KR102076338B1 - 잠두위조바이러스2를 이용한 고추 유전자 침묵 기술 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 잠두위조바이러스2를 이용한 식물 유전자 침묵 기술에 관한 것으로, 구체적으로 식물 내재 유전자에 대한 유전자 침묵 효과를 나타낼 수 있는 잠두위조바이러스2를 이용한 유전자 침묵 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 침묵 벡터는 식물 내재 유전자를 쉽고 빠르게 침묵시킴으로써, 유전자 기능 상실에 따른 식물 유전자의 기능 연구 및 유용 유전자 발굴에 효과적으로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 잠두위조바이러스2를 이용한 식물 유전자 침묵 기술에 관한 것으로, 구체적으로 식물 내재 유전자에 대한 유전자 침묵 효과를 나타낼 수 있는 잠두위조바이러스2를 이용한 유전자 침묵 벡터에 관한 것이다.
일반적으로 외래 유전자가 다른 세포에 삽입되어 하나의 독립적인 복제가능단위(replicon)를 형성하거나 혹은 동종 재조합(homologous recombination)에 의해 도입된 세포의 게놈 속으로 통합되어 계속적인 복제가 가능하고, 유전자 발현이 됨으로써 새로운 형질을 나타내도록 하는 것을 형질전환이라고 한다. 이와 같이 외래 유전자의 도입이 가능해 짐에 따라 원하는 유전자를 원하는 세포에서 대량으로 발현할 수 있게 되었으며, 이러한 재조합 DNA 기술은 현대 유전공학 발전의 핵심이라 할 수 있다.
유전자 침묵(gene silencing) 현상은 21-27 nt 길이의 RNA가 RISC 형태로 표적 유전자를 분해하거나, 번역을 억제하거나, 핵 내로 들어가서 표적 DNA를 변형시킴으로써 유전자의 발현을 조절하는 기작이다. 이러한 현상은 단세포 생물인 클라미도모나스, 효모로부터 고등식물, 사람에 이르기까지 대부분의 진핵생물에서 발견되는데, 일차적으로는 바이러스, 세균, 트랜스포존 등의 공격으로부터 자신의 게놈을 보호하기 위한 방어기능을 하고, 또한 발달과정 또는 스트레스에 반응하여 자신의 유전자의 발현을 조절하는 기능을 하는 것으로 알려졌다. 이러한 유전자 침묵 기작은 사람을 포함한 생물의 질병과도 관련이 있어서, 이 기작의 연구 및 이 기작의 이용(RNAi 기술)은 기초 연구뿐만 아니라 질병의 연구 및 치료 등에서 아주 중요한 역할을 하게 되었다.
잠두위조바이러스 2(Broad bean wilt virus 2; BBWV2)는 코모바이러스(Comoviridae)과 파바바이러스(Fabavirus)속에 속하는 직경 약 25mm의 구형 바이러스로 1947년 잠두에서 처음 분리하여 보고된 이래, 유럽 등 세계적으로 가지과 등 여러 작물에 문제가 되고 있다. 진딧물에 의해 비영속형으로 쉽게 전염이 되며, 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물에 의한 전염율이 60~90% 정도 된다. 우리나라에서는 고추 및 착색단고추의 주요 재배지역을 중심으로 계속적으로 증가하는 바이러스이다. 1999년 전북지역에 처음으로 발병이 보고된 이후로, 2002년도에는 전남 및 경남지역 등 착색단고추 주요 재배지역으로 확산되어, 2005년 이후로는 PepMoV 다음으로 문제가 되고 있다. 병징은 잎에서는 생육시기에 따른 차이가 있어, 생육초기에 감염되면 신엽에 모자이크 및 기형 병징을 보여 PepMoV 병징과 유사한 특징을 보인다. 그러나 일반적으로 전형적인 특징은 잎에서의 병징이 거의 없거나 미약한 모자이크 병징을 보이고, 이에 반해 과실에서는 괴저 반문이나 괴저 줄무늬 병징을 보인다.
BBWV2의 비리온은 20면체(icosahedral) 입자들로서, 두 개의 단백질(LCP, SCP) 및 약 6 및 4 kb의 두 개의 단일 가닥 양성-센스 RNA 분자들로 구성된 유전체로 구성된다. 두 개의 RNA들은 기능성 단백질이 가수분해 분열에 의해 나누어진 것으로부터 하나의 다단백질로 번역된다. RNA1은 유전체 복제 및 발현에 관여하는 단백질을 코딩하고, RNA2는 이동 단백질 및 두 개의 CP를 코딩한다(Lisa and Boccardo, 1996).
국내등록특허 제10-1570765호에는 BBWV2의 감염 활성을 식물체에서 재현시키기 위해, 바이너리 벡터를 이용하여 제작된 BBWV2의 감염성 클론을 아그로박테리움 튜머페이션스 균주에 형질전환하고, 식물체에 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)하여 감염성 클론의 접종 및 감염성을 확인하였다. 상기 발명은 식물체에서 BBWV2의 감염활성을 지속적으로 재현하여, 바이러스가 발현하는 단백질의 기능을 연구하고 병원성 관여 인자를 밝혀 저항성 품종 육성의 기초 자료로 유용하게 활용될 수 있다. 그러나 상기 발명에 따른 벡터는 감염성 클론을 통해 BBWV2의 감염 활성을 식물체에서 확인할 수 있을 뿐, 식물 내에서 유전자 침묵 현상을 통해 유전자의 기능을 효과적으로 연구할 수 있는 유전자 침묵 벡터의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 식물체 내에서 유전자 침묵 효과를 나타낼 수 있는 잠두위조바이러스2(Broad bean wilt virus 2; BBWV2)로부터 유래된 유전자 침묵(Virus-Induced Gene Silencing, VIGS) 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 침묵 벡터를 이용하여 식물체 내에서 유전자 침묵 효과를 나타낼 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 식물체, 바람직하게 고추 또는 담배를 감염시킬 수 있는 잠두위조바이러스2(Broad bean wilt virus 2; BBWV2)의 감염성 cDNA 클론(국내등록특허 제10-1570765호)를 이용하여, 유전공학적 조작을 통해 식물체 내에서 유전자 침묵 효과를 나타낼 수 있는 벡터를 제조하였다. 제작된 유전자 전달 벡터는 pBBWV2-VIGS로 명명되었으며, 이는 BBWV2의 RNA1 또는 RNA2가 각각 포함된 pBBWV2-R1 및 pBBWV2-R2-VIGS로 구성된다 (도 1).
본 발명자들은 pBBWV2-VIGS 벡터를 이용하여, 일부분의 유전자 삽입 카세트(cassette)에 식물 내재 유전자의 부분 서열을 역방향으로 삽입하여, 식물체 내에서 식물 내재 유전자를 침묵시킬 수 있는 벡터를 제조하였다. 이후 상기 벡터를 아그로박테리움 균주에 형질전환시키고 식물체에 감염시켰을 때 유전자 침묵 현상이 일어나, 상기 식물 내재 유전자가 세포 단위에서 발현이 억제됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 BBWV2의 RNA1을 포함하는 벡터; 및 BBWV2의 RNA2를 포함하며 외래 유전자, 바람직하게 식물 내재 유전자, 더욱 바람직하게 식물 내재 유전자의 부분 서열이 삽입될 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 벡터로 이루어진, 식물체 내에서 식물 내재 유전자를 침묵시키기 위한 벡터를 제공한다. 구체적으로 상기 BBWV2의 RNA1은 보조인자 프로테아제(cofactor protease, Co-Pro), NTP-결합 모티프(NTP-binding motif, NTBM), 게놈 연결 바이러스 단백질 (genome-linked viral protein, VPg), 피코나인 3C-유사 프로테아제(picornain 3C-like protease, Pro), 및 RNA 의존 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) 유전자를 포함한다. 상기 BBWV2의 RNA2는 이동 단백질(movement protein, MP), 라지 코트 단백질(large coat protein, LCP), 및 스몰 코트 단백질(small coat protein, SCP) 유전자를 포함한다. 특히, 본 발명의 벡터에서 BBWV2의 RNA2에는 유전자 삽입 카세트(cassette)가 포함되며, 구체적으로 종결 코돈 바로 뒤의 3' UTR에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 부위를 포함한다. 또한, 본 발명의 벡터는 T-DNA의 왼쪽 보더(LB), CaMV(Cauliflower mosaic virus)의 듀얼 35S 프로모터, 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)(StuI, KpnI, XbaI, 및 BamHI), 시스 분해 리보자임 서열(cis-cleaving ribozyme sequence, Rz), 35S 터미네이터(T), 및 T-DNA의 오른쪽 보더(RB)를 순서대로 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터는 기존 개발된 잠두위조바이러스2 감염성 발현용 벡터와 달리, 외래 유전자를 도입함으로써 표적으로 하는 식물 내재 유전자를 효과적으로 침묵시킬 수 있다. 본 발명의 침묵 벡터를 통해 식물 내재 유전자를 쉽고 빠르게 침묵시킬 수 있으며, 상기 벡터는 유전자 기능 상실에 따른 식물 유전자의 기능 연구 및 유용 유전자 발굴에 유용하게 활용될 수 있다.
바람직하게, 상기 종결 코돈 바로 뒤의 3' UTR에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한 효소 부위는 SalI 제한효소 부위일 수 있다. 또한, 상기 벡터는 도 1에 기재된 pBBWV2-VIGS 벡터(pBBWV2-R1 벡터 및 pBBWV2-R2-VIGS 벡터)의 개열 지도를 가질 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 pBBWV2-R1 벡터는 서열번호 1로 표시되는 BBWV2로부터 유래된 벡터가 사용될 수 있으며, pBBWV2-R2-VIGS 벡터는 서열번호 2로 표시되는 BBWV2로부터 유래된 벡터가 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 본 발명은 BBWV2의 RNA1을 포함하는 벡터; 및 BBWV2의 RNA2를 포함하며 외래 유전자가 삽입될 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 벡터로 이루어지며, 상기 외래 유전자가 삽입될 수 있는 제한효소 부위는 SalI 제한효소 부위이며, 상기 제한효소 부위는 RNA2의 종결 코돈 바로 뒤의 3' UTR에 위치한, 식물체 내에서 식물 내재 유전자를 침묵시키기 위한 벡터를 제공한다.
본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "침묵 벡터"는 표적으로 하는 유전자의 발현을 침묵시키는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선발표지를 포함하고, 복제 가능한 재조합 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터 또는 파세올린(phaseo세포주) 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역은 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 벡터는 멀티-클로닝 부위(MCS)를 포함하며, 이러한 MCS 영역은 HEcoRI, XbaI, StuI, NcoI, BamHI, KpnI, SacI, MluI, XhoI, SrfI, SmaI, SpeI 등의 제한효소 부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 본 발명의 벡터는 프로모터와 선발표지의 교환이 용이하도록 해당 서열의 경계에 제한효소 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 유전자의 종류에 따라 유용한 프로모터의 종류가 달라지며, 작물 종에 따라 선발표지의 종류로 인한 형질전환 효율이 크게 달라질 수 있으므로 프로모터 및 선발표지의 교환이 용이한 벡터는 매우 유용하다.
본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 작동 가능하게 연결되는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 식물 프로모터는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.
상기 선발표지(selective marker, 또는 선택 마커)는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 일 실시예에서, 본 발명은 도 1의 모식도로 표현되는 pBBWV2-VIGS로 명명된 식물 내재 유전자 침묵 벡터를 제공한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 pBBWV2-VIGS 벡터는 서열번호 1로 표시되는 pBBWV2-R1 벡터 및 서열번호 2로 표시되는 pBBWV2-R2-VIGS 벡터로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 벡터에 외래 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고, 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 BBWV2 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 식물 내재 유전자를 침묵시키는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 식물체는 고추일 수 있다.
상기 식물 내재 유전자는 엽록소 발달 유전자, 제초제 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 또는 과실의 품질에 영향을 주는 유전자, 및 환경 또는 스트레스 저항성 유전자 등으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 외래 유전자는 식물 내재 유전자의 부분 서열일 수 있으며, 이러한 식물 내재 유전자의 부분 서열은 식물체 내에서 해당 식물 내재 유전자에 대하여 침묵 효과를 발휘할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 식물 내재 유전자는 고추 내재 유전자이며, 바람직하게 고추의 파이토인 불포화효소(phytoene desaturase, PDS) 유전자이다. 본 발명에서는 PDS 유전자를 고추 내에서 침묵시키기 위해, PDS 유전자의 부분 서열(230개 뉴클레오티드, 서열번호 4)을 벡터에 역방향으로 삽입하였으며, 이렇게 제작한 클론을 pBBWV2-VIGS-caPDSr로 명명하였으며(도 1), 이는 서열번호 3의 유전자 서열을 갖는다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 벡터를 식물체로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 기계적 접종(mechanical inoculation), 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method), 또는 아그로박테리움 인필트레이션(infiltration) 등을 이용할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 벡터는 아그로박테리움 인필트레이션을 통해 BBWV2 바이러스의 식물체 내 전신감염을 유도하여 형질전환될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 식물 내재 유전자가 침묵된 형질전환된 식물체를 제공한다. 바람직하게, 상기 식물체는 고추일 수 있다. 이러한 형질전환 식물체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 또한, 상기 식물체는 자가 수정 및 타가 수정할 수 있는 식물체를 모두 포함한다.
본 발명의 유전자 침묵 벡터는 식물 내재 유전자를 쉽고 빠르게 침묵시킴으로써, 유전자 기능 상실에 따른 식물 유전자의 기능 연구 및 유용 유전자 발굴에 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 BBWV2 기반의 pBBWV2-VIGS 벡터 및 고추 PDS 유전자가 삽입된 침묵 클론(pBBWV2-R2-VIGS-caPDSr)의 모식도를 나타낸다.
도 2는 pBBWV2-VIGS 벡터를 이용한 고추 PDS 유전자 침묵 효과를 검정한 실험 결과를 나타낸다.
도 2는 pBBWV2-VIGS 벡터를 이용한 고추 PDS 유전자 침묵 효과를 검정한 실험 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예
1:
잠두위조바이러스2를
이용한 바이러스 유도된 유전자 침묵(Virus-Induced Gene Silencing, VIGS) 벡터의 설계 및 제작
잠두위조바이러스2를 바탕으로 한 VIGS 벡터를 제작하기 위한 바이너리 벡터로서 pCassRz 벡터를 이용하였다. pCassRz 벡터는 T-DNA의 왼쪽 보더, CaMV의 듀얼 35S 프로모터, 다중 클로닝 부위 (MCS; StuI, KpnI, XbaI, BamHI), cis-절단 리보자임 서열 (Rz), 35S 터미네이터 (T), T-DNA의 오른쪽 보더를 순서대로 포함하고 있어, 이를 아그로박테리움에 형질전환하여 아그로-인필트레이션(agro-infiltration)을 통해 식물에 원하는 유전자를 전달할 수 있다. 또한 pCassRz 벡터는 카나마이신 저항성 유전자를 포함하고 있으므로, 아그로박테리움에 형질전환 시 선택 배양할 수 있다.
BBWV2 기반 듀얼 유전자 전달 벡터를 제작하기 위해서 기 개발된 BBWV2 감염성 cDNA 클론(국내등록특허 제10-1570765호)을 이용하였다. BBWV2의 게놈은 두 개의 RNA 절편, 즉 RNA1과 RNA2로 이루어져 있다. 각각의 RNA는 하나 오픈 리딩 프레임을 코딩하고 있으며, 다단백질(polyprotein)을 발현 후 단백질 분해 가공(proteolytic processing)을 통해 바이러스의 여러 성숙 단백질을 발현하며, 오픈 리딩 프레임의 하위에 유전자를 코딩하지 않는 비번역된 영역(untranslated region, UTR)을 포함한다. 이러한 BBWV2의 특징을 이용해, 기 개발한 BBWV2 감염성 cDNA 클론을 이용해 종결 코돈 바로 뒤의 3' UTR에, 제한 효소 부위(SalI)를 포함하도록 유전공학적으로 조작하여, 외래 유전자 염기서열을 삽입할 수 있는 벡터로 개발하였다. 이렇게 제작된 BBWV2 기반 VIGS 벡터를 pBBWV2-VIGS (pBBWV2-R1 및 pBBWV2-R2-VIGS로 구성)라 명명하였다(도 1). 상기 pBBWV2-R1은 서열번호 1의 염기서열을 가지며, pBBWV2-R2-VIGS는 서열번호 2의 염기서열을 갖는다.
실시예
2:
BBWV2
기반 VIGS 벡터를 이용한 고추 내재 유전자 침묵 효과 검정
제작한 pBBWV2-VIGS 벡터를 이용한 고추 내재 유전자 침묵 효과를 검정하기 위해 벡터의 SalI 제한효소 사이트에 고추의 파이토인 불포화효소(PDS) 유전자의 부분 서열(230 뉴클레오티드, 서열번호 4)를 역방향(reverse orientation)으로 삽입하였으며, 이렇게 제작한 클론을 pBBWV2-VIGS-caPDSr이라 명명하였으며(도 1), 이는 서열번호 3의 염기서열을 갖는다.
제작한 pBBWV2-VIGS-caPDSr 클론의 플라스미드 DNA를 아그로박테리움 균주 EHA105에 형질전환하였다. 형질전환된 아그로박테리움을 5ml의 YEP 액체 배지 (100mg/ml의 카나마이신 및 50mg/ml의 리팜피신 포함)에서 30℃의 조건에서 16시간 동안 진탕 배양한 후 1차 배양액 1ml을 50ml의 새 YEP 배지 (50mg/ml의 카나마이신, 50mg/ml의 리팜피신, 및 20uM의 아세토시린곤(acetosyringon) 포함)에 접종하여 30℃의 조건에서 6시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 4800G에서 10분간 원심분리하여 아그로박테리움을 침전시키고, MMA 인필트레이션 버퍼 (MS 염, 10mM MES, pH5.6, 200uM 아세토시린곤)에 600nm의 파장에서 O.D. 0.7의 농도로 다시 현탁시켰다. 그 다음 현탁액을 30℃의 조건에서 2시간 동안 진탕 배양하였다.
pBBWV2-R1 또는 pBBWV2-R2- VIGS-caPDSr로 각각 형질전환된 아그로박테리움 배양액을 같은 비율로 섞은 후, 고추 잎의 배축면에 1ml 주사기를 이용하여 압력으로 인필트레이션 하였다. pBBWV2- VIGS-caPDSr에 의해 고추 PDS 유전자가 침묵될 경우 감염된 식물 세포의 엽록소 발달이 저해되어 백화현상(chlorosis)이 관찰 될 것으로 예상할 수 있다. 접종 20일 후, 감염된 식물을 관찰한 결과, 예상했던 바대로 VIGS 효과에 따른 고추 PDS 유전자의 침묵으로 백화현상을 확인할 수 있었으며, 이는 pBBWV2-VIGS 벡터가 높은 효율로 고추 내재 유전자를 침묵시킬 수 있음을 의미한다(도 2).
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION
<120> Virus-induced gene silencing in pepper using broad bean wilt
virus 2
<130> P18-134, SNU-2018-3537
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 16236
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pBBWV2-R1
<400> 1
gttttaataa aatattaaaa caaacagctt tcgttccgaa aacagctttc agttactaaa 60
cagctttcgt tccgattaaa cagctttcaa acaaacagct ttcatttcat tcagccattc 120
ttggtttgtg tggcttcgga aagaacccgg aaaaagggag tgtgattaaa agcgcaccat 180
atatttcgaa gatcattttg aatttcattt tgttacctta attttaagat ggatttcagt 240
atgatgcaaa tgactgtggg ttttctcaaa acttcaatgg gtttacaatc cattaaggac 300
attgtggaaa aagcctgcgt ggcggagaag gacaaaacct tgctccacat tcatttatgc 360
tttttccacg ccaatgagat ggctcgggac tataatgaag gtatggacat ggggcagata 420
caaagttctg ctgcaatcaa ataccgagct gcggtgttaa agcgccatgt tttaatgaat 480
gtggaaacgg gaagatatga tcgtgcacgc atgatgcagt acaataatga aacatgtgtt 540
aattggttct cgtgcaggat cgtcgaagaa aaggttggaa aagtgcttga cgaagaggag 600
gagcaagagg atgacattgt tgataatttt ctcaagaatt gtgcgatttc tgagaaggtt 660
ggccagacat caggagaagg cgctgagcat tgtgcctttg gccagggttt gtatgagtat 720
gccactcgta ttagtgatgc aatagtggca gtgatctcag gttctattaa aaagagcata 780
gatgattttc tggacaaagt gtatgcagtt atggcacagg ttttcgcggc ttggatgcct 840
agaattagag ctgcgtttca gtggttcgag aacattaaag aagtcattaa gagatgggcc 900
aatacgatgc atgaaaaaat caatttcatt ctagttggca tggaagattg tctgtacatg 960
ggcgctggtc tcgttgctgc tacttgcatc gtcacattgc ttgaaaaatt catgatagca 1020
attgggattt taaccaagcc ttgtggggcg gctactctct tcctaacaac tgcaatggcg 1080
gctatttcag ccacatacgt gtgtggaaaa gcattggaaa agtcagctat gctctccaat 1140
ttgttactct ttgtaaccac caactgccga gttgtgttgg atacgctatt caatcacgaa 1200
ttaggaaggc aggagcagga gatgagccac aatggtgaga aagccccgac aagctctggt 1260
cagtttggca tttcaacaat gctacaagat gtagccaatt tagtttcaac gtggtcaaca 1320
agttcggtca cagaaattgg gaaaacattt ggtgccattt cacagattaa aaatggaatt 1380
ctagctttaa gggacatggt gtactttgtg tttgaaaagt tgagtgaatt ggctcacaga 1440
gtgcttgggt ttgaatctca agtattggct gatttgtcaa ttttgcttgg agagaatgtg 1500
gcagactggt tatctgaatg cgattgcatg gtggcttata tgcttgagtt taactccaga 1560
aatagagaga tttttgatag actgtctcag ctaatagaga aaggcagaat gataagaaca 1620
ggagttttgc gctcaagtca tcgtgggtcg tcacaggtca tgtcgcttgt tactaaggct 1680
ttggagaagc taatagagtt gcataactca gttgtgatgg caggttcaaa cacaactagg 1740
aagtctccct ttatggtttt cttcacaggt gcctctggta cagggaaaac ttcagttgtt 1800
caaagagttg ctataaattg gctgcaggaa gaacagcttg ggacgagtga aatatacgct 1860
cgcaatgggc aggatccttt ttggtctggt tacaaaaggc atgcggttgt cacgtatgat 1920
gatttcggag ccgttccagg cacaacttca aatgaagctg aaattatcaa cgtcatatca 1980
agaaacccat atgcaacagt gatggcaggc ttggcggaaa aaggaatgta ttttgactca 2040
agattggttt tggctagcag caatttcctt gctgccaacc cagagtcagg agttcatgat 2100
tcagaggcgt acgagagacg aaggcacgca gtggtaagag tttcattgaa accaggagtt 2160
ccttacaatg ccaatgatcc gtgcgccaat caaaattaca ccttgttaga gtccaaaaca 2220
ccctttaatg aaattcaaac atttgaaaca tatgcggaac tctggtcttt tttgtacaca 2280
aggtttaagg agcacgagga acaagaggaa ttgtacctaa agtccttgcc aatattggat 2340
tcagacaaaa aggaagctct ggagggtttg ataggtctca cggttatagc cacttcattt 2400
gctccgaagg cagtcatgca gtttggagca gaaaagtttc caggatacca ttttctcatt 2460
tcggatggtg agtattgcta tttttggcat ggagatgggt cggtggaatt tgtcagtgta 2520
gagcgaatga aattgagcaa gcaagatata attcagttga agcagcaagg actatccacg 2580
gccatgatgt ataaggatct ggctaaggcc tttcccactt tgaattcatt ggctgtgctg 2640
tatgccaaaa atattgtggt aaagcgctgg attggtgcag atttggagcc cacaaagagc 2700
tgtgaagatg tttacatgcg tgagcaaata ggcaatttgc ccaaatggca gagggcgtat 2760
ttgcacgtgc tcagcaagta tttaacagtt caaagccctc gaggatggtt tatggaatgt 2820
ttagaagaag caaagaggaa tttgcgggca acatacttat gggaatacaa acaatggcca 2880
ttgcctttga aattggcatt gggttcattg attgccatca tggcgggtgg agccatttgg 2940
tattcactac agtctttatg gtgtgtgtct ggggacgctt cttttatagc gggagcagca 3000
acggtttttt ctgtttcttc ttttgctgga caaagtgatg tgccaaaccg ggataacaca 3060
gaaagatcgt tcagaaacag gaagatccgt gctagaacat ggcaaggtca gagttcgtgt 3120
tttggagact cggcactttg gatcgcggaa acttgtatgg caacattgac cttctcaaat 3180
gtaagaacac aagtgtgctt agcacctggg agaggtttct ttggagtgaa ccattgcctt 3240
gctgtcattc ccgcaggtgt gatggtcaag ctggattcga gtataggagt aacttatttt 3300
gtgtgggaga aggaaaaact gatacagttt gaaggcaatg aaatagcact gtatatgaca 3360
agcacaatgc ccaagaccgt ggattctctt ttgagcagaa ttcactttga tgctgagact 3420
ctgcccaaga cctttagtgc agttttcttt tcctacaagt atgatccagt aattcagcaa 3480
atggtgcctg agttgggaag cgtcacgtgc aagattcaca acaaagcttt cacattggca 3540
catggtgaat ataggcggga aattccccag agccttacgt atgaggcaag cactgtggct 3600
ggtgattgtg gctctttaat attggcggaa attgaaggga aattcaagct agtgggtatg 3660
catgtggcat ttaatggcaa ggaaggaagt gcaagtttta tgccgtacca tgctctttta 3720
gatcaaaaag tgggccaagg agattttgtg ttgaagtacc aagaatgggc tgagccaaag 3780
attttgggtc caggttgcag ggcgatggga ctcatagatc cagaacatgc tttggcagct 3840
agtgggaaga ctacatttgt tgaaacccca gaggagtggc atttgaatta cccatgtgac 3900
aaacttccta gtgttttggc aaggggtgat cccagattgg cgggcacagt tcatgccgac 3960
tacgacccat ttgccgcagg catgagcaaa tatgcaaaag aggcagggcc ttttgaagct 4020
gccagcttga agcaggtgtg tttgggaata actgaagtat gggaagatgc ttcagcagat 4080
tttccaatgg atgaagttga tttggacact gctatcaatg gcttggaaaa tgtcgaattc 4140
tttgatgcct tggttttagg aacttctgag gggtttcctt accggctaga tcgtggtcca 4200
ggcgagaaag gaaagagcag gtatgtgtct ggtgagagtg ggaattttaa aatcactgat 4260
gaaggtgtgc tctcggacat taactggttc gaggagacaa gcaagacaca ggtgcctgac 4320
ctgtattgta ttgaatgcgt caaggatgag cgcttgccaa ttaggaaagt gctgcatgaa 4380
cccaaaagtc ggttgttcac agtacttcca atgtcctaca acatagccat taggaagaag 4440
tttttgaact ttgtcagatt tttcatgaaa aggagggatg tgttacctgc ccaggttgga 4500
gttaatccct attctcggga gtggacccga atagccaata agttgttgag caaaggtaac 4560
aacattctgt gttgtgatta cagcaggttt gatggttttt tgcccaagtg tgttatgaat 4620
gagattgggg acatgatagc cagggttatg cgagcaaatg atgagtccaa gactcagatc 4680
aagaatctta tgcttgcgtg taccagtcga tatgccatgt gcaaccgagt cttgtacaga 4740
gttgaaaatg gtatcccttc tggctttccg ctcactgtcg ttgtgaattc catcctgaat 4800
gagatcttgg ttaaatatgc gtattggcat tgctttgtgg ataatccaac tgttcaaagt 4860
aactttgatg cgcatgtttc catggtggta tatggtgatg acaatttgat atcagtatcg 4920
gatgcaataa gctcaaagtt tgatggaaat ttccttgtga agttcatgga aggacttgga 4980
attaaggtta ctgatggaat tgacaaaaca aaaattggaa tagagttccg tcgcctggag 5040
aattgtgatt tccttaagcg ctctttcaag ttgaatccag atggcacatg gcgcagcccc 5100
atgtctaagg agagcttatg gccacagctg cactatgtga aagcaaaaaa attggaaatg 5160
gctgaggctt acataaacaa ttgcaataat atcttgcgtg agctgtggtt gcatgatgtt 5220
aaagaggcca aggaattccg caataaagtg ctgagaagtt taaaatggat tggccatgag 5280
caattgctca atatgcaaca attggcagtg tttcatagtg agcaaatgaa cggggtgagt 5340
gattttctat ccacttgtgt gacagttgat agcatttcat taatggatcc cctggttcct 5400
ggtttgctac cggtcaagac ttgtgaagtg attcctcgag tttttgtggc ggcagaaaag 5460
cattttgaag gaaattttga ggatttcttc acagtatcca taaccacaag tcgtaaattc 5520
aaggaggaca agggttttgt tcttttgttc ccatatggag caggcagagg tggattgcca 5580
acaacacaat tcatgaaaga gaatgtggta aggaaagggt gttccataca aaagaaattc 5640
aggcaggcat atgagagagg agagaaaatt ttgttcatct cgcagagctc agtggttcca 5700
gcttacgtgt ttgctgtcat gctactacat tcaattggag caatttccag attgacgagc 5760
aataaagctc tcacacaagc aatgcaaact tgcaagaaat tagagtattt gcctaaagag 5820
tatgaagatt tcttttgaat ttaattttat tttgttgtgt gtgcatttta attattaatc 5880
actacttata ttgtataata tgtattatgc agggttgaaa tgcctttccc aagtaaattt 5940
cagtagtgag ggaaaaaaaa aaaaaaaaag gtacctctag aggatccgat accctgtcac 6000
cggatgtgtt ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa caggactgtc ctgcaggagc 6060
tcgaattcgg tacgctgaaa tcaccagtct ctctctacaa atctatctct ctctattttc 6120
tccataaata atgtgtgagt agtttccgat aaggaaatta gggttcttat agggtttcgt 6180
catgtgttga gcatataaga aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc 6240
aataaaattt ctaattccta aaaccaaaat cagtactaaa tcagatcccc aattcactgg 6300
ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 6360
cagcacatcc ccctttcgcc agtggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa 6420
aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 6480
aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 6540
tgctagagca gcttgagctt ggatcagatt gtcgtttccc gccttcagtt taaactatca 6600
gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta ttagaataac 6660
ggatatttaa aagggcgtga aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt gcatgccaac 6720
cacagggttc ccctcgggat caaagtactt tgatccaacc cctccgctgc tatagtgcag 6780
tcggcttctg acgttcagtg cagccgtctt ctgaaaacga catgtcgcac aagtcctaag 6840
ttacgcgaca ggctgccgcc ctgccctttt cctggcgttt tcttgtcgcg tgttttagtc 6900
gcataaagta gaatacttgc gactagaacc ggagacatta cgccatgaac aagagcgccg 6960
ccgctggcct gctgggctat gcccgcgtca gcaccgacga ccaggacttg accaaccaac 7020
gggccgaact gcacgcggcc ggctgcacca agctgttttc cgagaagatc accggcacca 7080
ggcgcgaccg cccggagctg gccaggatgc ttgaccacct acgccctggc gacgttgtga 7140
cagtgaccag gctagaccgc ctggcccgca gcacccgcga cctactggac attgccgagc 7200
gcatccagga ggccggcgcg ggcctgcgta gcctggcaga gccgtgggcc gacaccacca 7260
cgccggccgg ccgcatggtg ttgaccgtgt tcgccggcat tgccgagttc gagcgttccc 7320
taatcatcga ccgcacccgg agcgggcgcg aggccgccaa ggcccgaggc gtgaagtttg 7380
gcccccgccc taccctcacc ccggcacaga tcgcgcacgc ccgcgagctg atcgaccagg 7440
aaggccgcac cgtgaaagag gcggctgcac tgcttggcgt gcatcgctcg accctgtacc 7500
gcgcacttga gcgcagcgag gaagtgacgc ccaccgaggc caggcggcgc ggtgccttcc 7560
gtgaggacgc attgaccgag gccgacgccc tggcggccgc cgagaatgaa cgccaagagg 7620
aacaagcatg aaaccgcacc aggacggcca ggacgaaccg tttttcatta ccgaagagat 7680
cgaggcggag atgatcgcgg ccgggtacgt gttcgagccg cccgcgcacg tctcaaccgt 7740
gcggctgcat gaaatcctgg ccggtttgtc tgatgccaag ctggcggcct ggccggccag 7800
cttggccgct gaagaaaccg agcgccgccg tctaaaaagg tgatgtgtat ttgagtaaaa 7860
cagcttgcgt catgcggtcg ctgcgtatat gatgcgatga gtaaataaac aaatacgcaa 7920
ggggaacgca tgaaggttat cgctgtactt aaccagaaag gcgggtcagg caagacgacc 7980
atcgcaaccc atctagcccg cgccctgcaa ctcgccgggg ccgatgttct gttagtcgat 8040
tccgatcccc agggcagtgc ccgcgattgg gcggccgtgc gggaagatca accgctaacc 8100
gttgtcggca tcgaccgccc gacgattgac cgcgacgtga aggccatcgg ccggcgcgac 8160
ttcgtagtga tcgacggagc gccccaggcg gcggacttgg ctgtgtccgc gatcaaggca 8220
gccgacttcg tgctgattcc ggtgcagcca agcccttacg acatatgggc caccgccgac 8280
ctggtggagc tggttaagca gcgcattgag gtcacggatg gaaggctaca agcggccttt 8340
gtcgtgtcgc gggcgatcaa aggcacgcgc atcggcggtg aggttgccga ggcgctggcc 8400
gggtacgagc tgcccattct tgagtcccgt atcacgcagc gcgtgagcta cccaggcact 8460
gccgccgccg gcacaaccgt tcttgaatca gaacccgagg gcgacgctgc ccgcgaggtc 8520
caggcgctgg ccgctgaaat taaatcaaaa ctcatttgag ttaatgaggt aaagagaaaa 8580
tgagcaaaag cacaaacacg ctaagtgccg gccgtccgag cgcacgcagc agcaaggctg 8640
caacgttggc cagcctggca gacacgccag ccatgaagcg ggtcaacttt cagttgccgg 8700
cggaggatca caccaagctg aagatgtacg cggtacgcca aggcaagacc attaccgagc 8760
tgctatctga atacatcgcg cagctaccag agtaaatgag caaatgaata aatgagtaga 8820
tgaattttag cggctaaagg aggcggcatg gaaaatcaag aacaaccagg caccgacgcc 8880
gtggaatgcc ccatgtgtgg aggaacgggc ggttggccag gcgtaagcgg ctgggttgtc 8940
tgccggccct gcaatggcac tggaaccccc aagcccgagg aatcggcgtg acggtcgcaa 9000
accatccggc ccggtacaaa tcggcgcggc gctgggtgat gacctggtgg agaagttgaa 9060
ggccgcgcag gccgcccagc ggcaacgcat cgaggcagaa gcacgccccg gtgaatcgtg 9120
gcaagcggcc gctgatcgaa tccgcaaaga atcccggcaa ccgccggcag ccggtgcgcc 9180
gtcgattagg aagccgccca agggcgacga gcaaccagat tttttcgttc cgatgctcta 9240
tgacgtgggc acccgcgata gtcgcagcat catggacgtg gccgttttcc gtctgtcgaa 9300
gcgtgaccga cgagctggcg aggtgatccg ctacgagctt ccagacgggc acgtagaggt 9360
ttccgcaggg ccggccggca tggccagtgt gtgggattac gacctggtac tgatggcggt 9420
ttcccatcta accgaatcca tgaaccgata ccgggaaggg aagggagaca agcccggccg 9480
cgtgttccgt ccacacgttg cggacgtact caagttctgc cggcgagccg atggcggaaa 9540
gcagaaagac gacctggtag aaacctgcat tcggttaaac accacgcacg ttgccatgca 9600
gcgtacgaag aaggccaaga acggccgcct ggtgacggta tccgagggtg aagccttgat 9660
tagccgctac aagatcgtaa agagcgaaac cgggcggccg gagtacatcg agatcgagct 9720
agctgattgg atgtaccgcg agatcacaga aggcaagaac ccggacgtgc tgacggttca 9780
ccccgattac tttttgatcg atcccggcat cggccgtttt ctctaccgcc tggcacgccg 9840
cgccgcaggc aaggcagaag ccagatggtt gttcaagacg atctacgaac gcagtggcag 9900
cgccggagag ttcaagaagt tctgtttcac cgtgcgcaag ctgatcgggt caaatgacct 9960
gccggagtac gatttgaagg aggaggcggg gcaggctggc ccgatcctag tcatgcgcta 10020
ccgcaacctg atcgagggcg aagcatccgc cggttcctaa tgtacggagc agatgctagg 10080
gcaaattgcc ctagcagggg aaaaaggtcg aaaaggtctc tttcctgtgg atagcacgta 10140
cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggaacccg tacattggga acccaaagcc 10200
gtacattggg aaccggtcac acatgtaagt gactgatata aaagagaaaa aaggcgattt 10260
ttccgcctaa aactctttaa aacttattaa aactcttaaa acccgcctgg cctgtgcata 10320
actgtctggc cagcgcacag ccgaagagct gcaaaaagcg cctacccttc ggtcgctgcg 10380
ctccctacgc cccgccgctt cgcgtcggcc tatcgcggcc gctggccgct caaaaatggc 10440
tggcctacgg ccaggcaatc taccagggcg cggacaagcc gcgccgtcgc cactcgaccg 10500
ccggcgccca catcaaggca ccctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 10560
gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 10620
aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt 10680
cacgtagcga tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact 10740
gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat 10800
caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 10860
agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 10920
aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 10980
gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 11040
tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 11100
cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 11160
ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 11220
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 11280
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 11340
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 11400
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cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 8940
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 9000
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 9060
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 9120
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 9180
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 9240
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 9300
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 9360
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 9420
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 9480
tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 9540
ttaagggatt ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata 9600
ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg 9660
ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc 9720
cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat 9780
gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt 9840
taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca 9900
atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa 9960
gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc 10020
atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac 10080
gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac 10140
ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttccacatc 10200
ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc 10260
caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt 10320
ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc 10380
tcttttctac agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat 10440
tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt 10500
tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccgcg gtgatcacag 10560
gcagcaacgc tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat catccgtgtt 10620
tcaaacccgg cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg agcaaagtct 10680
gccgccttac aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac tgatgggctg cctgtatcga 10740
gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg gctggctggt ggcaggatat 10800
attgtggtgt aaacaaattg acgcttagac aacttaataa cacattgcgg acgtttttaa 10860
tgtactgaat taacgccgaa ttaattcggg ggatctggat tttagtactg gattttggtt 10920
ttaggaatta gaaattttat tgatagaagt attttacaaa tacaaataca tactaagggt 10980
ttcttatatg ctcaacacat gagcgaaacc ctataggaac cctaattccc ttatctggga 11040
actactcaca cattattatg gagaaactcg agcttgtcga tcgacagatc cggtcggcat 11100
ctactctatt tctttgccct cggacgagtg ctggggcgtc ggtttccact atcggcgagt 11160
acttctacac agccatcggt ccagacggcc gcgcttctgc gggcgatttg tgtacgcccg 11220
acagtcccgg ctccggatcg gacgattgcg tcgcatcgac cctgcgccca agctgcatca 11280
tcgaaattgc cgtcaaccaa gctctgatag agttggtcaa gaccaatgcg gagcatatac 11340
gcccggagtc gtggcgatcc tgcaagctcc ggatgcctcc gctcgaagta gcgcgtctgc 11400
tgctccatac aagccaacca cggcctccag aagaagatgt tggcgacctc gtattgggaa 11460
tccccgaaca tcgcctcgct ccagtcaatg accgctgtta tgcggccatt gtccgtcagg 11520
acattgttgg agccgaaatc cgcgtgcacg aggtgccgga cttcggggca gtcctcggcc 11580
caaagcatca gctcatcgag agcctgcgcg acggacgcac tgacggtgtc gtccatcaca 11640
gtttgccagt gatacacatg gggatcagca atcgcgcata tgaaatcacg ccatgtagtg 11700
tattgaccga ttccttgcgg tccgaatggg ccgaacccgc tcgtctggct aagatcggcc 11760
gcagcgatcg catccatagc ctccgcgacc ggttgtagaa cagcgggcag ttcggtttca 11820
ggcaggtctt gcaacgtgac accctgtgca cggcgggaga tgcaataggt caggctctcg 11880
ctaaactccc caatgtcaag cacttccgga atcgggagcg cggccgatgc aaagtgccga 11940
taaacataac gatctttgta gaaaccatcg gcgcagctat ttacccgcag gacatatcca 12000
cgccctccta catcgaagct gaaagcacga gattcttcgc cctccgagag ctgcatcagg 12060
tcggagacgc tgtcgaactt ttcgatcaga aacttctcga cagacgtcgc ggtgagttca 12120
ggctttttca tatctcattg ccccccggga tctgcgaaag ctcgagagag atagatttgt 12180
agagagagac tggtgatttc agcgtgtcct ctccaaatga aatgaacttc cttatataga 12240
ggaaggtctt gcgaaggata gtgggattgt gcgtcatccc ttacgtcagt ggagatatca 12300
catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc 12360
gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg catcttgaac gatagccttt 12420
cctttatcgc aatgatggca tttgtaggtg ccaccttcct tttctactgt ccttttgatg 12480
aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc ccgatattac cctttgttga 12540
aaagtctcaa tagccctttg gtcttctgag actgtatctt tgatattctt ggagtagacg 12600
agagtgtcgt gctccaccat gttatcacat caatccactt gctttgaaga cgtggttgga 12660
acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg accactgtcg 12720
gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat gatggcattt gtaggtgcca 12780
ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg 12840
aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact 12900
gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct ccaccatgtt ggcaagctgc 12960
tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 13020
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 13080
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 13140
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattctggc 13200
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 13260
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 13320
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 13380
catgcctgca ggtcaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag aatatcaaag 13440
atacagtctc agaagaccag agggctattg agacttttca acaaagggta atatcgggaa 13500
acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat cgaaaggaca gtagaaaagg 13560
aagatggctt ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct 13620
ctaccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gaacatcgtg gaaaaagaag 13680
acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tggtcaacat ggtggagcac 13740
gacactctcg tctactccaa gaatatcaaa gatacagtct cagaagacca gagggctatt 13800
gagacttttc aacaaagggt aatatcggga aacctcctcg gattccattg cccagctatc 13860
tgtcacttca tcgaaaggac agtagaaaag gaagatggct tctacaaatg ccatcattgc 13920
gataaaggaa aggctatcgt tcaagatgcc tctaccgaca gtggtcccaa agatggaccc 13980
ccacccacga ggaacatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg 14040
gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa 14100
gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga gg 14142
<210> 4
<211> 230
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pepper partial PDS
<400> 4
atgccccaaa ttggacttgt ttctgctgtc aacttgagag tccaaggtaa ttcagcttat 60
ctttggagct cgaggtcttc tttgggaact gatagtcaag atggttgctc gcaaaggaat 120
tcgttatgtt ttggtggtag tgactcaatg agtcataggt taaagattcg taatccccat 180
tccataacga gaagattggc taaggatttc cggcctttaa aggttgtttg 230
Claims (13)
- 잠두위조바이러스2(Broad bean wilt virus 2, BBWV2)의 RNA1을 포함하는 벡터(pBBWV2-R1); 및
BBWV2의 RNA2를 포함하며 외래 유전자가 삽입될 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 벡터(pBBWV2-R2-VIGS)로 이루어지며,
상기 외래 유전자가 삽입될 수 있는 제한효소 부위는 SalI 제한효소 부위이며,
상기 외래 유전자가 삽입될 수 있는 제한효소 부위는 RNA2의 종결 코돈 바로 뒤의 3' UTR에 위치하며,
상기 BBWV2의 RNA1을 포함하는 벡터(pBBWV2-R1)는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지며,
상기 BBWV2의 RNA2를 포함하는 벡터(pBBWV2-R2-VIGS)는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진,
고추 내에서 식물 내재 유전자를 침묵시키기 위한 벡터. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 외래 유전자는 식물 내재 유전자의 부분 서열인 고추 내에서 식물 내재 유전자를 침묵시키기 위한 벡터.
- 제4항에 있어서, 상기 식물 내재 유전자의 부분 서열은 벡터에 역방향으로 삽입될 수 있는 고추 내에서 식물 내재 유전자를 침묵시키기 위한 벡터.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 벡터는 도 1에 기재된 pBBWV2-R1 벡터 및 pBBWV2-R2-VIGS 벡터의 개열 지도를 갖는 고추 내에서 식물 내재 유전자를 침묵시키기 위한 벡터.
- 제1항의 벡터에 외래 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고, 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 고추 내에서 식물 내재 유전자를 침묵시키는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 식물 내재 유전자는 엽록소 발달 유전자, 제초제 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 또는 과실의 품질에 영향을 주는 유전자, 및 환경 또는 스트레스 저항성 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 고추 내에서 식물 내재 유전자를 침묵시키는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 외래 유전자는 고추 PDS 유전자의 부분 서열인 고추 내에서 식물 내재 유전자를 침묵시키는 방법.
- 제10항의 방법에 의해 식물 내재 유전자가 침묵된 형질전환된 고추.
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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2018
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|---|---|---|---|---|
| KR101724370B1 (ko) * | 2016-07-08 | 2017-04-07 | 한국생명공학연구원 | Trsv 재조합 벡터 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| Keisuke Tasaki 등. Scientia Horticulturae. Vol. 201, 페이지 279-286 (2016.02.12.)* |
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