a.从小西葫芦黄花叶病毒侵染的南瓜叶片中提纯病毒粒子，TRIZOL法提取病毒粒子中病毒RNA。

b.设计小西葫芦黄花叶病毒特异性引物，以病毒RNA为模板进行RT-PCR扩增获得ZYMV全基因组序列，通过5′-RACE技术获得ZYMV的5′端序列。PCR扩增获得ZYMV全基因组。

c.通过酶切链接方法将花椰菜花叶病毒35S启动子插入pCambia0390表达载体。

d.利用同源重组的方法将ZYMV全长克隆到(c)中获得的载体，获得含有ZYMV全基因组的克隆载体pCaZYMV。

e.通过农杆菌浸润方法接种寄主植物，观察症状及检测。

马铃薯Y病毒属是植物病毒中最大的一个属，但只有为数不多的病毒构建了侵染性克隆。

要构建侵染性cDNA克隆，首先是如何正确的获得病毒全基因组，对于基因组较小的RNA病毒来说，容易获得全长cDNA序列；但小西葫芦黄花叶病毒的基因组长约9.6kb，基因组较大，受到反转录酶延伸长度的限制以及二级结构的影响，合成全长的第一链cDNA是非常困难的。因此，通过一个PCR反应扩增获得全部ZYMV基因组是技术难点之一。由于小西葫芦黄花叶病毒病毒基因组5′端A含量较高，从而使扩增难度增加，相应的，设计扩增引物的难度也随之增大。本发明在试验过程中设计了多组引物，但扩增效果均不理想。例如：引物ZYMV-F:5-GAAAATTAAAACAAATCACAAGAACTATAAGAATCAACGATCAAGCAAACGAATTTTAG-3′和ZYMV-R:5-AGGCTTGCAAACGGAGTCTAAT

CTCGAGCTTATTCGTGAGAGGCTCACACTAAAGC-3′由于退火温度差异较大，因此不能够成功扩增到ZYMV全基因组。经多次试验优化发现，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行扩增，能够高效、保真的扩增得到ZYMV全基因组。

另外，直接从寄主中提取的总RNA很难获得完整的病毒RNA，本申请中通过提取病毒粒体而后从中提取病毒RNA，能够保证获得高丰度并且完整的病毒RNA。

制备ZYMV侵染性克隆的技另一术难点在于将ZYMV全基因组序列克隆到双元载体当中，并且能够保证获得的克隆在寄主上具有侵染性。构建的克隆无侵染性以及载体不稳定等难题是限制马铃薯Y病毒属病毒表达载体构建的瓶颈。并不是任何载体都能克隆全长病毒基因组，因此，表达载体的选择非常重要。由于现有技术中表达载体的种类众多，如何从如此多的表达载体中选择适合构建小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆的载体难度很大，本发明经大量的试验发现，pCambia0390表达载体的多克隆位点较多，能够满足多个外源片段的插入；容量大，可以满足基因组较大的病毒；而且载体性质稳定，特别适合于小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆的构建。以pCambia0390为载体构建的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆对寄主的侵染性达100％；而以其他的表达载体构建小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆则存在克隆不稳定、在宿主内不具有侵染性等问题。

在本发明的另一个实施方案中，给出了利用小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体表达绿色荧光蛋白的方法，具体步骤如下：

(1)PCR扩增获得带有NIa蛋白酶识别位点的绿色荧光蛋白GFP基因序列，通过同源重组方法插入到pCaZYMV侵染性克隆NIb和CP之间，命名为pCaZYMV-GFP。

(2)通过农杆菌浸润方法接种寄主植物，观察并检测外源蛋白表达。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

其中本发明将表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电激法等。本发明实施例中所采用的方法未做详细说明的均为本领域现有技术。

本发明实施例中所采用的引物序列如下表：

引物1和2应用于小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆全长基因，引物3和4应用于载体pCambia0390，引物5和6应用于GFP全长基因序列，引物7和8应用于载体pCambia0390-ZYMV。

实施例1：小西葫芦黄花叶病毒病毒粒子病毒RNA的提纯

取20g小西葫芦黄花叶病毒侵染的南瓜病叶，液氮研磨后加入60mL提取缓冲液混匀置于冰上。经神奇滤布过滤，上清转移至离心管，15000g，4℃离心20min。上清液经0.22μM膜过滤后，4℃，40000g，超速离心1.5h。弃上清，加1.5mL 0.02M磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解沉淀。

取300μL病毒粒子加入等量裂解液(40mM Tris-HCI,PH＝9.0；2mM EDTA；2％SDS)，漩涡震荡混匀。加100U RNA酶抑制剂和等体积水饱合酚，漩涡震荡混匀后，60℃孵育1min。室温静置5min，4℃，13000g离心5min。转移上清液至新1.5mL离心管中，加入等体积苯酚氯仿混合物(1:1)，漩涡震荡混匀。静置5min，4℃，13000g离心10min。上清液转移至新的1.5mL离心管中，加等量的异丙醇，静置10min。4℃，12000g离心10min，弃上清。加70％酒精(DEPC配制)1mL，剧烈涡旋，4℃，7500g离心5min。小心吸取上清液，弃上清，将沉淀室温干燥5min。加50μL RNA溶解液。60℃孵育10min，-80℃保存备用。

实施例2：小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆的构建

以实施例1中获得的病毒RNA为模板，以引物2和Oligo(dT)₁₈进行反转录。反转录反应程序如下：

65℃保温5min，迅速置于冰上冷却2min，瞬离。

55℃，45min：80℃，10min终止反应。加入1μL RNase H，37℃，10min。

以所得反转录产物为模板，使用Phusion高保真聚合酶进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

反应程序：

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收备用。

通过Xma I和Pst I对PCR扩增到的35S启动子基因以及pCambia0390质粒进行双酶切后连接，获得带有35启动子的pCambia0390载体。利用引物3和4扩增载体序列，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。与前面获得的ZYMV全长PCR产物进行同源重组获得含有ZYMV全基因组的双元载体克隆，命名为pCaZYMV(图1中A)，序列如SEQ ID No.9所示。

实施例3：小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达外源蛋白载体构建

使用Phusion高保真聚合酶PCR扩增得到GFP，序列如SEQ ID No.10所示，反应体系如下：

反应程序：

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后，利用同源重组的方法连接到载体pCaZYMV，将该侵染性表达载体命名为pCaZYMV-GFP(图1中B)。

实施例4：pCaZYMV侵染性及表达外源蛋白GFP效果测定

将pCaZYMV和pCaZYMV-GFP质粒转化农杆菌GV3101。经菌落PCR验证后，挑单斑接种于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)(50μL)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)(1μL)及与上步相同抗生素的LB培养基中，于28℃振荡培养至对数生长期。离心收集菌体并重新悬浮于农杆菌菌体重悬溶液(10mmol/L MgCl₂(100mL)，10mmol/L MES(1mL)，0.15μmol/L AS(150μL))中，调整浓度使其OD₆₀₀为0.5-0.6之间，室温静置3小时。取1mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，浸润西葫芦、南瓜。每株浸润2片叶。浸润两周后植株表现典型ZYMV症状(图2，图3)，接种pCaZYMV-GFP的植株在紫外灯下具有绿色荧光(图4)。

结果表明，本发明构建的pCaZYMV具有很好的生物学活性，能成功的侵染南瓜和西葫芦，侵染效率达100％；并且可以成功的表达外源蛋白。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体及其构建方法

<130> 2019

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caagccgcgc cgtcgccact cgaccgccgg cgcccacatc aaggcaccct gcctcgcgcg 4260

tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 4320

tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 4380

gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac 4440

tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac 4500

agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 4560

ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 4620

ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 4680

gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 4740

gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 4800

taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 4860

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 4920

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 4980

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 5040

agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 5100

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 5160

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 5220

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 5280

acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 5340

cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat 5400

tcatccagta aaatataata ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca 5460

aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag 5520

gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact 5580

ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc 5640

tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg 5700

tcttcttccc agttttcgca atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat 5760

tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga 5820

aagagcctga tgcactccgc atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca 5880

tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca 5940

tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg 6000

tccttttccc gttccacatc ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa 6060

tataggtttt cattttctcc caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta 6120

tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta 6180

gccatttatt atttccttcc tcttttctac agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt 6240

ataacaagac gaactccaat tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa 6300

cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt 6360

tgaaaccgcg gtgatcacag gcagcaacgc tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc 6420

tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat 6480

cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac 6540

tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg 6600

gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt aaacaaattg acgcttagac aacttaataa 6660

cacattgcgg acgtttttaa tgtactgaat taacgccgaa ttaattccta ggccaccatg 6720

ttgggcccgg cgcgccaagc ttggctgcag gtcgactccc cagattagcc ttttcaattt 6780

cagaaagaat gctaacccac agatggttag agaggcttac gcagcaggtc tcatcaagac 6840

gatctacccg agcaataatc tccaggaaat caaatacctt cccaagaagg ttaaagatgc 6900

agtcaaaaga ttcaggacta actgcatcaa gaacacagag aaagatatat ttctcaagat 6960

cagaagtact attccagtat ggacgattca aggcttgctt cacaaaccaa ggcaagtaat 7020

agagattgga gtctctaaaa aggtagttcc cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat 7080

tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt aaagactggc gaacagttca tacagagtct 7140

cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt cgtcaacatg gtggagcacg acacacttgt 7200

ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggcaattg agacttttca 7260

acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat 7320

tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa 7380

ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag 7440

gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga 7500

tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc 7560

tatataagga agttcatttc atttggagag aaaattaaaa caaatcacaa gaactataag 7620

aatcaacgat caagcaaacg aattttagaa cgcattcaca aacaagcaac tcaaacttcg 7680

tatagtatca agaatttctt cagtcatttc tttcacttca gacgcagcaa tggcctctat 7740

catgattggt tcagtctccg tgcccatccc aaaacctgca cagtgtgcaa acactcaagc 7800

aagtagtcgg gttagtatag tggcacctgg ccacatggca acatgcccac tgccatcgaa 7860

aacgcacatg tactacaggc atgagtccaa gaagttgatg caatcaaata aaagcattga 7920

tattctgaac aatttcttca gcaccgacga aatgaaattt aggctcacta ggaacgagat 7980

gagcaaggtt aaaaagggtc cgaatggaag gataatcctc cgcaagccaa gtaagcagcg 8040

ggtttttgct cgtattgagc aggataaagc agcacgcaag ggagaagctg ttttcctcga 8100

aggaaattat gatgattcga tcacaactct agagggtgtt cttccatctg aagctactcg 8160

caatgttgat gtgagtttgc gatcaccgtt ctacaagcgc acatacaaga aggaaagaaa 8220

gagagtggcg caaaaacaga ttgtgcaggc accacttaat agcttgtgta cacgtattct 8280

taaaattgcg cgcaataaag acatccctgt ggagatgatt ggcaacaaga aagcaaaaca 8340

tacactcacc ttcaagaggt ttaggggata ttttgttgga aaagtgtcag ttgcgcatga 8400

agaaggacga atgcggcaca ctgagatgtc gtatgagcaa tttgaatgga ttctaaaagc 8460

catttgtcag gtcacccata cagagcgaat tcgtgaagaa gatattaaac caggttgtag 8520

tgggtgggtg ttgggcacta atcacacatt gaccaaaaga tattcaagat tgccacattt 8580

ggtaattcga ggcagagacg acgacgggat tgtgaacgcg ctggaaccgg tgttgtttta 8640

tagcgaggtt gaccactatt cgtcgcaacc ggaagttcag tttttccaag gctggcgacg 8700

aatgtttgac aagtttagac ccagtccaga tcatgtgtgt aaagttgacc acaacaacga 8760

ggaatgtggt gagttagcag ctagcttttg tcaggctttg tttccagtag tgaaactatc 8820

gtgccaaaca tgcagagaaa agcttagtag agttagcttt gaggaattca aagattcctt 8880

gaatgcaaac tttattatcc ataaggatga atggggtagt ttcaaggagg gctctcatta 8940

cgataatatt ttcaaactga tcagagtggc aacacaggtt actcagaatc tcaaactctc 9000

atctgaagtc atgaagttag ttcagaacca cacaagcact cacatgaagc aaatacaaga 9060

tatcaacaag gcgctcatga aaggttcatt ggttactcaa gacgaattgg acttggcttt 9120

gaaacagctt ctcgaaatga ctcagtggtt taaaaaccac atgcacttga ctggtgagga 9180

ggcgttgaag acgttcagaa acaagcgctc tagcaaggct atgataaatc ctagtctttt 9240

atgtgataac caattggaca aaaatggaaa ttttgtttgg ggagaaagag gatatcattc 9300

caagcgatta ttcaagaact tctttgaaga agtaatacca agtgaaggat atacgaaata 9360

cgtagtacgc aactttccaa atggtactcg caagttggcc ataggctcac tgattgtacc 9420

actcaacttg gatagggcac gcactgcact ccttggagag agtattgaga agaagccact 9480

cacatcagcg tgtgtctccc aacaaaatgg aaactatata cactcatgct gctgtgtaac 9540

gatggatgat ggaactccaa tgtattcgga acttaagagc ccgacgaaga gacatctagt 9600

tataggagct tctggtgatc caaagtacat agatttacca gcatctgagg cagaacgcat 9660

gtatatagca aaggaaggtt attgctatct taacattttc ctcgcaatgc ttgtgaatgt 9720

taatgagaac gaggcgaagg atttcaccaa gatgattcgt gatgttttga tccctatgct 9780

tgggcaatgg ccttcgttga tggatgttgc aactgcagca tacatactag gtgtatttca 9840

tcctgaaacg cgatgtgctg aattacctag gattcttgtt gatcacgcta cgcaaaccat 9900

gcatgtcatt gattcatatg gatcattaac tgttgggtat catgtactca aggctggaac 9960

tgtcaatcat ttaattcaat ttgcctcaaa cgatttgcaa agcgagatga agcattacag 10020

agtcggcgga acgccaacgc agcgcattaa ccttgaggag caactgatta aaggagtttt 10080

caaaccgaag cttatgatgc agctcctgca tgatgaccca tacatattat tacttggcat 10140

gatctcacca accattcttg tgcacatgta taggatgcgt cattttgaac ggggtattga 10200

gatatggatt aagagagatc atgaaattgg aaagattttc gtcatattgg aacagctcac 10260

acggaaagtt gctctggctg aagttcttgt ggatcaactc aatttgataa gcgaagcttc 10320

accacattta cttgaaatca tgaagggttg tcaagataac caaagggcgt atgtacctgc 10380

actggatctg ctaacaatac aagtggagcg tgaattttca aacaaggaac ttaaaaccaa 10440

tggctatcca gatttgcagc aaacgttgtt tgatatgaga gaaaaaatgt atgcaaagca 10500

attgcacaat tcatggcaag agctaagctt gctggaaaaa tcttgtgtaa ccgtgcgatt 10560

gaagcgattt tcgattttta cggaaagaaa tttaatccag cgagcaaaag aaggaaagcg 10620

cacatcttcg ctacaatttg ttcacgagtg ctttatcacg acccgagtac atgcgaagag 10680

cattcgcgat gcaggcgtgc gcaagctaaa tgaggctctc gttggaactt gtaaattctt 10740

tttctcttgt ggctttaaaa tttttgtgcg gtgttacagc gacataatat accttgtgaa 10800

cgtgtgtttg gtattctcct tggtgttaca aatgtctaat actgtgcgta acatgatagc 10860

ggcgacaagg gaagaaaaag agagagcgat ggcaaataaa gctgatgaaa atgaaaggac 10920

gttaatgcac atgtatcaca ttttcagtaa gaagcaggaa gaagcaccca tatataatga 10980

ctttcttgaa catgttcgca atgttagacc agatcttgag gaaacccttt tgtacatggc 11040

tggtgcagaa gttgttgcaa tgcaggccaa atcagcggtt caggttcagt ttgagaagat 11100

tatagctgtt ttggcgctgc tcactatgtg ctttgacgcc gaaagaagtg acgctatttt 11160

caagattttg acaaagctca aaacagtttt tggcacggtt ggagaaacgg tccgacttca 11220

aggacttgaa gatattgaga gcttggagga cgataaaaga ctcacaattg actttgatat 11280

taacacaaat gaggcccaat cgtcaacaac atttgatgtc cattttgatg attggtggaa 11340

tcggcagcta cagcaaaatc gcacagttcc acattacagg accacaggta aatttcttga 11400

atttaccaga agtaccgcgg cttttgtggc caatgagatt gcatcatcaa atgaaggaga 11460

gttcttagtt aggggagcag taggttccgg caaatcaacg agcttgcctg cgcatcttgc 11520

caagaagggc aaggtattac tactcgaacc tacacgccct ttggcggaga atgtcagtag 11580

acaattagca ggtgatcctt ttttccaaaa cgtcacactc agaatgagag ggctaagctg 11640

cttcggttca agcaatatta cagtgatgac gagtggattt gcttttcact actatgttaa 11700

caatccacat caattaatgg aatttgattt tgttattata gacgaatgcc atgttacgga 11760

cagtgcgacc atagctttca attgcgcact taaagagtac aattttgctg gcaaattgat 11820

taaagtgtct gcaacgccgc cagggagaga gtgcgatttt gatacgcaat tcgcagtgaa 11880

agtcaaaacg gaggaccacc tttcattcca tgcattcgtt ggcgcacaga aaactggttc 11940

aaatgctgac atggttcagc atggtagtaa catacttgtg tatgttgcta gttacaacga 12000

agtagacatg ctttctaagt tgctcactga gcgccagttt tcagtaacaa aggtagatgg 12060

gcgaacaatg caacttggaa aaactgccat cgaaacgcat ggaactagcc aaaagcctca 12120

ttttatagta gccacaaaca taatcgagaa tggagtgacg ttggatgttg agtgtgttgt 12180

tgattttgga ctaaaagtgg tcgcagaatt ggacagcgaa aatcgatgtg tgcgttacaa 12240

caagaaatca gttagttatg gagaaaggat tcagcggcta ggaagagtgg ggagatctaa 12300

gcctggaact gcattgcgta tagggcacac agaaaaaggc atcgagaaca ttcctgaatt 12360

cattgccacg gaagcagcag ccttatcatt tgcatatggg cttccagtca ccacgcatgg 12420

ggtttccaca aacatactcg gaaagtgcac agttaaacag atgagatgtg ctttgaactt 12480

tgagctaact cctttcttca ccactcatct aatccgtcat gatggtagta tgcatccact 12540

gatacacgaa gaattgaaac aattcaaact cagggattca gaaatggtgc tcaacaaggt 12600

cgcattacct caccaatttg tgagtcaatg gatggagcaa agtgagtatg aacgcattgg 12660

agtgcacgtc caatgtcatg agagcacacg catacctttt tatacaaatg gagtacctga 12720

taaagtttac gagaaaattt ggaagtgcat acaagaaaac aagaatgatg cggtttttgg 12780

taagctttca agtgcttgtt cgactaaggt tagttacaca ctcagcaccg atccagcagc 12840

attacccaga actattgcaa tcattgacca cctgcttgcc gaagaaatga tgaagcggaa 12900

tcacttcgac acgatcagct cagctgtaac gggttactca ttttccctcg ctggaattgc 12960

tgattcattt aggaagagat acatgcgcga ttacacagca cacaacattg caattcttca 13020

acaagcacgt gcccagctgc ttgaatttaa tagtaaaaat gtgaacatca acaacctgtc 13080

cgatttagaa ggaattgggg tcattaagtc ggtggtgttg caaagtaagc aagaggtcag 13140

caatttccta ggacttcgcg gcaaatggga tggacggaaa tttgcgaatg atgcgatatt 13200

ggcgatcatg acactcttag gaggtggatg gttcatgtgg gaatacttta cgaaaaagat 13260

caatgaaccc gtgcgcgttg aaagtaagaa acgccgatct caaaagttga aattcaggga 13320

tgcgtacgat aggaaagtcg gacgtgagat ttttggtgat gatgacacaa ttgggcgcac 13380

ttttggtgaa gcttacacga agagaggaaa ggtcaaagga aacaacagca caaaaggaat 13440

gggacggaaa actcgcaatt ttgtgcattt atatggtgtg gagcctgaga attacagttt 13500

tatcagattt gtggaccctc tcactggcca tacattggat gaaagcaccc atacagacat 13560

atcgttagtg caggaagaat ttgggagcat tagagagaaa tttctggaga atgatttgat 13620

ctcgaggcag tctattatca gcaaacccgg tattcaggca tattttatgg gtaagggcac 13680

tgaagaagca ctcaaggttg acctaactcc tcatgtacca ttgcttctat gtagaaacac 13740

taatgccatt gctgggtacc cagagagaga aaatgaattg agacaaactg gcacaccagt 13800

caaggtctct tttaaggacg tcccagagaa aaacgaacat gtcgagttgg agagtaaatc 13860

tatctacaaa ggagtgcgcg attacaatgg catctcaaca attgtttgtc aattaacgaa 13920

cgattctgat ggtcttaggg agactatgta tggtattggg tacgggccga taattatcac 13980

gaatgggcac ctcttcagga agaacaatgg tacacttcta gtcagatctt ggcatggtga 14040

attcactgtc aaaaatacca caacacttaa agtacatttc atagaaggga aggatgttgt 14100

attagtgcgc atgccaaagg attttccacc gtttaaaagc aacgcttctt tcagagcacc 14160

aaaacgcgag gaacgagcat gcttggttgg aacaaatttt caagaaaaga gtctccgctc 14220

cactgtttca gaatcttcca tgacaatacc tgaaggaact ggctcatatt ggattcattg 14280

gatctcgacc aacgaagggg attgcggatt acccatggtt tcaacaacgg atggcaagat 14340

aattggagtt catggtttgg cttccacagt ctcatctaag aattattttg tcccattcac 14400

tgatgacttt atagccacgc atttgagcaa gcttgacgat cttacatgga ctcagcattg 14460

gctatggcag cccagtaaaa tcgcgtgggg aacgctcaac ttagttgatg aacaaccagg 14520

gcctgaattt cgtatttcaa atctcgtaaa ggatttgttc acttctgggg ttgaaacaca 14580

gagcaagcga gaaagatggg tttacgaaag ctgtgaaggg aacctccgag ctgttggaac 14640

tgcacaatca gcgttagtca ccaaacatgt tgtaaagggt aagtgttctt tcttcgaaga 14700

atacttacaa acacacgcgg aagcgagcgc ctatttcaga ccccttatgg gagagtacca 14760

gccgagcaag ttgaacaaag aggcttttaa aaaggatttc tttaaataca ataaacccgt 14820

cactgtaaat caattggatc atgataaatt cttggaagca gtgaatgggg ttatacgtat 14880

gatgtgcgac tttgagttca atgaatgccg attcattaca gatcccgagg aaatttacaa 14940

ctctttgaac atgaaagcag cgattggagc ccaatataga ggaaagaaga aagaatactt 15000

tgaagggcta gatgattttg atcgagagcg acttttattt caaagttgtg agaggctgtt 15060

taatggttac aaaggcctgt ggaatggatc tttgaaggcc gagctcagac cgcttgaaaa 15120

agtcagggct aacaaaacac gaacctttac agcagcgcca attgacacac tgcttggagc 15180

taaagtttgt gtggatgatt tcaacaatga attctacagc aaaaatctca agtgtccatg 15240

gacggttggc atgacaaaat tttatggtgg ttgggacaaa ttgatgagag cattacctga 15300

tggttggtta tattgccatg ctgatggatc acagtttgac agttctttaa ccccagcctt 15360

actaaatgca gtgcttatga tcaggtcatt ttacatggaa gattggtggg ttggccaaga 15420

gatgcttgaa aatctttatg ctgaaattgt gtacactcca attcttgctc cggatggaac 15480

aattttcaag aaatttagag gtaacaacag tgggcaaccc tcgacggttg tggataacac 15540

gctcatggtt gtgatctcta tttactacgc gtgcatgaaa tttggttgga actacgaaga 15600

aattgagaat aaacttgtct tctttgcaaa tggagacgat ctgatactcg cagttaaaga 15660

tgaagacagt ggcttacttg ataacatgtc atcctctttt tgtgaacttg gactgaatta 15720

cgacttttca gaacgtacgc ataaaagaga agatctttgg ttcatgtctc accaagcaat 15780

gctagttgat ggaatgtaca ttccaaaact cgagaaagag agaattgtct caattctaga 15840

gtgggataga agcaaagaaa ttatgcaccg aacagaggct atttgcgctg cgatgattga 15900

ggcatggggg cacaccgagc ttttgcaaga aatcagaaag ttttacctat ggttcgttga 15960

aaaagaagaa gtgcgggaat tggctgccct cggaaaagct ccatacatag ctgagacagc 16020

acttcgtaag ttatacaccg ataagggagc ggaaacaagc gaactggcac gctacctaca 16080

agccctccat caagatatct tctttgaaca aggagacact gtaatgctcc aatcaggaac 16140

tcagacaact gtagcagacg ctggagctac aaagaaagac aaagaagatg ataaagggag 16200

aaacaaggat gttacaggct ccggttcagg cgagaaaaca gtagcagctg ctacgaagga 16260

caaggatgtg aatgctggtt ctcatgggaa aatcgtgccg cgtctttcga agatcacaaa 16320

gaaaatgtca ctgccacgcg tgaaaggaaa tgtgatactc gatatcgatc acttgctgga 16380

atacaagccg gatcaaattg agctatacaa cacacgagcg tctcatcagc aattcgcctc 16440

ttggttcaac caagttaaga cagaatatga tctgaacgag caacagatgg gagttgtaat 16500

gaacggtttc atggtttggt gcattgaaaa tggcacttca cccgacatta atggagtgtg 16560

ggtcatgatg gacggaagtg agcaggttga gtatcccttg aaaccaatag ttgaaaatgc 16620

aaagccaacg ctgcggcaaa taatgcatca tttttcagat gcagcggagg catatataga 16680

gatgagaaac gcagaggcac catacatgcc gaggtatggt ttgcttcgaa acctacggga 16740

taggagttta gcacgatatg ctttcgattt ctatgaagtc aattctaaaa ctcctgaaag 16800

agcccgcgaa gctgttgcgc agatgaaagc agcagctctt agcaatgttt cttcaaggtt 16860

gtttggcctt gatggaaatg ttgccaccac tagcgaagac actgaacggc acactgcacg 16920

tgatgttaat aggaacatgc acaccttact aggtgtgaat acaatgcagt aaagggtagg 16980

ccgcctacct aggttatcgt ttcgctgccg acgtaattct aatatttacc gctttatttg 17040

atatctttat atttccagag tgggcctccc acctttaaag cgtaaagttt atgttagttg 17100

tccaggagtg ccgtagtcct gtcggaagct ttagtgtgag cctctcacga ataagctcga 17160

gattagactc cgtttgcaag cctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaccccggg 17220

aattctaaga ggagtccacc atggtagatc tgactagtgt taacg 17265

<210> 10

<211> 714

<212> DNA

<213> GFP

<400> 10

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc tacatacgga 120

aagcttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca tatgaaacgg 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatcgtatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct cggacacaaa 420

ctcgagtaca actataactc acacaatgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagcta acttcaaaat tcgccacaac attgaagatg gatccgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtcgacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt 660

cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaa 714

Claims (10)

1.一种小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体，其特征在于，该侵染性克隆表达载体是由小西葫芦黄花叶病毒全基因组通过同源重组的方式克隆到含有花椰菜花叶病毒35S启动子的pCambia0390双元载体上制备得到；所述小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.权利要求1所述的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从感染小西葫芦黄花叶病毒的发病株中提纯病毒粒子，并提取病毒粒子中的RNA；

(2)以步骤(1)的RNA为模板进行反转录，以反转录产物为模板，以SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的核苷酸序列作为特异性引物进行PCR扩增，获得小西葫芦黄花叶病毒全基因组；

(3)通过同源重组的方法将小西葫芦黄花叶病毒全基因组连接到改造后的pCambia0390双元载体pCa35S上，即得到小西葫芦黄花叶病毒全基因组侵染性克隆表达载体。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，反转录的反应程序为：将模板RNA、Oligo(dT)₁₈、SEQ ID NO.2所示的引物、dNTP和RNase free dH₂O混合，65℃保温5min，迅速置于冰上冷却2min，瞬间离心；再加入5×SSIV Buffer(Thermo Fisher)、DDT、RRI(RNase Inhibitor)和SuperScript IV Reverse Transcriptase(Thermo Fisher)；55℃，45min；80℃，10min，终止反应；再加入RNase H，37℃，1min。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增的反应体系包括：HF buffer 10μL、dNTP 1μL、SEQ ID NO.1所示的引物1μL、SEQ ID NO.2所示的引物1μL、模板2μL、Phusion高保真聚合酶0.3μL、dH₂O 34.7μL。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增的反应程序为：

1)98℃，预变性，30s；

2)98℃，变性，10s；72℃，退火和延伸，5min 30s；共32个循环；

3)72℃，后延伸，10min。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，通过同源重组将小西葫芦黄花叶病毒基因组连接到双元载体pCa35S后，转化大肠杆菌，培养温度为28℃。

7.权利要求1所述的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体在表达外源蛋白中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，应用方法为：将带有NIa蛋白酶识别位点的外源蛋白基因序列通过同源重组方法插入到权利要求1所述的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体的NIb和CP之间，获得含有外源蛋白基因的侵染性克隆表达载体，然后转化农杆菌，再通过农杆菌浸润方法接种寄生植物，表达外源蛋白；

优选的，所述外源蛋白为GFP。

9.权利要求1所述的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体在使植株获得交叉保护中的应用。

10.一种重组农杆菌菌株，其特征在于，由权利要求1所述的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体或者含有外源蛋白基因的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体导入到农杆菌中获得。