KR101773365B1 - 콩 모자이크 바이러스를 이용한 두 종의 외래 유전자 동시발현용 유전자 전달 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콩 모자이크 바이러스를 이용해 두 종의 외래 유전자를 동시에 발현시킬 수 있는 유전자 발현 벡터, 이러한 벡터를 이용해 두 종의 외래 유전자를 동시에 발현시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 식물체에서 두 가지의 외래 유전자를 동시에 발현함으로써 쉽고 빠르게 유전자 형질 도입이 가능하므로, 콩 유전자의 기능 연구 및 유용 유전자 발굴에 활용 가능하다. 또한, 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 단백질간의 다양한 상호작용 연구를 위한 실험 기법 개발이 가능하므로, 이를 통해 복잡한 단백질 작용기전을 연구하기 용이하다. 또한, 최종적으로 유전자 기능 연구를 통해 얻은 유용 유전자를 대상으로 다양한 형질 개선 작물 개발의 기초자료를 제공할 수 있다.

Description

콩 모자이크 바이러스를 이용한 두 종의 외래 유전자 동시발현용 유전자 전달 벡터{Gene transfer vector for co-expressing two foreign genes using soybean mosaic virus}

본 발명은 콩 모자이크 바이러스를 이용해 두 종의 외래 유전자를 동시에 발현시킬 수 있는 유전자 발현 벡터, 이러한 벡터를 이용해 두 종의 외래 유전자를 동시에 발현시키는 방법 및 이러한 방법으로 제작된 형질전환체에 관한 것이다.

일반적으로 외래 유전자가 다른 세포에 삽입되어 하나의 독립적인 복제가능단위(replicon)를 형성하거나 혹은 동종 재조합(homologous recombination)에 의해 도입된 세포의 게놈 속으로 통합되어 계속적인 복제가 가능하고, 유전자 발현이 됨으로써 새로운 형질을 나타내도록 하는 것을 형질전환이라고 한다. 이와 같이 외래 유전자의 도입이 가능해 짐에 따라 원하는 유전자를 원하는 세포에서 대량으로 발현할 수 있게 되었으며, 이러한 재조합 DNA 기술은 현대 유전공학 발전의 핵심이라 할 수 있다.

특히, 식물 또는 동물들에게서 인간에게 유용한 특성을 발휘할 수 있도록 외래 유전자를 도입하여 형질전환식물 또는 형질전환동물을 제조하는 기술분야에 관한 연구가 활발하며, 그중에서도 동물에 비하여 식물을 대상으로 한 유전자 조작은 더욱 실용화 단계에 와있다. 형질전환 식물에서 목적 유전자를 산업적으로 발현시킨 것은 1984년에 세균 유래의 유전자를 담배에서 발현시킴으로 처음 보고되었다(Gasser, C.S. et al., Science, 244, 1293-9, 1989). 최근 유전공학적 변형작물을 이용한 고부가가치의 치료용 물질의 생산에 대하여 많은 연구가 진행되고 또한 치료용 단백질 등 유용물질의 생산성 향상에 관한 여러 가지 방법들이 연구되고 있다. 현재 바이오산업이 발전함에 따라, 식물을 생산공장으로 활용하여 고부가가치의 다양한 유용단백질을 생산하고, 대규모 재배가 가능한 주체인 식물을 이용하여 고부가가치의 유용단백질을 값싸게 대량으로 생산할 수 있는 기술에 대한 기대가 커지고 있다. 또한 식물을 이용한 생산은 동물세포배양에 비하여는 약 1/30, 미생물 발효에 비하여 약 1/3의 비용이 소요되므로 쉽게 산업화할 수 있는 장점을 가지고 있다. 그 중에서도 식물 바이러스 벡터를 이용한 유용물질의 발현에 대해 많은 연구자들이 관심을 가지고 연구하고 있다.

식물 바이러스는 기주식물체에 감염 시 수일 내에 전신감염을 일으키며 기주의 다양한 요소를 이용하여 자신의 유전체를 증식한다. 이러한 증식과정에서 바이러스가 자체적으로 가지고 있는 단백질을 다량 발현하게 된다. 또한 바이러스는 유전체의 크기가 작아 분자생물학적인 조작이 가능하여 유전체의 구조나 유전자 발현기작의 조절이 가능하다. 이러한 식물바이러스의 특징을 활용하여 외래유전자의 삽입이 가능하도록 바이러스의 유전체 구조의 조작해 유전자 전달벡터로서의 식물바이러스의 개발이 가능하다.

콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus; SMV)는 단일가닥의 RNA로 이루어진 핵산을 가지고 있으며, 전체 게놈 사이즈는 10.4Kb에 달하고 (Genomic nucleic acid isolated by Hill and Benner;1978,1980), Eggenberger, A. L.에 의해 콩 모자이크 바이러스의 전체 게놈 구성 단백질의 위치를 확인할 수 있다(Stark, D.M. and Beachy, R. N.; J. Gen. Virol. 70, 1853-1860, 1989). 바이러스 감염에 기주 특이적으로 관여하는 단백질인 P1 단백질(132-1055bp)과 HC-Pro 단백질(1056-2426), 외피단백질인 코트 단백질(Coat protein(8535-9329))을 가지고 있다. 프로테아제(Protease)를 생성하는 P1과 HC-Pro 단백질은 진딧물을 매개로 전염되는 바이러스 감염에 특이적 공여자(Helper) 역할을 수행한다. 또한 코트 단백질은(Coat protein)은 바이러스의 외피를 형성하는 단백질로 모든 바이러스가 일괄적으로 가지고 있는 부분이다.

한국특허등록번호 제10-1122955호는 콩 모자이크 바이러스의 감염성 클론을 이용한 식물체내에서의 외래 유전자 과발현 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 콩 모자이크 바이러스의 전체 게놈과 CaMV 프로모터 및 제한효소 절단부위를 함유하는 목적 유전자의 식물 발현용 벡터 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다. 상기 발명에 따른 식물발현용 벡터를 사용하면, 콩 모자이크 바이러스의 감염성 클론을 활용하여 식물체 내에서 유용 단백질을 과발현할 수 있고 유전자 침묵현상에 의한 저해도 받지 않는 시스템을 개발함으로써, 유용 단백질을 식물체 내에서 간편하고 저비용으로 대량 생산하는 분자농업에서 유용하게 활용될 수 있음이 개시되어 있다. 그러나 상기 발명에 따른 벡터는 한가지 외래 유전자만을 전달할 수 있기 때문에, 다수의 외래 유전자가 동시에 형질전환될 때 연구 대상 단백질간의 상호작용 또는 복잡한 단백질의 작용기전을 연구하는 것에는 한계가 있었다. 또한 단백질은 많은 경우 2종 이상의 단백질이 복합체를 이루었을 때 세포내 활성을 나타내기 때문에, 특정 단백질의 경우 단독으로 과발현하더라도 그 기능을 연구하는데 한계가 있었다.

본 발명자들은 다양한 품종의 콩에 감염할 수 있는 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus; SMV) G7H 균주를 바탕으로 단일 외래유전자 발현 벡터(pSMV-MCS)를 이용하여 유전공학적 조작을 통해 두 종의 외래유전자 동시발현용 벡터(pSMV-DUAL)를 제작하였다. 제작한 pSMV-DUAL 벡터는 T-DNA의 구조를 가지고 있으며, Cauliflower mosaic virus (CaMV)의 35S promoter 및 ribozyme 서열과 nopaline synthase의 poly(A) 신호 서열을 포함하고 있으며, 플라스미드 DNA를 이용하여 기계적 접종 방법을 통해 직접적으로 식물체를 감염할 수 있도록 설계되었다. 외래 유전자의 산물로써 FLAG tag(peptide sequence DYKDDDK)를 함유하는 green fluorescence protein(Flag-GFP)와 nuclear localization signal을 함유하는 cyan fluorescence protein(NLS-CFP)의 동시발현을 세포단위에서 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus; SMV)로부터 유래되고 식물체 내에서의 두 종의 외래 유전자를 동시에 발현시키기 위한 발현벡터를 제조하고, 이를 이용하여 두 종의 외래 유전자를 식물체내에서 동시에 발현시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus; SMV)의 프로테아제 1(Protease 1; P1) 코딩 유전자, 바이러스 감염에 특이적 공여자(helper component/protease; HC-Pro) 코딩 유전자, 프로테아제 3(Protease 3; P3) 코딩 유전자, 원통형 봉입체(cylindrical inclusion; CI) 유전자, 핵내 봉입체 a 단백질 프로테아제(nuclear inclusion ‘a’ protein protease; NIa-pro) 코딩 유전자, 핵내 봉입체 b 단백질(nuclear inclusion ‘b’ protein; NIb) 코딩 유전자 및 코트 단백질(coat protein; CP) 코딩 유전자; 상기 P1 유전자와 상기 HC-Pro 유전자 사이 및 상기 NIb 유전자와 상기 CP 유전자 사이에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한 효소 부위; 상기 P1 프로테아제와 NIa 프로테아제에 의한 절단 부위 및 상기 NIa 프로테아제에 의한 절단 부위; 및 리보자임(Rz), 2개의 35S 프로모터 및 NOS-poly A 신호를 포함하는 SMV로부터 유래된, 식물체 내에서의 두 종의 외래 유전자를 동시 발현시키기 위한 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 발현벡터는 기존 개발된 단일 외래 유전자 전달용 콩 모자이크 바이러스 벡터와 달리, 한번에 두 종의 외래 유전자를 동시에 발현시킬 수 있는 DUAL 벡터인 장점이 있다. 이러한 DUAL 벡터를 이용함으로써 연구 대상 단백질간의 다양한 상호작용을 연구할 수 있으며, 복잡한 단백질의 작용기전을 연구하는데 유용하게 쓰일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 서열번호 1로 표시되는 SMV로부터 유래된 pSMV-DUAL이 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 P1 유전자와 상기 HC-Pro 유전자 사이에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한 효소 부위는 XbaI 및 MluI일 수 있다. 또한, 상기 NIb 유전자와 상기 CP 유전자 사이에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한 효소 부위는 SalI 및 SnaBI일 수 있다. 또한, 상기 발현벡터는 도 2에 기재된 pSMV-DUAL 벡터의 개열 지도를 가질 수 있다.

본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선발표지를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터 또는 파세올린(phaseo세포주) 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역은 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

바람직하게, 본 발명의 벡터는 멀티-클로닝 부위(MCS)를 포함하며, 이러한 MCS 영역은 HEcoRI, XbaI, StuI, NcoI, BamHI, KpnI, SacI, MluI, XhoI, SrfI, SmaI, SpeI 등의 제한효소 부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게, 본 발명의 벡터는 프로모터와 선발표지의 교환이 용이하도록 해당 서열의 경계에 제한효소 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 유전자의 종류에 따라 유용한 프로모터의 종류가 달라지며, 작물 종에 따라 선발표지의 종류로 인한 형질전환 효율이 크게 달라질 수 있으므로 프로모터 및 선발표지의 교환이 용이한 벡터는 매우 유용하다.

본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 식물 프로모터는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149호; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.

상기 선발표지(selective marker, 또는 선택 마커)는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

종합하면, 바람직하게, 본 발명은 도 2의 모식도로 표현되는 pSMV-DUAL이라고 명명된 두 종의 외래 유전자 동시 발현용 벡터를 제공하며, 더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 pSMV-DUAL 벡터는 서열번호 1의 염기서열을 갖는다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터에 외래 유전자를 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하고, 상기 재조합 발현벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 SMV 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 두 종의 외래 유전자 동시 발현 방법을 제공한다.

상기 외래 유전자는 제초제 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 또는 과실의 품질에 영향을 주는 유전자, 스크리닝 가능한 표식 유전자 및 환경 또는 스트레스 저항성 유전자 등으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 외래 유전자는 제초제 글리포세이트(Glyphosate)의 저항성 유전자인 5-에놀피루빌시키메이트 3-포스페이트 신타아제(5-Enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase; EPSP synthase), 제초제 비알라포스(바스타)(bialaphos(Basta))의 저항성 유전자인 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제(phosphinothricin acetyltransferase), 바이러스 저항성 단백질인 코트 단백질(coat protein)을 코딩하는 유전자, 해충 저항성 유전자인 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터 분리한 Bt 독소(Bt toxin) 생성 유전자, 과실 완숙 방지를 위한 1-아미노사이클로프로판-1-카르복실릭산 디아미나아제(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid(ACC) deaminase) 유전자, 및 바이러스 저항성 식물을 용이하게 선발할 수 있는 식물체 세포의 괴사유발 유전자인 INF1(Phytophthora infestans elicitin gene) 유전자 등으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.

본 발명에서는 외래 유전자로 FLAG tag(peptide sequence DYKDDDK)를 함유하는 green fluorescence protein(Flag-GFP)와 nuclear localization signal을 함유하는 cyan fluorescence protein(NLS-CFP)를 사용하여, 이들의 동시 발현을 세포단위에서 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 두 종의 외래 유전자 동시 발현 방법에서 상기 식물체는 콩일 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 벡터를 식물체로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 기계적 접종(mechanical inoculation), 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method) 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method) 등을 이용할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 벡터는 기계적 접종을 통해 SMV 바이러스의 식물체내 전신감염을 유도하여 형질전환될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 두 종의 외래 유전자가 동시에 발현된 형질전환된 식물체를 제공한다. 바람직하게, 상기 식물체는 콩일 수 있다. 이러한 형질전환 식물체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 또한, 상기 식물체는 자가 수정 및 타가 수정할 수 있는 식물체를 모두 포함한다.

본 발명의 발현 벡터는 식물체에서 두 가지의 외래 유전자를 동시에 발현함으로써 쉽고 빠르게 유전자 형질 도입이 가능하므로, 콩 유전자의 기능 연구 및 유용 유전자 발굴에 활용 가능하다.

또한, 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 단백질간의 다양한 상호작용 연구를 위한 실험 기법 개발이 가능하므로, 이를 통해 복잡한 단백질 작용기전을 연구하기 용이하다.

또한, 최종적으로 유전자 기능 연구를 통해 얻은 유용 유전자를 대상으로 다양한 형질 개선 작물 개발의 기초자료를 제공할 수 있다.

도 1은 pSNU1 벡터의 구조 모식도를 나타낸다.
도 2는 SMV 기반 단일 발현 벡터 및 DUAL 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 3은 pSMV-DUAL 벡터를 이용한 GFP와 CFP 유전자의 동시 발현 클론의 모식도를 나타낸다.
도 4는 pSMV-DUAL 벡터를 이용한 Flag-GFP와 NLS-CFP의 동시발현을 공초점형광현미경으로 관찰한 이미지를 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 콩 모자이크 바이러스를 이용한 DUAL 벡터의 설계 및 제작

콩 모자이크 바이러스(SMV)를 바탕으로 한 DUAL 벡터를 제작하기 위한 binary 벡터로서 pSNU1 벡터를 이용하였다(도 1). pSNU1 벡터는 T-DNA의 left border, CaMV의 double 35S promoter, multiple cloning site (MCS, EcoRI, XbaI, StuI, NcoI, BamHI, KpnI, SacI, MluI, XhoI, SrfI, SmaI, SpeI), cis-cleaving ribozyme sequence (Rz), NOS terminator (NOS poly-A), T-DNA의 right border를 순서대로 포함하고 있어 식물세포 내로 전달 시 식물의 전사체계를 이용하여 도입된 유전자를 발현할 수 있다. 또한 pSNU1 벡터는 카나마이신 저항성 유전자를 포함하고 있다. 상기 콩 모자이크 바이러스 G7H strain의 전체 유전체는 Genbank # FJ807700로 개시되어 있다.

SMV 기반 DUAL 벡터를 제작하기 위해서 기 개발한 SMV 단일 유전자 전달 벡터(pSMV-MCS)를 이용하였다(도 2). SMV는 한 개의 Open reading frame (ORF)을 바탕으로 proteolytic processing을 통해 바이러스의 다양한 단백질을 발현한다. 이러한 SMV의 특징을 이용해 기 개발한 SMV 단일 유전자 전달 벡터에는 P1과 HC-pro cistron 사이에 P1과 NIa-pro에 의해 cleavage가 가능한 peptide 서열 및 제한 효소 사이트(XbaI과 MluI)를 포함하도록 유전공학적으로 조작하였다. 이렇게 제작된 단일 유전자 전달 벡터는 pSMV-MCS라 명명된 바 있다(한국특허등록번호 제10-1122955호). 본 발명에서는 pSMV-MCS를 바탕으로 NIb와 CP cistron 사이에 추가적으로 NIa-pro에 의해 cleavage가 가능한 peptide 서열(--Q/SVDYVESVSLQ/S--) 및 제한 효소 사이트 (SalI과 SnaBI)를 포함하도록 조작하여 두 종의 외래 유전자 동시발현용 벡터로 개발하고 pSMV-DUAL이라 명명하였으며, 이는 서열번호 1로 표시된다(도 2).

실시예 2: SMV 기반 DUAL 벡터를 이용한 두 종의 외래 유전자 동시발현 검정

제작한 pSMV-DUAL 벡터를 이용한 두 가지 외래 유전자의 동시발현 여부를 확인하기 위해 P1과 HC-Pro 사이에 위치한 XbaI과 MluI 제한효소 사이트를 이용하여 Flag-GFP 유전자를 삽입하였으며, NIb와 CP 사이에 위치한 SalI 제한효소 사이트를 이용하여 NLS-CFP 유전자를 삽입하였다. 이를 위해 Flag-GFP 유전자를 프라이머 (5‘-GCTCTAGAGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'(서열번호 2) 와 5’-AACGACGCGTGAGGATCCCCTTGTACAGCT-3'(서열번호 3))를 이용하여 PCR을 통해 증폭한 후 XbaI과 MluI 제한 효소로 처리하여 pSMV-DUAL 벡터의 XbaI과 MluI 제한 효소 사이트에 삽입하였다. NLS-CFP 유전자의 경우 프라이머 (5‘-ACGCGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'(서열번호 4) 와 5’-ACGCGTCGACGACCTTTCTCTTCTTCTTTGGAG-3'(서열번호 5))를 이용하여 PCR을 통해 증폭한 후 SalI 제한 효소로 처리하여 pSMV-DUAL 벡터의 SalI 제한 효소 사이트에 삽입하였다. 이렇게 Flag-GFP와 NLS-CFP를 동시에 삽입한 클론을 pSMV-DUAL-fGFP/nCFP라 명명하고, 이는 서열번호 6으로 표시된다(도 3).

제작한 pSMV-DUAL-fGFP/nCFP 클론의 플라스미드 DNA 5μg을 콩 (품종 Lee74)의 잎에 기계접종(mechanical inoculation)하여 SMV 바이러스의 식물체내 전신감염을 유도하였다. 접종엽에 적당량의 carborundum을 뿌린 후, 접종버퍼(0.05M potassium phosphate, pH 7.5)에 희석한 5μg의 클론 plasmid DNA를 손가락으로 가볍게 문질러 접종을 실시하였다. pSMV-DUAL-fGFP/nCFP에 의해 동시발현되는 Flag-GFP의 경우 감염된 콩 세포의 cytoplasm에서, NLS-CFP의 경우 세포의 핵에서 각각 관찰이 될 것으로 예상할 수 있다. 접종 20일 후, 감염된 콩의 상엽을 공초점형광 현미경으로 관찰하였다. 실험 결과, 예상했던 바와 같이 하나의 감염된 세포의 cytoplasm에서 GFP signal을, 핵에서 CFP signal을 동시에 검출할 수 있었다(도 4).

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Gene transfer vector for co-expressing two foreign genes using soybean mosaic virus <130> 2015-0332-10-A/P15-266 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 17320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSMV-DUAL_complete_sequence <400> 1 aaattaaaac tcgttataaa gacaacaaac aactcaaacg caaacagaaa ttttcgtaac 60 tacatttcta caagcaacca ttactctagc tatttgcagt ttcacatttc ctcacagcag 120 cagcaagtca aatggcaaca atcatgattg gaagcatggc gatttctgtg ccaaacaccc 180 acatattgtg cgcatcgaat tctgtgatgc cagttcaagc agttcagatg gcaaaacaag 240 tgccttctgc tcgaggggtg ttatacacac ttaaaagaga gggcaacacg caagtgcata 300 agtatgagga ggcactgcgc aaatttcaag aagcatttga ccaagatgtt ggcattcagc 360 gaaggcttct ggtaaacaag catagttcca tacaatccac aaagaagaat ggtttgacct 420 tgcgtcgctt aactttagag caggctcgag caaaagaagc ggcaattgca aggcgaaggc 480 aagaagagga agactttctc aatgggaaat atgaacagca attttatgct ggtgtttccg 540 ctacaaagtc catgaagttt gaaggaggga gtgttgggtt 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cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg 9600 ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca 9660 agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg 9720 gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacatca 9780 gccacaacgt ctatatcacc gccgacaagc agaagaacgg catcaaggcc aacttcaaga 9840 tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc 9900 ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc 9960 tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg 10020 ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagatggc tccaaagaag aagagaaagg 10080 tcgtcgacta cgtagagtcc gtatctttac agtcaggtaa ggagaaggaa ggagatatgg 10140 atgcaggtaa ggatccaaag aagagcacca gcagtaataa gggagctggc acaagcagca 10200 aagatgtaaa tgttggatca aagggaaagg tggttccgcg tttgcagaag attacaagga 10260 agatgaatct tccaatggtt gaagggaaga tcattctcag tttggaccac ttgcttgagt 10320 ataaacctaa tcaggttgat ttattcaaca ctcgagcaac aagaacacag ttcgaagcat 10380 ggtacaatgc agttaaagat gaatatgagc ttgatgatga gcagatgggt gtggttatga 10440 atggtttcat ggtatggtgc attgacaatg gcacatcccc agatgccaat ggcgtgtggg 10500 tgatgatgga tggagaggaa cagattgaat atccgctgaa acccattgtt gaaaatgcaa 10560 aaccaacttt gagacaaatc atgcatcatt tctcagatgc agcagaagca tacattgaga 10620 tgaggaattc tgaaagtccg tatatgccta gatatggact actaaggaat ttgagagata 10680 gagagctggc ccgctatgct tttgatttct atgaggttac ttctaaaaca ccaaacaggg 10740 caagggaagc aatagcgcaa atgaaggctg cagctctctc gggagttaac aacaagttgt 10800 ttggacttga tgggaacatc tcaaccaact ccgaaaatac tgaaaggcat actgcaaggg 10860 atgtgaatca aaacatgcac actcttttgg gcatgggtcc acagcagtaa aggctaagta 10920 aattggccac agttatcatt tcgggtcgct gtatagttta ttataatata gtagttacac 10980 tgtctctaag tgtagtgtga ttgcatcacc aaataatgct tttgtttagt gtggtttcga 11040 ccaccccagt gtgctttatg ttatagttta tgaatggcag ggagaaccat tgtgttgccg 11100 gagcccttta aagagtgatt gcatcacgtc tagtggccga ggtgcggcaa tgtttgttgt 11160 cctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaat 11220 tttaaccgcg aattccagct agtctagcgc gtctcgaggc ccgggcacta gtgtctgtac 11280 ttatatcagt acactgacga gtccctaaag gacgaaacgg gagaacgcta gccaccacca 11340 ccaccaccac gtgtgaatta caggtgacca gctcgaattt ccccgatcgt tcaaacattt 11400 ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat 11460 ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga 11520 gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa 11580 tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcggg 11640 aattaaacta tcagtgtttg acaggatata ttggcgggta aacctaagag aaaagagcgt 11700 ttattagaat aacggatatt taaaagggcg tgaaaaggtt tatccgttcg tccatttgta 11760 tgtgcatgcc aaccacaggg ttcccctcgg gatcaaagta ctttgatcca acccctccgc 11820 tgctatagtg cagtcggctt ctgacgttca gtgcagccgt cttctgaaaa cgacatgtcg 11880 cacaagtcct aagttacgcg acaggctgcc gccctgccct tttcctggcg ttttcttgtc 11940 gcgtgtttta gtcgcataaa gtagaatact tgcgactaga accggagaca ttacgccatg 12000 aacaagagcg ccgccgctgg cctgctgggc tatgcccgcg tcagcaccga cgaccaggac 12060 ttgaccaacc aacgggccga actgcacgcg gccggctgca ccaagctgtt ttccgagaag 12120 atcaccggca ccaggcgcga ccgcccggag ctggccagga tgcttgacca cctacgccct 12180 ggcgacgttg tgacagtgac caggctagac cgcctggccc gcagcacccg cgacctactg 12240 gacattgccg agcgcatcca ggaggccggc gcgggcctgc gtagcctggc agagccgtgg 12300 gccgacacca ccacgccggc cggccgcatg gtgttgaccg tgttcgccgg cattgccgag 12360 ttcgagcgtt ccctaatcat cgaccgcacc cggagcgggc gcgaggccgc caaggcccga 12420 ggcgtgaagt ttggcccccg ccctaccctc accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag 12480 ctgatcgacc aggaaggccg caccgtgaaa gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc 12540 tcgaccctgt accgcgcact tgagcgcagc gaggaagtga cgcccaccga ggccaggcgg 12600 cgcggtgcct tccgtgagga cgcattgacc gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat 12660 gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca 12720 ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg cggccgggta cgtgttcgag ccgcccgcgc 12780 acgtctcaac cgtgcggctg catgaaatcc tggccggttt gtctgatgcc aagctggcgg 12840 cctggccggc cagcttggcc gctgaagaaa ccgagcgccg ccgtctaaaa aggtgatgtg 12900 tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata 12960 aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc 13020 aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt 13080 tctgttagtc gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga 13140 tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat 13200 cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc 13260 cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg 13320 ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct 13380 acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc 13440 cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag 13500 ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc 13560 tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga aattaaatca aaactcattt gagttaatga 13620 ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc 13680 agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac 13740 tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag 13800 accattaccg agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga 13860 ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc 13920 aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag 13980 cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc 14040 gtgacggtcg caaaccatcc ggcccggtac aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg 14100 tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc 14160 ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg 14220 cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg 14280 ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt 14340 tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg 14400 ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg 14460 tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag 14520 acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag 14580 ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc 14640 acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg 14700 gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca 14760 tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg 14820 tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc 14880 gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag acgatctacg 14940 aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg 15000 ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc 15060 tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg 15120 agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg 15180 tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg 15240 ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta agtgactgat ataaaagaga 15300 aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc 15360 tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc 15420 ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg gcctatcgcg gccgctggcc 15480 gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt 15540 cgccactcga ccgccggcgc ccacatcaag gcaccctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac 15600 ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat 15660 gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca 15720 gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag 15780 agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga 15840 gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 15900 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 15960 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 16020 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 16080 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 16140 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 16200 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ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 18720 aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta 18780 tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga gg 18832

Claims (8)

1. 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus; SMV)의 프로테아제 1(Protease 1; P1) 코딩 유전자, 바이러스 감염에 특이적 공여자(helper component/protease; HC-Pro) 코딩 유전자, 프로테아제 3(Protease 3; P3) 코딩 유전자, 원통형 봉입체(cylindrical inclusion; CI) 유전자, 핵내 봉입체 a 단백질 프로테아제(nuclear inclusion ‘a’ protein protease; NIa-pro) 코딩 유전자, 핵내 봉입체 b 단백질(nuclear inclusion ‘b’ protein; NIb) 코딩 유전자 및 코트 단백질(coat protein; CP) 코딩 유전자;
   상기 P1 유전자와 상기 HC-Pro 유전자 사이에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 XbaI 및 MluI 제한 효소 부위, 및 상기 NIb 유전자와 상기 CP 유전자 사이에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 SalI 및 SnaBI 제한 효소 부위;
   상기 P1 프로테아제와 NIa 프로테아제에 의한 절단 부위 및 상기 NIa 프로테아제에 의한 절단 부위; 및
   리보자임(Rz), 2개의 35S 프로모터 및 NOS-poly A 신호를 포함하는 SMV로부터 유래된, 식물체 내에서의 두 종의 외래 유전자를 동시 발현시키기 위한 발현벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 서열번호 1인 것을 특징으로 하는 SMV로부터 유래된 것을 특징으로 하는 식물체 내에서의 두 종의 외래 유전자를 동시 발현시키기 위한 발현벡터.
3. 제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 2에 기재된 pSMV-DUAL 벡터의 개열 지도를 갖는 것을 특징으로 하는 식물체 내에서의 두 종의 외래 유전자를 동시 발현시키기 위한 발현벡터.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항의 발현벡터에 외래 유전자를 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하고, 상기 재조합 발현벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 SMV 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 두 종의 외래 유전자 동시 발현 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 외래 유전자는 제초제 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 또는 과실의 품질에 영향을 주는 유전자, 스크리닝 가능한 표식 유전자 및 환경 또는 스트레스 저항성 유전자로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 SMV 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 두 종의 외래 유전자 동시 발현 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 콩인 것을 특징으로 하는 SMV 감염성 클론을 이용한 식물체 내에서의 두 종의 외래 유전자 동시 발현 방법.

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