KR102076333B1 - 잠두위조바이러스2를 이용한 두 종의 외래 유전자 동시 발현용 유전자 전달 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 잠두위조바이러스2를 이용해 두 종의 외래 유전자를 동시에 발현시킬 수 있는 유전자 발현 벡터, 이러한 벡터를 이용해 두 종의 외래 유전자를 동시에 발현시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 식물체에서 두 가지의 외래 유전자를 동시에 발현함으로써 쉽고 빠르게 유전자 형질 도입이 가능하므로, 고추 또는 담배 유전자의 기능 연구 및 유용 유전자 발굴에 활용 가능하다. 또한, 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 단백질간의 다양한 상호작용 연구를 위한 실험 기법 개발이 가능하므로, 이를 통해 복잡한 단백질 작용기전을 연구하기 용이하다. 또한, 최종적으로 유전자 기능 연구를 통해 얻은 유용 유전자를 대상으로 다양한 형질 개선 작물 개발의 기초자료를 제공할 수 있다.

Description

잠두위조바이러스2를 이용한 두 종의 외래 유전자 동시 발현용 유전자 전달 벡터{Gene delivery vector for simultaneous expression of two foreign genes using broad bean wilt virus 2}

본 발명은 잠두위조바이러스2를 이용해 두 종의 외래 유전자를 동시에 발현시킬 수 있는 유전자 발현 벡터, 이러한 벡터를 이용해 두 종의 외래 유전자를 동시에 발현시키는 방법 및 이러한 방법으로 제작된 형질전환체에 관한 것이다.

일반적으로 외래 유전자가 다른 세포에 삽입되어 하나의 독립적인 복제가능단위(replicon)를 형성하거나 혹은 동종 재조합(homologous recombination)에 의해 도입된 세포의 게놈 속으로 통합되어 계속적인 복제가 가능하고, 유전자 발현이 됨으로써 새로운 형질을 나타내도록 하는 것을 형질전환이라고 한다. 이와 같이 외래 유전자의 도입이 가능해 짐에 따라 원하는 유전자를 원하는 세포에서 대량으로 발현할 수 있게 되었으며, 이러한 재조합 DNA 기술은 현대 유전공학 발전의 핵심이라 할 수 있다.

특히, 식물 또는 동물들에게서 인간에게 유용한 특성을 발휘할 수 있도록 외래 유전자를 도입하여 형질전환식물 또는 형질전환동물을 제조하는 기술분야에 관한 연구가 활발하며, 그 중에서도 동물에 비하여 식물을 대상으로 한 유전자 조작은 더욱 실용화되고 있다. 형질전환 식물에서 목적 유전자를 산업적으로 발현시킨 것은 1984년에 세균 유래의 유전자를 담배에서 발현시킴으로 처음 보고되었다(Gasser, C.S. et al., Science, 244, 1293-9, 1989). 최근 유전공학적 변형작물을 이용한 고부가가치의 치료용 물질의 생산에 대하여 많은 연구가 진행되고 또한 치료용 단백질 등 유용물질의 생산성 향상에 관한 여러 가지 방법들이 연구되고 있다. 현재 바이오산업이 발전함에 따라, 식물을 생산공장으로 활용하여 고부가가치의 다양한 유용단백질을 생산하고, 대규모 재배가 가능한 주체인 식물을 이용하여 고부가가치의 유용단백질을 값싸게 대량으로 생산할 수 있는 기술에 대한 기대가 커지고 있다. 또한 식물을 이용한 생산은 동물세포배양에 비하여는 약 1/30, 미생물 발효에 비하여 약 1/3의 비용이 소요되므로 쉽게 산업화할 수 있는 장점을 가지고 있다. 그 중에서도 식물 바이러스 벡터를 이용한 유용물질의 발현에 대해 많은 연구자들이 관심을 가지고 연구하고 있다.

식물 바이러스는 기주 식물체에 감염 시 수일 내에 전신감염을 일으키며 기주의 다양한 요소를 이용하여 자신의 유전체를 증식한다. 이러한 증식과정에서 바이러스가 자체적으로 가지고 있는 단백질을 다량 발현하게 된다. 또한 바이러스는 유전체의 크기가 작아 분자생물학적인 조작이 가능하여 유전체의 구조나 유전자 발현기작의 조절이 가능하다. 이러한 식물바이러스의 특징을 활용하여 외래유전자의 삽입이 가능하도록 바이러스의 유전체 구조의 조작해 유전자 전달벡터로서의 식물바이러스의 개발이 가능하다.

잠두위조바이러스 2(Broad bean wilt virus 2; BBWV2)는 코모바이러스(Comoviridae)과 파바바이러스(Fabavirus)속에 속하는 직경 약 25mm의 구형 바이러스로 1947년 잠두에서 처음 분리하여 보고된 이래, 유럽 등 세계적으로 가지과 등 여러 작물에 문제가 되고 있다. 진딧물에 의해 비영속형으로 쉽게 전염이 되며, 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물에 의한 전염율이 60~90% 정도 된다. 우리나라에서는 고추 및 착색단고추의 주요 재배지역을 중심으로 계속적으로 증가하는 바이러스이다. 1999년 전북지역에 처음으로 발병이 보고된 이후로, 2002년도에는 전남 및 경남지역 등 착색단고추 주요 재배지역으로 확산되어, 2005년 이후로는 PepMoV 다음으로 문제가 되고 있다. 병징은 잎에서는 생육시기에 따른 차이가 있어, 생육초기에 감염되면 신엽에 모자이크 및 기형 병징을 보여 PepMoV 병징과 유사한 특징을 보인다. 그러나 일반적으로 전형적인 특징은 잎에서의 병징이 거의 없거나 미약한 모자이크 병징을 보이고, 이에 반해 과실에서는 괴저 반문이나 괴저 줄무늬 병징을 보인다.

BBWV2의 비리온은 20면체(icosahedral) 입자들로서, 두 개의 단백질(LCP, SCP) 및 약 6 및 4 kb의 두 개의 단일 가닥 양성-센스 RNA 분자들로 구성된 유전체로 구성된다. 두 개의 RNA들은 기능성 단백질이 가수분해 분열에 의해 나누어진 것으로부터 하나의 다단백질로 번역된다. RNA1은 유전체 복제 및 발현에 관여하는 단백질을 코딩하고, RNA2는 이동 단백질 및 두 개의 CP를 코딩한다(Lisa and Boccardo, 1996).

국내등록특허 제10-1570765호에는 BBWV2의 감염 활성을 식물체에서 재현시키기 위해, 바이너리 벡터를 이용하여 제작된 BBWV2의 감염성 클론을 아그로박테리움 튜머페이션스 균주에 형질전환하고, 식물체에 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)하여 감염성 클론의 접종 및 감염성을 확인하였다. 상기 발명은 식물체에서 BBWV2의 감염활성을 지속적으로 재현하여, 바이러스가 발현하는 단백질의 기능을 연구하고 병원성 관여 인자를 밝혀 저항성 품종 육성의 기초 자료로 유용하게 활용될 수 있다. 그러나 상기 발명에 따른 벡터는 감염성 클론을 통해 BBWV2의 감염 활성을 식물체에서 확인할 수 있을 뿐, 그 밖에 외래 유전자가 동시에 형질전환될 때 연구 대상 단백질간의 상호작용 또는 복잡한 단백질의 작용 기전을 연구하는 것에는 한계가 있었다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 잠두위조바이러스2(Broad bean wilt virus 2; BBWV2)로부터 유래되고 식물체 내에서의 두 종의 외래 유전자를 동시에 발현시키기 위한 발현 벡터를 제조하고, 이를 이용하여 두 종의 외래 유전자를 식물체내에서 동시에 발현시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 식물체, 바람직하게 고추 또는 담배를 감염시킬 수 있는 잠두위조바이러스2(Broad bean wilt virus 2; BBWV2)의 감염성 cDNA 클론(국내등록특허 제10-1570765호)를 이용하여, 유전공학적 조작을 통해 두 종의 외래 유전자 동시 발현용 벡터를 제조하였다. 제작된 유전자 전달 벡터는 pBBWV2-OEx2로 명명되었으며, 이는 BBWV2의 RNA1 또는 RNA2가 각각 포함된 pBBWV2-R1 및 pBBWV2-R2-OEx2로 구성된다 (도 1).

본 발명자들은 pBBWV2-OEx2 벡터를 이용하여, 일부분의 유전자 삽입 카세트(cassette)에 스크리닝 가능한 표식 유전자인 녹색형광단백질(GFP) 유전자를 삽입하고, 또 다른 유전자 삽입 카세트에 핵 국재화 신호(nuclear localizaion signal)(NLS)을 포함하는 청색형광단백질(CFP) 유전자(NLS-CFP)를 동시에 삽입하여 두 종의 외래 유전자 동시 발현용 벡터(pBBWV2-OEx2-GFP/nCFP)를 제조하였다. 이후 상기 벡터를 아그로박테리움 균주에 형질전환시키고 식물체에 감염시켰을 때, 상기 두 종의 외래 유전자가 세포 단위에서 동시에 발현됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 BBWV2의 RNA1을 포함하는 벡터; 및 BBWV2의 RNA2를 포함하며 두 종의 외래 유전자가 삽입될 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 벡터로 이루어진, 식물체 내에서 두 종의 외래 유전자를 동시 발현시키기 위한 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로 상기 BBWV2의 RNA1은 보조인자 프로테아제(cofactor protease, Co-Pro), NTP-결합 모티프(NTP-binding motif, NTBM), 게놈 연결 바이러스 단백질 (genome-linked viral protein, VPg), 피코나인 3C-유사 프로테아제(picornain 3C-like protease, Pro), 및 RNA 의존 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) 유전자를 포함한다. 상기 BBWV2의 RNA2는 이동 단백질(movement protein, MP), 라지 코트 단백질(large coat protein, LCP), 및 스몰 코트 단백질(small coat protein, SCP) 유전자를 포함한다. 특히, 본 발명의 벡터에서 BBWV2의 RNA2에는 듀얼 유전자 삽입 카세트(cassette)가 포함되며, 구체적으로 상기 MP 및 상기 LCP 사이에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 부위, 및 피코나인 3C-유사 프로테아제에 의한 절단 부위를 포함한다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는 T-DNA의 왼쪽 보더(LB), CaMV(Cauliflower mosaic virus)의 듀얼 35S 프로모터, 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)(StuI, KpnI, XbaI, 및 BamHI), 시스 분해 리보자임 서열(cis-cleaving ribozyme sequence, Rz), 35S 터미네이터(T), 및 T-DNA의 오른쪽 보더(RB)를 순서대로 포함할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 기존 개발된 잠두위조바이러스2 감염성 발현용 벡터와 달리, 한번에 두 종의 외래 유전자를 동시에 발현시킬 수 있는 듀얼(dual) 벡터인 장점이 있다. 이러한 듀얼 벡터를 이용함으로써 연구 대상 단백질간의 다양한 상호작용을 연구할 수 있으며, 복잡한 단백질의 작용기전을 연구하는데 유용하게 쓰일 수 있다.

바람직하게, 상기 MP 유전자와 상기 LCP 유전자 사이에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한 효소 부위는 BglII 제한효소 부위 및 AvrII 제한효소 부위일 수 있다. 또한, 상기 발현 벡터는 도 1에 기재된 pBBWV2-OEx2 벡터(pBBWV2-R1 벡터 및 pBBWV2-R2-OEx2 벡터)의 개열 지도를 가질 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 pBBWV2-R1 벡터는 서열번호 1로 표시되는 BBWV2로부터 유래된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, pBBWV2-R2-OEx2 벡터는 서열번호 2로 표시되는 BBWV2로부터 유래된 발현 벡터가 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 본 발명은 BBWV2의 RNA1을 포함하는 벡터; 및 BBWV2의 RNA2를 포함하며 두 종의 외래 유전자가 삽입될 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 벡터로 이루어지며, 상기 두 종의 외래 유전자가 삽입될 수 있는 제한효소 부위는 BglII 제한효소 부위 및 AvrII 제한효소 부위이며, 상기 제한효소 부위는 RNA2의 MP 및 LCP 유전자 사이에 위치한, 식물체 내에서 두 종의 외래 유전자를 동시 발현시키기 위한 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선발표지를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터 또는 파세올린(phaseo세포주) 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역은 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 발현 벡터는 멀티-클로닝 부위(MCS)를 포함하며, 이러한 MCS 영역은 HEcoRI, XbaI, StuI, NcoI, BamHI, KpnI, SacI, MluI, XhoI, SrfI, SmaI, SpeI 등의 제한효소 부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 실시예에서, 본 발명의 벡터는 프로모터와 선발표지의 교환이 용이하도록 해당 서열의 경계에 제한효소 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 유전자의 종류에 따라 유용한 프로모터의 종류가 달라지며, 작물 종에 따라 선발표지의 종류로 인한 형질전환 효율이 크게 달라질 수 있으므로 프로모터 및 선발표지의 교환이 용이한 벡터는 매우 유용하다.

본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 작동 가능하게 연결되는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 식물 프로모터는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.

상기 선발표지(selective marker, 또는 선택 마커)는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 일 실시예에서, 본 발명은 도 1의 모식도로 표현되는 pBBWV2-OEx2로 명명된 두 종의 외래 유전자 동시 발현용 벡터를 제공한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 pBBWV2-OEx2 벡터는 서열번호 1로 표시되는 pBBWV2-R1 벡터 및 서열번호 2로 표시되는 pBBWV2-R2-OEx2 벡터로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터에 외래 유전자를 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 상기 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 BBWV2 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 두 종의 외래 유전자 동시 발현 방법을 제공한다.

상기 외래 유전자는 제초제 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 또는 과실의 품질에 영향을 주는 유전자, 스크리닝 가능한 표식 유전자(GFP, NLS-CFP) 및 환경 또는 스트레스 저항성 유전자 등으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 외래 유전자는 제초제 글리포세이트(Glyphosate)의 저항성 유전자인 5-에놀피루빌시키메이트 3-포스페이트 신타아제(5-Enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase; EPSP synthase), 제초제 비알라포스(바스타)(bialaphos(Basta))의 저항성 유전자인 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제(phosphinothricin acetyltransferase), 바이러스 저항성 단백질인 코트 단백질(coat protein)을 코딩하는 유전자, 해충 저항성 유전자인 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터 분리한 Bt 독소(Bt toxin) 생성 유전자, 과실 완숙 방지를 위한 1-아미노사이클로프로판-1-카르복실릭산 디아미나아제(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid(ACC) deaminase) 유전자, 및 바이러스 저항성 식물을 용이하게 선발할 수 있는 식물체 세포의 괴사유발 유전자인 INF1(Phytophthora infestans elicitin gene) 유전자 등으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.

본 발명에서는 외래 유전자로 녹색형광단백질(GFP) 유전자, 및 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 청색형광단백질(CFP) 유전자를 사용하여, 이들의 동시 발현을 세포단위에서 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 두 종의 외래 유전자 동시 발현 방법에서 상기 식물체는 바람직하게 고추 또는 담배 식물체일 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 벡터를 식물체로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 기계적 접종(mechanical inoculation), 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method), 또는 아그로박테리움 인필트레이션(infiltration) 등을 이용할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 벡터는 아그로박테리움 인필트레이션을 통해 BBWV2 바이러스의 식물체 내 전신감염을 유도하여 형질전환될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 두 종의 외래 유전자가 동시에 발현된 형질전환된 식물체를 제공한다. 바람직하게, 상기 식물체는 고추 또는 담배일 수 있다. 이러한 형질전환 식물체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 또한, 상기 식물체는 자가 수정 및 타가 수정할 수 있는 식물체를 모두 포함한다.

본 발명의 발현 벡터는 식물체에서 두 가지의 외래 유전자를 동시에 발현함으로써 쉽고 빠르게 유전자 형질 도입이 가능하므로, 고추 또는 담배 유전자의 기능 연구 및 유용 유전자 발굴에 활용 가능하다.

또한, 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 단백질간의 다양한 상호작용 연구를 위한 실험 기법 개발이 가능하므로, 이를 통해 복잡한 단백질 작용기전을 연구하기 용이하다.

또한, 최종적으로 유전자 기능 연구를 통해 얻은 유용 유전자를 대상으로 다양한 형질 개선 작물 개발의 기초자료를 제공할 수 있다.

도 1은 BBWV2 기반의 pBBWV2-OEx2 듀얼 발현 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 2A는 pBBWV2-OEx2 벡터를 이용한 GFP 및 NLS-CFP 유전자의 동시 발현 벡터(pBBWV2-R2-OEx2-GFP/nCFP)의 모식도를 나타낸다.
도 2B는 고추 및 담배 세포에서 GFP 및 NLS-CFP를 동시 발현을 공초점 형광현미경으로 관찰한 이미지를 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 잠두위조바이러스2를 이용한 듀얼 유전자 전달 벡터의 설계 및 제작

잠두위조바이러스2를 바탕으로 한 듀얼 유전자 전달 벡터를 제작하기 위한 바이너리 벡터로서 pCassRz 벡터를 이용하였다. pCassRz 벡터는 T-DNA의 왼쪽 보더, CaMV의 듀얼 35S 프로모터, 다중 클로닝 부위 (MCS; StuI, KpnI, XbaI, BamHI), cis-절단 리보자임 서열 (Rz), 35S 터미네이터 (T), T-DNA의 오른쪽 보더를 순서대로 포함하고 있어, 이를 아그로박테리움m에 형질전환하여 아그로-인필트레이션(agro-infiltration)을 통해 식물에 원하는 유전자를 전달할 수 있다. 또한 pCassRz 벡터는 카나마이신 저항성 유전자를 포함하고 있으므로, 아그로박테리움에 형질전환 시 선택 배양할 수 있다.

BBWV2 기반 듀얼 유전자 전달 벡터를 제작하기 위해서 기 개발된 BBWV2 감염성 cDNA 클론(국내등록특허 제10-1570765호)을 이용하였다. BBWV2의 게놈은 두 개의 RNA 절편, 즉 RNA1과 RNA2로 이루어져 있다. 각각의 RNA는 하나 오픈 리딩 프레임을 코딩하고 있으며, 다단백질(polyprotein)을 발현 후 단백질 분해 가공(proteolytic processing)을 통해 바이러스의 여러 성숙 단백질을 발현한다. 이러한 BBWV2의 특징을 이용해, 기 개발한 BBWV2 감염성 cDNA 클론을 이용해 RNA2의 MP 및 LCP 시스트론 사이에, RNA1에 코딩된 Pro(picornain 3C-like protease)에 의해 절단(cleavage)이 가능한 펩타이드 서열 및 제한 효소 부위(BglII 및 AvrII)를 포함하도록 유전공학적으로 조작하여, 두 종의 외래유전자를 동시발현 할 수 있는 벡터로 개발하였다. 이렇게 제작된 BBWV2 기반 듀얼 유전자 전달 벡터를 pBBWV2-OEx2 (pBBWV2-R1 및 pBBWV2-R2-OEx2로 구성)라 명명하였다(도 1). 상기 pBBWV2-R1은 서열번호 1의 염기서열을 가지며, pBBWV2-R2-OEx2는 서열번호 2의 염기서열을 갖는다.

실시예 2: BBWV2 기반 듀얼 유전자 전달 벡터를 이용한 두 종의 외래유전자 동시 발현 검정

제작한 pBBWV2-OEx2 벡터를 이용한 두 가지 외래 유전자의 동시발현 여부를 확인하기 위해 앞쪽 유전자 삽입 카세트(gene insertion cassette)에 BglII 제한효소 사이트를 이용하여 녹색형광단백질(GFP) 유전자를 삽입하였으며, 뒤쪽 유전자 삽입 카세트에 AvrII 제한효소 사이트를 이용하여 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 청색형광단백질(CFP) 유전자를 삽입하였다. 이렇게 GFP 및 NLS-CFP가 동시에 삽입된 클론을 pBBWV2-OEx2-GFP/nCFP라 명명하였으며(도 2A), 이는 서열번호 3의 염기서열을 갖는다.

제작한 pBBWV2-OEx2-GFP/nCFP 클론의 플라스미드 DNA를 아그로박테리움 균주 EHA105에 형질전환하였다. 형질전환된 아그로박테리움을 5ml의 YEP 액체 배지 (100mg/ml의 카나마이신 및 50mg/ml의 리팜피신 포함)에서 30℃의 조건에서 16시간 동안 진탕 배양한 후 1차 배양액 1ml을 50ml의 새 YEP 배지 (50mg/ml의 카나마이신, 50mg/ml의 리팜피신, 및 20uM의 아세토시린곤(acetosyringon) 포함)에 접종하여 30℃의 조건에서 6시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 4800G에서 10분간 원심분리하여 아그로박테리움을 침전시키고, MMA 인필트레이션 버퍼 (MS 염, 10mM MES, pH5.6, 200uM 아세토시린곤)에 600nm의 파장에서 O.D. 0.7의 농도로 다시 현탁시켰다. 그 다음 현탁액을 30℃의 조건에서 2시간 동안 진탕 배양하였다.

pBBWV2-R1 또는 pBBWV2-R2-OEx2-GFP/nCFP로 각각 형질전환된 아그로박테리움 배양액을 같은 비율로 섞은 후, 고추 및 담배의 잎의 배축면에 1ml 주사기를 이용하여 압력으로 인필트레이션 하였다. pBBWV2-OEx2-GFP/nCFP에 의해 동시 발현되는 GFP의 경우 감염된 식물 세포의 세포질에서, NLS-CFP의 경우 세포의 핵에서 각각 관찰이 될 것으로 예상되었다. 접종 20일 후, 감염된 식물의 상엽을 공초점 형광현미경으로 관찰하였다. 예상과 마찬가지로 하나의 감염된 세포의 세포질에서 GFP 신호를, 핵에서 CFP 신호를 동시에 검출할 수 있었다(도 2B).

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION <120> Gene delivery vector for simultaneous expression of two foreign genes using broad bean wilt virus 2 <130> P18-133, SNU-2018-3528 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16236 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBBWV2-R1 <400> 1 gttttaataa aatattaaaa caaacagctt tcgttccgaa aacagctttc agttactaaa 60 cagctttcgt tccgattaaa cagctttcaa acaaacagct ttcatttcat tcagccattc 120 ttggtttgtg tggcttcgga aagaacccgg aaaaagggag tgtgattaaa agcgcaccat 180 atatttcgaa gatcattttg aatttcattt tgttacctta attttaagat ggatttcagt 240 atgatgcaaa tgactgtggg ttttctcaaa acttcaatgg gtttacaatc cattaaggac 300 attgtggaaa aagcctgcgt ggcggagaag gacaaaacct tgctccacat tcatttatgc 360 tttttccacg ccaatgagat ggctcgggac tataatgaag gtatggacat ggggcagata 420 caaagttctg ctgcaatcaa ataccgagct gcggtgttaa agcgccatgt tttaatgaat 480 gtggaaacgg gaagatatga tcgtgcacgc atgatgcagt acaataatga aacatgtgtt 540 aattggttct cgtgcaggat cgtcgaagaa aaggttggaa aagtgcttga cgaagaggag 600 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caacgttggc cagcctggca 7920 gacacgccag ccatgaagcg ggtcaacttt cagttgccgg cggaggatca caccaagctg 7980 aagatgtacg cggtacgcca aggcaagacc attaccgagc tgctatctga atacatcgcg 8040 cagctaccag agtaaatgag caaatgaata aatgagtaga tgaattttag cggctaaagg 8100 aggcggcatg gaaaatcaag aacaaccagg caccgacgcc gtggaatgcc ccatgtgtgg 8160 aggaacgggc ggttggccag gcgtaagcgg ctgggttgtc tgccggccct gcaatggcac 8220 tggaaccccc aagcccgagg aatcggcgtg acggtcgcaa accatccggc ccggtacaaa 8280 tcggcgcggc gctgggtgat gacctggtgg agaagttgaa ggccgcgcag gccgcccagc 8340 ggcaacgcat cgaggcagaa gcacgccccg gtgaatcgtg gcaagcggcc gctgatcgaa 8400 tccgcaaaga atcccggcaa ccgccggcag ccggtgcgcc gtcgattagg aagccgccca 8460 agggcgacga gcaaccagat tttttcgttc cgatgctcta tgacgtgggc acccgcgata 8520 gtcgcagcat catggacgtg gccgttttcc gtctgtcgaa gcgtgaccga cgagctggcg 8580 aggtgatccg ctacgagctt ccagacgggc acgtagaggt ttccgcaggg ccggccggca 8640 tggccagtgt gtgggattac gacctggtac tgatggcggt ttcccatcta accgaatcca 8700 tgaaccgata ccgggaaggg aagggagaca agcccggccg 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actgtctggc cagcgcacag 9600 ccgaagagct gcaaaaagcg cctacccttc ggtcgctgcg ctccctacgc cccgccgctt 9660 cgcgtcggcc tatcgcggcc gctggccgct caaaaatggc tggcctacgg ccaggcaatc 9720 taccagggcg cggacaagcc gcgccgtcgc cactcgaccg ccggcgccca catcaaggca 9780 ccctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 9840 acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 9900 gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 9960 tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt 10020 gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 10080 cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 10140 aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 10200 aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 10260 tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 10320 caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 10380 cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 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gctgcctgta tcgagtggtg attttgtgcc gagctgccgg 12120 tcggggagct gttggctggc tggtggcagg atatattgtg gtgtaaacaa attgacgctt 12180 agacaactta ataacacatt gcggacgttt ttaatgtact gaattaacgc cgaattaatt 12240 cgggggatct ggattttagt actggatttt ggttttagga attagaaatt ttattgatag 12300 aagtatttta caaatacaaa tacatactaa gggtttctta tatgctcaac acatgagcga 12360 aaccctatag gaaccctaat tcccttatct gggaactact cacacattat tatggagaaa 12420 ctcgagcttg tcgatcgaca gatccggtcg gcatctactc tatttctttg ccctcggacg 12480 agtgctgggg cgtcggtttc cactatcggc gagtacttct acacagccat cggtccagac 12540 ggccgcgctt ctgcgggcga tttgtgtacg cccgacagtc ccggctccgg atcggacgat 12600 tgcgtcgcat cgaccctgcg cccaagctgc atcatcgaaa ttgccgtcaa ccaagctctg 12660 atagagttgg tcaagaccaa tgcggagcat atacgcccgg agtcgtggcg atcctgcaag 12720 ctccggatgc ctccgctcga agtagcgcgt ctgctgctcc atacaagcca accacggcct 12780 ccagaagaag atgttggcga cctcgtattg ggaatccccg aacatcgcct cgctccagtc 12840 aatgaccgct gttatgcggc cattgtccgt caggacattg ttggagccga aatccgcgtg 12900 cacgaggtgc cggacttcgg ggcagtcctc ggcccaaagc atcagctcat cgagagcctg 12960 cgcgacggac gcactgacgg tgtcgtccat cacagtttgc cagtgataca catggggatc 13020 agcaatcgcg catatgaaat cacgccatgt agtgtattga ccgattcctt gcggtccgaa 13080 tgggccgaac ccgctcgtct ggctaagatc ggccgcagcg atcgcatcca tagcctccgc 13140 gaccggttgt agaacagcgg gcagttcggt ttcaggcagg tcttgcaacg tgacaccctg 13200 tgcacggcgg gagatgcaat aggtcaggct ctcgctaaac tccccaatgt caagcacttc 13260 cggaatcggg agcgcggccg atgcaaagtg ccgataaaca taacgatctt tgtagaaacc 13320 atcggcgcag ctatttaccc gcaggacata tccacgccct cctacatcga agctgaaagc 13380 acgagattct tcgccctccg agagctgcat caggtcggag acgctgtcga acttttcgat 13440 cagaaacttc tcgacagacg tcgcggtgag ttcaggcttt ttcatatctc attgcccccc 13500 gggatctgcg aaagctcgag agagatagat ttgtagagag agactggtga tttcagcgtg 13560 tcctctccaa atgaaatgaa cttccttata tagaggaagg tcttgcgaag gatagtggga 13620 ttgtgcgtca tcccttacgt cagtggagat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt 13680 ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc 13740 actgtcggca gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta 13800 ggtgccacct tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa 13860 tccgaggagg tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc 13920 tgagactgta tctttgatat tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttatc 13980 acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct 14040 cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt 14100 tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg tccttttgat 14160 gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg 14220 aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga gactgtatct ttgatattct tggagtagac 14280 gagagtgtcg tgctccacca tgttggcaag ctgctctagc caatacgcaa accgcctctc 14340 cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 14400 ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 14460 cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 14520 ggaaacagct atgaccatga ttacgaattc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 14580 ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 14640 cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 14700 ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cttgcatgcc tgcaggtcaa catggtggag 14760 cacgacactc tcgtctactc caagaatatc aaagatacag tctcagaaga ccagagggct 14820 attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct 14880 atctgtcact tcatcgaaag gacagtagaa aaggaagatg gcttctacaa atgccatcat 14940 tgcgataaag gaaaggctat cgttcaagat gcctctaccg acagtggtcc caaagatgga 15000 cccccaccca cgaggaacat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa 15060 gtggattgat gtgatggtca acatggtgga gcacgacact ctcgtctact ccaagaatat 15120 caaagataca gtctcagaag accagagggc tattgagact tttcaacaaa gggtaatatc 15180 gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcgaaa ggacagtaga 15240 aaaggaagat ggcttctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga 15300 tgcctctacc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggaaca tcgtggaaaa 15360 agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgatatct ccactgacgt 15420 aagggatgac gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc 15480 atttcatttg gagagg 15496

Claims (11)

1. 잠두위조바이러스2(Broad bean wilt virus 2, BBWV2)의 RNA1을 포함하는 벡터(pBBWV2-R1); 및
   BBWV2의 RNA2를 포함하며 두 종의 외래 유전자가 삽입될 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 벡터(pBBWV2-R2-OEx2)로 이루어지며,
   상기 두 종의 외래 유전자가 삽입될 수 있는 제한효소 부위는 BglII 제한효소 부위 및 AvrII 제한효소 부위이며,
   상기 제한효소 부위는 RNA2의 이동 단백질 유전자(MP) 및 라지 코트 단백질 유전자(LCP) 유전자 사이에 위치하며,
   상기 BBWV2의 RNA1을 포함하는 벡터(pBBWV2-R1)는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지며,
   상기 BBWV2의 RNA2를 포함하는 벡터(pBBWV2-R2-OEx2)는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진,
   고추 내에서 두 종의 외래 유전자를 동시 발현시키기 위한 발현 벡터.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 상기 발현 벡터는 도 1에 기재된 pBBWV2-R1 벡터 및 pBBWV2-R2-OEx2 벡터의 개열 지도를 갖는 고추 내에서 두 종의 외래 유전자를 동시 발현시키기 위한 발현 벡터.
8. 제1항의 발현 벡터에 외래 유전자를 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 상기 재조합 발현 벡터를 고추에 도입하는 단계를 포함하는 고추 내에서의 두 종의 외래 유전자 동시 발현 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 외래 유전자는 제초제 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 또는 과실의 품질에 영향을 주는 유전자, 스크리닝 가능한 표식 유전자 및 환경 또는 스트레스 저항성 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 고추 내에서 두 종의 외래 유전자 동시 발현 방법.
10. 삭제
11. 제8항의 방법에 의해 두 종의 외래 유전자가 동시에 발현된 형질전환된 고추.

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