CN111269930A

CN111269930A - 一种检测丝状真菌转化体系遗传稳定性的方法

Info

Publication number: CN111269930A
Application number: CN202010093047.2A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 颜正飞; 鲁梦唯
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2020-06-12

Abstract

本发明公开了一种检测黑曲霉转化体系遗传稳定性的方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种可用于转化黑曲霉等丝状真菌且可用于检测黑曲霉转化体系等丝状真菌转化体系遗传稳定性的重组质粒，此重组质粒同时携带GUS报告基因和目的基因，使用此重组质粒将目的基因转化至丝状真菌的基因组时，可通过简单的将重组丝状真菌长出的菌丝进行GUS染色来判断目的基因是否转化成功，筛选效率高；使用此重组质粒检测丝状真菌转化体系遗传稳定性时，也可通过简单的将传代后的重组丝状真菌长出的菌丝进行GUS染色来判断重组丝状真菌中目的基因的遗传是否稳定，检测效率高。

Description

一种检测丝状真菌转化体系遗传稳定性的方法

技术领域

本发明涉及一种检测丝状真菌转化体系遗传稳定性的方法，属于生物技术领域。

背景技术

黑曲霉(Aspergillus niger)是一种真核微生物，属于丝状真菌，其作为重要的细胞工厂已有100多年的历史，主要被用于生产酶(淀粉酶类、果胶酶和木聚糖酶)和有机酸(如柠檬酸)。与此同时，黑曲霉属于美国FDA认证的安全级微生物菌种(GenerallyRecognized as Safe，GRAS)，其所产产物的应用基本上不会对人类和环境造成任何伤害。此外，黑曲霉还具有高产、高分泌等优势，这使得黑曲霉成为了异源蛋白表达的理想宿主菌。因此，黑曲霉在现代发酵工业中的重要性不言而喻。

在将黑曲霉应用于生产酶和有机酸等产物的过程中，通过基因工程手段将不同来源的基因转化至黑曲霉的基因组中以获得可表达不同外源基因的重组黑曲霉十分关键。但是，黑曲霉的基因组是多倍体。对微生物进行基因工程改造时，最困难的就是面对多倍体现象。这主要是因为多倍体在分裂繁殖时，会发生同源染色体分离，很难把改造遗传给所有子代，遗传稳定性很差。因此，建立一种有效的检测黑曲霉转化体系遗传稳定性的方法十分关键。

目前，常通过核酸水平检测和蛋白水平检测两种方法检测黑曲霉转化体系的遗传稳定性。其中，核酸水平检测主要是通过先将携带目的基因的重组黑曲霉进行传代，然后根据目的基因涉及特异性引物，接着用体外PCR扩增的方法对传代后的重组黑曲霉的基因组进行定性检测，最后根据传代后的重组黑曲霉是否还携带有目的基因来判断重组黑曲霉的遗传稳定性，但是，由于体外PCR扩增具有很强的不确定性，使用此方法检测黑曲霉转化体系遗传稳定性的准确度不高；蛋白水平检测主要是通过先将携带目的基因的重组黑曲霉进行高密度发酵，然后用SDS-PAGE分析发酵上清液中是否含有目的蛋白，最后根据目的蛋白的表达量来判断重组黑曲霉的遗传稳定性，但是，由于发酵耗时较长，并且，SDS-PAGE分析过程较为复杂，使用此方法检测黑曲霉转化体系遗传稳定性的效率不高。

因此，急需找到一种准确性高且效率高的检测黑曲霉转化体系遗传稳定性的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种准确性高且效率高的检测黑曲霉等丝状真菌转化体系遗传稳定性的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒包含编码启动子的基因、第一酶切位点、GUS报告基因、第二酶切位点、目的基因、编码终止子的基因和抗性基因。

在本发明的一种实施方式中，所述编码启动子的基因位于GUS报告基因的上游；所述编码终止子的基因位于GUS报告基因的下游。

在本发明的一种实施方式中，所述第一酶切位点位于编码启动子的基因的下游且位于GUS报告基因的上游；所述第二酶切位点位于GUS报告基因的下游且位于目的基因的上游。

在本发明的一种实施方式中，所述抗性基因位于编码启动子的基因的上游且所述抗性基因的编码顺序与编码启动子的基因的编码顺序相反。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒包含CaMV 35S启动子以及Ori复制原点。

在本发明的一种实施方式中，所述CaMV 35S启动子位于抗性基因和编码启动子的基因之间，且所述CaMV 35S启动子的编码顺序与编码启动子的基因的编码顺序相反。

在本发明的一种实施方式中，所述CaMV 35S启动子位于抗性基因和编码终止子的基因的基因之间，且所述CaMV 35S启动子的编码顺序与编码终止子的基因的编码顺序相反。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因位于第二酶切位点的的下游且位于编码终止子的基因的上游。

在本发明的一种实施方式中，所述第一酶切位点为BamH I、Hind III、Not I或SmaI。

在本发明的一种实施方式中，所述第一酶切位点为BamH I。

在本发明的一种实施方式中，所述BamH I的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子为糖化酶启动子PglaA。

在本发明的一种实施方式中，所述糖化酶启动子PglaA来源于黑曲霉(Aspergillus niger)。

在本发明的一种实施方式中，编码所述糖化酶启动子PglaA的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述GUS报告基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述终止子为糖化酶终止子TglaA。

在本发明的一种实施方式中，所述糖化酶终止子TglaA来源于黑曲霉(Aspergillus niger)。

在本发明的一种实施方式中，编码所述糖化酶终止子TglaA的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述CaMV 35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述抗性基因为潮霉素抗性基因和/或卡那霉素抗性基因、乙酰胺酶基因。

在本发明的一种实施方式中，所述潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述卡那霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示。

在本发明的一种实施方式中，所述Ori复制原点的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

在本发明的一种实施方式中，所述第二酶切位点为BamH I、Hind III、Not I或SmaI。

在本发明的一种实施方式中，所述第二酶切位点为Hind III。

在本发明的一种实施方式中，所述Hind III的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因为编码α-葡萄糖苷酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述编码α-葡萄糖苷酶的基因的核苷酸序列如SEQID No.10所示。

本发明还提供了一种转化丝状真菌的方法，所述方法为先用上述重组质粒转化农杆菌(Agrobacterium)，得到重组农杆菌，然后用重组农杆菌转化丝状真菌，得到重组丝状真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为用上述重组质粒转化农杆菌(Agrobacterium)，得到转化子；将转化子涂布于含有抗生素的固体培养基上进行培养，筛选阳性转化子A，此阳性转化子A即为重组农杆菌；挑取阳性转化子A接种至含有抗生素的液体培养基中进行培养，得到重组农杆菌菌液；取丝状真菌菌丝接种至固体培养基上培养至孢子生成；洗脱孢子，得到丝状真菌孢子悬液；将重组农杆菌菌液和丝状真菌孢子悬液混合后，涂布于含有抗生素的固体培养基上进行培养，筛选阳性转化子B；挑取阳性转化子B接种至固体培养基上培养至菌丝生成；取菌丝，用GUS染色液进行染色，被染成蓝色的菌丝所对应的阳性转化子B即为重组丝状真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述抗生素与上述重组质粒中含有的抗性基因对应。

在本发明的一种实施方式中，所述农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。

在本发明的一种实施方式中，所述丝状真菌为黑曲霉(Aspergillus niger)。

本发明还提供了应用上述转化黑曲霉的方法制备得到的重组丝状真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组丝状真菌为重组黑曲霉。

本发明还提供了上述重组质粒或上述转化黑曲霉的方法在转化丝状真菌中的应用。

本发明还提供了一种检测丝状真菌转化体系遗传稳定性的方法，所述方法为将上述重组丝状真菌接种至固体培养基上进行传代培养后，取固体培养基上长出的重组丝状真菌的菌丝用GUS染色液进行染色，被染成蓝色的菌丝所对应的重组丝状真菌即为遗传稳定的重组丝状真菌。

本发明还提供了上述检测丝状真菌转化体系遗传稳定性的方法在检测丝状真菌转化体系遗传稳定性方面的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种可用于转化黑曲霉等丝状真菌且可用于检测黑曲霉转化体系等丝状真菌转化体系遗传稳定性的重组质粒，此重组质粒同时携带GUS报告基因和目的基因，使用此重组质粒将目的基因转化至丝状真菌的基因组时，可通过简单的将重组丝状真菌长出的菌丝进行GUS染色来判断目的基因是否转化成功，筛选效率高；使用此重组质粒检测丝状真菌转化体系遗传稳定性时，也可通过简单的将传代后的重组丝状真菌长出的菌丝进行GUS染色来判断重组丝状真菌中目的基因的遗传是否稳定，检测效率高。

(2)本发明提供了一种转化黑曲霉等丝状真菌的方法，此方法将农杆菌转化法以及GUS染色法相结合，先使用同时携带GUS报告基因和目的基因的重组质粒转化农杆菌，获得重组农杆菌，再使用同时携带GUS报告基因和目的基因的重组农杆菌转化丝状真菌，获得重组丝状真菌，使用此方法将目的基因转化至丝状真菌的基因组时，转化效率高，并且，使用此方法将目的基因转化至丝状真菌的基因组时，可通过简单的将重组丝状真菌长出的菌丝进行GUS染色来判断目的基因是否转化成功，筛选效率高。

(3)本发明提供了一种检测黑曲霉等丝状真菌转化体系遗传稳定性的方法，此方法将农杆菌转化法以及GUS染色法相结合，先使用同时携带GUS报告基因和目的基因的重组质粒转化农杆菌，获得重组农杆菌，然后使用同时携带GUS报告基因和目的基因的重组农杆菌转化丝状真菌，获得重组丝状真菌，最后将同时携带GUS报告基因和目的基因的重组丝状真菌接种至固体培养基上进行传代培养，使用此方法粒检测丝状真菌转化体系遗传稳定性时，可通过简单的将传代后的重组丝状真菌长出的菌丝进行GUS染色来判断重组丝状真菌中目的基因的遗传是否稳定，检测效率极高。

附图说明

图1：重组大肠杆菌Escherichia coli JM109/pCAMD-GUS的PCR验证结果。

图2：重组质粒pCAMD-GUS的质粒图谱。

图3：重组农杆菌Agrobacterium tumefaciens/pCAMD-GUS的PCR验证结果。

图4：重组黑曲霉Aspergillus niger/pCAMD-GUS的菌丝的PCR验证结果。

图5：重组黑曲霉Aspergillus niger/pCAMD-GUS的菌丝球的GUS染色液侵染结果；其中，重组菌1为2次传代重组菌，重组菌2为10次传代重组菌。

图6：重组质粒pCAMD-GUS-aGlu的质粒图谱。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105购自盖德化工网；下述实施例中涉及的黑曲霉(Aspergillus niger)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.3.11446；下述实施例中涉及的马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)购自海维塔化学试剂有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、卡那霉素100mg·L^-1。

LB固体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、琼脂粉15g/L、卡那霉素50mg·L^-1。

YEB固体培养基：酵母粉1g·L^-1、蛋白胨5g·L^-1、牛肉膏5g·L^-1、MgSO₄·7H₂O0.493g·L^-1、蔗糖5g·L^-1、琼脂粉15g·L^-1，121℃，15min灭菌。

PDA液体培养基：马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)24g·L^-1，121℃，15min灭菌。

PDA固体培养基：马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)24g·L^-1、琼脂粉20g·L^-1，121℃，15min灭菌。

IM固体培养基：0.8mL/L K buffer、20mL/L MN buffer、1mL/L浓度为1g/L的CaCl₂溶液、10mL/L浓度为0.01g/L的FeSO₄溶液、5mL/L trace elements、2.5mL/L浓度为20g/L的NH₄NO₃溶液、10mL/L浓度为50％(v/v)的甘油、40mL/L浓度为1M的MES(pH5.5)、10mL/L浓度为20g/L的葡萄糖溶液，121℃，15min灭菌；

其中，K buffer：浓度为1.25M的KH₂PO₄溶液和浓度为1.25M的K₂HPO₄混合调pH到5.5；

MN buffer：30g·L^-1MgSO₄·7H2O、15g·L^-1NaCl，121℃，15min灭菌；

Trace elements：ZnSO₄·7H₂O2.1g·L^-1、H₃BO₃1.1g·L^-1、MnCl₂·4H₂O 0.5g·L^-1、FeSO₄·7H₂O 0.5g·L^-1、CoCl₂·6H₂O 0.17g·L^-1、CuSO₄·5H₂O 0.16g·L^-1、Na₂MoO₄·2H₂O0.15g·L^-1、EDTA 5.1g·L^-1，121℃，15min灭菌。

实施例1：重组质粒pCAMD-GUS的构建

合成GUS报告基因(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)；以A1、A2为引物，通过PCR在GUS报告基因的上游引入酶切位点BamHI(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，获得片段A；以B1、B2为引物，通过PCR在片段A的下游引入酶切位点Hind III(核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)，获得片段B；合成编码黑曲霉糖化酶启动子PglaA的基因(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)和编码黑曲霉糖化酶终止子TglaA的基因(核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)；分别以C1、C2、D1、D2、E1、E2、F1、F2为引物，通过重叠PCR在片段B的上下游分别连接编码黑曲霉糖化酶启动子PglaA的基因和编码黑曲霉糖化酶终止子TglaA的基因，获得片段C；合成CaMV35S启动子(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)和潮霉素抗性基因(核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示)；以G1、G2、H1、H2为引物，通过重叠PCR将CaMV 35S启动子和潮霉素抗性基因连接，获得片段D；合成卡那霉素抗性基因(核苷酸序列如SEQ ID No.7所示)和Ori复制原点(核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)；以I1、I2、J1、J2为引物，通过重叠PCR将卡那霉素抗性基因和Ori复制原点连接，获得片段E；以G1、K1、K2、J2为引物，通过重叠PCR将片段D、E连接，获得筛选标记基因；以M1、M2、N1、N2为引物，通过重叠PCR将片段C与筛选标记基因连接成环，使得片段C的编码顺序与筛选标记基因的编码顺序相反，获得连接产物；

其中，PCR所用引物如下：

A1:5’-TCTGGGATCCTCGAGGATTGCCTGAACAT-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.11所示)；

A2:5’-TTCATCCCCAGCATCATTACA-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.12所示)；

B1:5’-TCTGGGATCCTCGAGGATTGCCTGAACAT-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.13所示)；

B2:5’-TCTGAAGCTTGAGGTGTAATGATGCTGG-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.14所示)；

C1:5’-TCGAGGATTGCCTGAACATTGA-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)；

C2:5’-AATCTCAATGTTCAGGCAATCCTCGA-GAGGTGTAATGATGCTG-3’(核苷酸序列如SEQID No.16所示)；

D1:5’-CATCCCCAGCATCATTACACCTC-TCGAGGATTGCCTGAACATTGACA-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.17所示)；

D2:5’-GAGGTGTAATGATGCTGGGGATGAA-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.18所示)；

E1:5’-TCGAGGATTGCCTGAACATTGACATTCGG-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)；

E2:5’-TACCGCCAGGTGTCGGTCACCGTCGCG-GAGGTGTAATGATGCTGGG-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.20所示)；

F1:5’-CCCAGCATCATTACACCTC-CGCGACGGTGACCGACACCTGGCGGTA-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.21所示)；

F2:5’-AAATCAGTGCCATTGAAGCCG-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.22所示)；

G1:5’-TCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATG-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.23所示)；

G2:5’-GTCGTCCGAGGGCAAAGAAATAG-TGAGACTTTTCAAAGGGTA-3’(核苷酸序列如SEQID No.24所示)；

H1:5’-TACCCTTTGTTGAAAAGTCTCA-CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAG-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.25所示)；

H2:5’-ATGAAAAAGCCTGAACTCAC-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.26所示)；

I1:5’-CTAAAACAATTCATCCAGTAAAAT-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.27所示)；

I2:5’-TCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA-ATGGCTAAAATGAGAATATGAC-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.28所示)；

J1:5’-GTGATATTCTCATTTTAGCCAT-TTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGA-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.29所示)；

J2:5’-TTGAGATCCTTTTTTTCTG-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.30所示)；

K1:5’-ACTGGATGAATTGTTTTAG-ATGAAAAACGGTGAACTCACCGC-3’(核苷酸序列如SEQID No.31所示)；

K2:5’-CGGTGAGTTCAGGCTTTTTCAT-CTAAAACAATTCATCCAGT-3’(核苷酸序列如SEQID No.32所示)；

M1:5’-TCGAGGATTGCCTGAACATTGACATTCGGCG-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.33所示)；

M2:5’-CATTTGGACGAGGACACGCTGA-AAATCAGAGCATTGAAGCC-3’(核苷酸序列如SEQID No.34所示)；

N1:5’-GGCTTCAATGGCTCTGATTT-TCAGCGTGTCCTCGTCCAAATG-3’(核苷酸序列如SEQID No.35所示)；

N2:5’-TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGT-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.36所示)。

将连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取5个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将提取得到的质粒进行PCR验证(验证结果可见图1)，验证正确即获得重组质粒pCAMD-GUS(质粒图谱具体可见图2)以及重组大肠杆菌Escherichia coli JM109/pCAMD-GUS；

其中，PCR所用引物如下：

T1:5’-TCGAGGATTGCCTGAACATTGACA-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.37所示)；

T1:5’-AAATCAGAGCCATTGAAGCCGTTC-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.38所示)；

PCR程序如下：预变性94℃10min；30个循环中98℃变性10s，退火55℃30s，72℃延伸4min30s；终延伸72℃10min。

实施例2：重组农杆菌的构建

将冻存好的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105感受态细胞取出，冰浴5min后加入实施例1获得的重组质粒pCAMD-GUS 1μL，再次冰浴5min，放入液氮冻存8min，获得冻存液；将冻存液37℃热激90s后，在冻存液中加入800μL YEB液体培养基，于28℃、180rpm培养4～5h，获得培养液；将培养液于12000rpm、4℃的条件下离心1min，取上清；在上清中加入100μLYEB液体培养基重悬菌体，获得重悬液；将重悬液涂布在YEB固体培养基(含有50μg/mL利福平以及100μg/mL卡那霉素)上，于28℃培养48～72h，获得单菌落；挑选长势良好的单菌落以GUS报告基因为验证基因进行PCR验证(验证结果可见图3)，验证正确即获得重组农杆菌Agrobacterium tumefaciens/pCAMD-GUS；将验证正确的重组农杆菌Agrobacterium tumefaciens/pCAMD-GUS的单菌落挑取至YEB液体培养基(含有50μg/mL利福平以及100μg/mL卡那霉素)中，于28℃培养16h，得到重组农杆菌Agrobacteriumtumefaciens/pCAMD-GUS的菌液；

其中，PCR所用引物如下：

F2:5’-AACCGACGACTCGTCCGT-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.39所示)；

R2:5’-TTGTTTGCCTCCCTGCTGCG-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.40所示)；

PCR程序如下：预变性94℃10min；30个循环中98℃变性10s，退火55℃30s，72℃延伸2min；终延伸72℃10min。

实施例3：重组黑曲霉的构建

挑取10mg黑曲霉菌丝接种于PDA固体培养基上，于37℃避光培养1～3d，直到黑色孢子生成；利用无菌PBS缓冲液洗脱孢子，用PBS缓冲液将孢子稀释至浓度为1×10⁷个/mL，获得黑曲霉孢子悬液(血球计数板记数)；

取实施例2获得的重组农杆菌Agrobacterium tumefaciens/pCAMD-GUS菌液在甘油管划线，28℃避光培养2d，获得重组农杆菌Agrobacterium tumefaciens/pCAMD-GUS的单菌落；挑取重组农杆菌Agrobacterium tumefaciens/pCAMD-GUS的单菌落接种至YEB液体培养基(含有100mg/L卡那霉素)中，于28℃、180rpm培养1d，获得培养液；将培养液于5000rpm的条件下离心5min，收集菌体；用含有200mM AS的YEB液体培养基(含有100mg/L卡那霉素)将菌体重悬至OD₆₀₀＝0.15，获得重悬液；将重悬液于28℃、180rpm培养至OD₆₀₀＝0.8，得到农杆菌侵染液；

取100μL黑曲霉孢子悬液和100μL农杆菌侵染液混合均匀，涂布于铺有玻璃纸的IM固体培养基(含有100mg/L卡那霉素)上，于24℃避光培养2d后，揭去玻璃纸，将IM固体培养基倒扣至PDA固体培养基(含有160mM头孢噻肟钠以及160μg/mL潮霉素)上，于24℃避光培养，直至有单菌落长出；挑取单菌落接种至新的PDA固体培养基(含有160mM头孢噻肟钠以及160μg/mL潮霉素)上，于35℃培养3d，获得菌丝；挑取菌丝球用液氮研磨提取基因组DNA后以GUS报告基因为验证基因进行PCR验证(验证结果可见图4)，验证正确即获得重组黑曲霉Aspergillus niger/pCAMD-GUS；

挑取单菌落B上的菌丝加入瓶中；在瓶中继续加入足量GUS染色液，使GUS染色液完全浸没菌丝；用真空泵抽取瓶中的空气，抽取时间要大于2min，随即盖紧瓶子，将菌丝在GUS染色液中于37℃孵育24h后，肉眼观察菌丝的颜色变化；孵育24h后，菌丝变成蓝色，进一步证明了重组黑曲霉Aspergillus niger/pCAMD-GUS构建成功；

其中，PCR所用引物如下：

F2:5’-AACCGACGACTCGTCCGT-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.41所示)；

R2:5’-TTGTTTGCCTCCCTGCTGCG-3’(核苷酸序列如SEQ ID No.42所示)；

PCR程序如下：预变性94℃10min；30个循环中98℃变性10s，退火55℃30s，72℃延伸2min；终延伸72℃10min。。

实施例4：检测重组黑曲霉遗传稳定性的方法的构建

检测实施例3获得的重组黑曲霉Aspergillus niger/pCAMD-GUS的遗传稳定性，具体检测方法如下：

对照组(分子水平检测)：挑取10mg实施例3获得的重组黑曲霉Aspergillusniger/pCAMD-GUS的菌丝球接种至PDA培养基中，于30℃的条件下进行传代培养，传代5～10次后，观察重组黑曲霉Aspergillus niger/pCAMD-GUS的菌丝是否正常生长，并挑取菌丝以GUS报告基因为验证基因进行PCR验证，以传代不同次数后仍能够检测到GUS报告基因的重组黑曲霉数量与进行传代培养的重组黑曲霉的总数量的比值衡量重组黑曲霉的遗传稳定性(检测结果见表1)。

实验组(GUS染色检测)：挑取10mg实施例3获得的重组黑曲霉Aspergillus niger/pCAMD-GUS的菌丝球接种至PDA培养基中，于30℃的条件下进行传代培养，传代5～10次后，观察重组黑曲霉Aspergillus niger/pCAMD-GUS的菌丝是否正常生长，并挑取菌丝加入瓶中；在瓶中继续加入足量GUS染色液，使GUS染色液完全浸没菌丝；用真空泵抽取瓶中的空气，抽取时间要大于2min，随即盖紧瓶子，将菌丝在GUS染色液中于37℃孵育24h后，肉眼观察菌丝的颜色变化，以传代不同次数后仍能够观察到明显蓝色的重组黑曲霉数量与进行传代培养的重组黑曲霉的总数量的比值衡量重组黑曲霉的遗传稳定性(检测结果见表1和图5)。

由表1和图5可知，实验组的检测结果与对照组的检测方法测得的结果相似，可见，实验组的检测方法可以取代对照组的检测方法用于重组黑曲霉遗传稳定性的检测。

表1重组黑曲霉的遗传稳定性

实施例5：检测重组黑曲霉遗传稳定性的方法的应用

以编码α-葡萄糖苷酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)作为目的基因；使用限制性内切酶Hind III将实施例1获得的重组质粒pCAMD-GUS进行酶切，获得酶切产物；利用T4连接酶将酶切产物与目的基因连接成环，使得目的基因位于实施例1获得的重组质粒pCAMD-GUS的终止子基因的上游以及GUS基因的下游，获得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取5个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将提取得到的质粒进行PCR验证(验证结果可见图1)，验证正确即获得重组质粒pCAMD-GUS-aGlu(质粒图谱具体可见图6)以及重组大肠杆菌Escherichia coli JM109/pCAMD-GUS-aGlu；参照实施例2-3的方法通过农杆菌将重组质粒pCAMD-GUS-aGlu转化至黑曲霉孢子中，获得重组黑曲霉Aspergillusniger/pCAMD-GUS-aGlu；通过实施例4中对照组和实验组的方法检测重组黑曲霉Aspergillus niger/pCAMD-GUS-aGlu的遗传稳定性，检测结果见表2。

由表2可知，GUS检测结果与分子检测方法测得的结果相似，经由GUS检测获得的传代10次后仍遗传稳定的重组黑曲霉Aspergillus niger/pCAMD-GUS-aGlu均可通过分子检测的方法扩增出目的基因。可见，GUS检测方法可以取代对分子检测方法用于重组黑曲霉遗传稳定性的检测。

表2重组黑曲霉的遗传稳定性

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种检测丝状真菌转化体系遗传稳定性的方法

<160> 42

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggatcc 6

<210> 2

<211> 1984

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgaggattg cctgaacatt gacattcggc gtccggccgg gaccaccgcg gactcgaagc 60

tgcctgtgct ggtctggatc tttggcggag gctttgaact tggttcaaag gcgatgtatg 120

atggtacaac gatggtatca tcgtcgatag acaagaacat gcctatcgtg tttgtagcaa 180

tgaattatcg cgtgggaggt ttcgggttct tgcccggaaa ggagatcctg gaggacgggt 240

ccgcgaacct agggctcctg gaccaacgcc ttgccctgca gtgggttgcc gacaacatcg 300

aggcctttgg tggagacccg gacaaggtga cgatttgggg agaatcagca ggagccattt 360

ccgtttttga tcagatgatc ttgtacgacg gaaacatcac ttacaaggat aagcccttgt 420

tccggggggc catcatggac tccggtagtg ttgttcccgc agaccccgtc gatggggtca 480

agggacagca agtatatgat gcggtagtgg aatctgcagg ctgttcctct tctaacgaca 540

ccctagcttg tctgcgtgaa ctagactaca ccgacttcct caatgcggca aactccgtgc 600

caggcatttt aagctaccat tctgtggcgt tatcatatgt gcctcgaccg gacgggacgg 660

cgttgtcggc atcaccggac gttttgggca aagcagggaa atatgctcgg gtcccgttca 720

tcgtgggcga ccaagaggat gaggggacct tattcgcctt gtttcagtcc aacattacga 780

cgatcgacga ggtggtcgac tacctggcct catacttctt ctatgacgct agccgagagc 840

agcttgaaga actagtggcc ctgtacccag acaccaccac gtacgggtct ccgttcagga 900

caggcgcggc caacaactgg tatccgcaat ttaagcgatt ggccgccatt ctcggcgact 960

tggtcttcac cattacccgg cgggcattcc tctcgtatgc agaggaaatc tcccctgatc 1020

ttccgaactg gtcgtacctg gcgacctatg actatggcac cccagttctg gggaccttcc 1080

acggaagtga cctgctgcag gtgttctatg ggatcaagcc aaactatgca gctagttcta 1140

gccacacgta ctatctgagc tttgtgtata cgctggatcc gaactccaac cggggggagt 1200

acattgagtg gccgcagtgg aaggaatcgc ggcagttgat gaatttcgga gcgaacgacg 1260

ccagtctcct tacggatgat ttccgcaacg ggacatatga gttcatcctg cagaataccg 1320

cggcgttcca catctgatgc cattggcgga ggggtccgga cggtcaggaa cttagcctta 1380

tgagatgaat gatggacgtg tctggcctcg gaaaaggata tatggggatc atgatagtac 1440

tagccatatt aatgaagggc atataccacg cgttggacct gcgttatagc ttcccgttag 1500

ttatagtacc atcgttatac cagccaatca agtcaccacg cacgaccggg gacggcgaat 1560

ccccgggaat tgaaagaaat tgcatcccag gccagtgagg ccagcgattg gccacctctc 1620

caaggcacag ggccattctg cagcgctggt ggattcatcg caatttcccc cggcccggcc 1680

cgacaccgct ataggctggt tctcccacac catcggagat tcgtcgccta atgtctcgtc 1740

cgttcacaag ctgaagagct tgaagtggcg agatgtctct gcaggaattc aagctagatg 1800

ctaagcgata ttgcatggca atatgtgttg atgcatgtgc ttcttccttc agcttcccct 1860

cgtgcagatg aggtttggct ataaattgaa gtggttggtc ggggttccgt gaggggctga 1920

agtgcttcct cccttttaga cgcaactgag agcctgagct tcatccccag catcattaca 1980

cctc 1984

<210> 3

<211> 1984

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgaggattg cctgaacatt gacattcggc gtccggccgg gaccaccgcg gactcgaagc 60

tgcctgtgct ggtctggatc tttggcggag gctttgaact tggttcaaag gcgatgtatg 120

atggtacaac gatggtatca tcgtcgatag acaagaacat gcctatcgtg tttgtagcaa 180

tgaattatcg cgtgggaggt ttcgggttct tgcccggaaa ggagatcctg gaggacgggt 240

ccgcgaacct agggctcctg gaccaacgcc ttgccctgca gtgggttgcc gacaacatcg 300

aggcctttgg tggagacccg gacaaggtga cgatttgggg agaatcagca ggagccattt 360

ccgtttttga tcagatgatc ttgtacgacg gaaacatcac ttacaaggat aagcccttgt 420

tccggggggc catcatggac tccggtagtg ttgttcccgc agaccccgtc gatggggtca 480

agggacagca agtatatgat gcggtagtgg aatctgcagg ctgttcctct tctaacgaca 540

ccctagcttg tctgcgtgaa ctagactaca ccgacttcct caatgcggca aactccgtgc 600

caggcatttt aagctaccat tctgtggcgt tatcatatgt gcctcgaccg gacgggacgg 660

cgttgtcggc atcaccggac gttttgggca aagcagggaa atatgctcgg gtcccgttca 720

tcgtgggcga ccaagaggat gaggggacct tattcgcctt gtttcagtcc aacattacga 780

cgatcgacga ggtggtcgac tacctggcct catacttctt ctatgacgct agccgagagc 840

agcttgaaga actagtggcc ctgtacccag acaccaccac gtacgggtct ccgttcagga 900

caggcgcggc caacaactgg tatccgcaat ttaagcgatt ggccgccatt ctcggcgact 960

tggtcttcac cattacccgg cgggcattcc tctcgtatgc agaggaaatc tcccctgatc 1020

ttccgaactg gtcgtacctg gcgacctatg actatggcac cccagttctg gggaccttcc 1080

acggaagtga cctgctgcag gtgttctatg ggatcaagcc aaactatgca gctagttcta 1140

gccacacgta ctatctgagc tttgtgtata cgctggatcc gaactccaac cggggggagt 1200

acattgagtg gccgcagtgg aaggaatcgc ggcagttgat gaatttcgga gcgaacgacg 1260

ccagtctcct tacggatgat ttccgcaacg ggacatatga gttcatcctg cagaataccg 1320

cggcgttcca catctgatgc cattggcgga ggggtccgga cggtcaggaa cttagcctta 1380

tgagatgaat gatggacgtg tctggcctcg gaaaaggata tatggggatc atgatagtac 1440

tagccatatt aatgaagggc atataccacg cgttggacct gcgttatagc ttcccgttag 1500

ttatagtacc atcgttatac cagccaatca agtcaccacg cacgaccggg gacggcgaat 1560

ccccgggaat tgaaagaaat tgcatcccag gccagtgagg ccagcgattg gccacctctc 1620

caaggcacag ggccattctg cagcgctggt ggattcatcg caatttcccc cggcccggcc 1680

cgacaccgct ataggctggt tctcccacac catcggagat tcgtcgccta atgtctcgtc 1740

cgttcacaag ctgaagagct tgaagtggcg agatgtctct gcaggaattc aagctagatg 1800

ctaagcgata ttgcatggca atatgtgttg atgcatgtgc ttcttccttc agcttcccct 1860

cgtgcagatg aggtttggct ataaattgaa gtggttggtc ggggttccgt gaggggctga 1920

agtgcttcct cccttttaga cgcaactgag agcctgagct tcatccccag catcattaca 1980

cctc 1984

<210> 4

<211> 1456

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcgacggtg accgacacct ggcggtagac tatttattcc tgttgatatg aaggatgagc 60

atgagggtaa ttgctcatat aatcatgtat gtagtggatg tgcataagag caacgaaatg 120

gaagcctgat catgtgattg tattgcgacc gacggaattg aggatatgcg gagatacgga 180

cagtgccaga gccattgtct tcacgtaaag taccagacgg tccctgattt cttcttgcac 240

atagcattag gcaattgaca tgttgtcgct ctactgatat cactgtccct caaagcatag 300

ccatgagctc atcttagatc caagcacgta attccatagc cgaggtccac agtggagcaa 360

cagcagcatc catcattgct tctcccccag gggcctctta gcgactaaac ctggagtatg 420

tctcaaccag ccaatgaatc gtcttcgctt caatgtcctt gacacttctg agagggtccc 480

catccctcaa tgctaattca aaatatagcc gagatgcatg gtggagtcca aagtagacag 540

tattgccgga atgacggggc cagttgcgcc gaggtcattg gccggctgtg atgccatctg 600

ccactaaatc cgatcattga tccaccgccc acgagggccg tctttgcttt tgcgctgcgt 660

ccaggttcac acatctctct ctctgcagct ccagactgac cagactattc tacttactgg 720

tctgatcggc tccatcagag ctatggcgtt atcccgtgcc gttgctgcgc catcgctatc 780

ttgatcgcga gctcgaactc acttcttgtt ttaatagttg ttctcggtga ctgagtgtcg 840

gtgagtgaca gaccacaaca ccattgttgc agggggtaaa tttattcaat tcaggaattg 900

gattgttcgt cccgccatga tgttcttgcc ggctttgttg gccctgtttg tcggatgcga 960

cgccctcgct gtgcagcagg caggtactgc tggatgatga gccgtcggtc tccgcgcgca 1020

agcctaactt cctcttcatt cttacggatg atcaggatct gcagatcgaa ttccaccggc 1080

gtatatgccg tatacacagg cgagaatcaa ggagaagggt actgagtttt gaatcatttg 1140

ttactactgg ctctgtgctg tccgtcgcgc gtgagtcttt ggacggaaga caggctcata 1200

atactaatgt gacggatgtg aacccgcctt atggtatgaa tacctctcag atcggtcatg 1260

tttcttcggt gtaaaattgc taatgcagca taggcggata ccccaagttc gtcgcccaag 1320

gcttcaacga aaacttcctc cccgtttggc tgcagtccgc cggttacaat accttctaca 1380

cggggaaact gttcaactgc cacagcgtcg ctacctataa tgcaccgttt gtgaacggct 1440

tcaatggctc tgattt 1456

<210> 5

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata gaggaaggtc ttgcgaagga 60

tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt 120

gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct 180

ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg 240

catttgtagg tgccaccttc cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg 300

caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt 360

tggtcttctg agactgtatc tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc 420

atgttatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg 480

atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg 540

atagcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc 600

cttttgatga agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc 660

ctttgttgaa aagtctca 678

<210> 6

<211> 1026

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctatttcttt gccctcggac gagtgctggg gcgtcggttt ccactatcgg cgagtacttc 60

tacacagcca tcggtccaga cggccgcgct tctgcgggcg atttgtgtac gcccgacagt 120

cccggctccg gatcggacga ttgcgtcgca tcgaccctgc gcccaagctg catcatcgaa 180

attgccgtca accaagctct gatagagttg gtcaagacca atgcggagca tatacgcccg 240

gagtcgtggc gatcctgcaa gctccggatg cctccgctcg aagtagcgcg tctgctgctc 300

catacaagcc aaccacggcc tccagaagaa gatgttggcg acctcgtatt gggaatcccc 360

gaacatcgcc tcgctccagt caatgaccgc tgttatgcgg ccattgtccg tcaggacatt 420

gttggagccg aaatccgcgt gcacgaggtg ccggacttcg gggcagtcct cggcccaaag 480

catcagctca tcgagagcct gcgcgacgga cgcactgacg gtgtcgtcca tcacagtttg 540

ccagtgatac acatggggat cagcaatcgc gcatatgaaa tcacgccatg tagtgtattg 600

accgattcct tgcggtccga atgggccgaa cccgctcgtc tggctaagat cggccgcagc 660

gatcgcatcc atagcctccg cgaccggttg tagaacagcg ggcagttcgg tttcaggcag 720

gtcttgcaac gtgacaccct gtgcacggcg ggagatgcaa taggtcaggc tctcgctaaa 780

ctccccaatg tcaagcactt ccggaatcgg gagcgcggcc gatgcaaagt gccgataaac 840

ataacgatct ttgtagaaac catcggcgca gctatttacc cgcaggacat atccacgccc 900

tcctacatcg aagctgaaag cacgagattc ttcgccctcc gagagctgca tcaggtcgga 960

gacgctgtcg aacttttcga tcagaaactt ctcgacagac gtcgcggtga gttcaggctt 1020

tttcat 1026

<210> 7

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctaaaacaat tcatccagta aaatataata ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc 60

cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg 120

gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa 180

gccacttact ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa 240

gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt 300

aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa 360

gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc 420

gatggagtga aagagcctga tgcactccgc atacagctcg ataatctttt cagggctttg 480

ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga gcagattgct 540

ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca 600

tagcatcatg tccttttccc gttccacatc ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt 660

catttttaaa tataggtttt cattttctcc caccagctta tataccttag caggagacat 720

tccttccgta tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat 780

tctcatttta gccat 795

<210> 8

<211> 589

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 60

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 120

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 180

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 240

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 300

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 360

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 420

taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 480

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 540

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaa 589

<210> 9

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aagctt 6

<210> 10

<211> 2871

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atggtgaagc tgacccatct gctcgctcgg gcttggctgg tccctctggc ttacggtgct 60

agctcccaag ctggcgtcga tcctctggac cggcccggca atgatctgta cgtcaaggac 120

ctcagcaact gtaccggcta caaggtgacc aagcactgga aaacccgcag cggtttttac 180

gctgatctgg ctctggccgg tcccgcttgc aacgtctacg gcattgatct gcccaagctg 240

aaactggaag tcgagtacca gaccgatgag cggctgcacg tcaaaatcct cgacactaac 300

aacaccgtct atcaagtccc cgattccgtg tttcctcgcc ccggcttcgg ccagtggtgc 360

agccccaaaa attccaaact gaagttcgac ttcaagcccg accccttcag cttcactgtg 420

tcccggactg acaccggtga ggtgctcttt gataccactg gcaccaagct cgtcttcgag 480

aaccagtatc tgtacctcaa aacccacctc ccccagaacc ctcatctcta tggtctgggc 540

gagcactccg actcctttat gctgaacacc accaactaca ctcgcaccat ctacacccgc 600

gatgcttatg gcacccctca aggccagaat ctctatggcg cccatcccat ctacttcgat 660

caccgccaag atggcactca cggcgtcttc ctcctcaact ccaacggcat ggacatctac 720

atcgataacg agggcggtca gtttctcgag tacaacatca tcggcggtgt ctttgacttc 780

tacttcatcg ctggcccctc ccctcaagat gtggcccggc aatatgccga gattgtgcaa 840

ccccctctga tggtccccta ttggggcctc ggtttccacc aatgccgcta cggctaccaa 900

gatgtctacg aagtggccgc tgtcactgcc aattacagcg tccacgacat tcctctggaa 960

accatctgga ccgacatcga ctacatggat cgccgccgca ttttcaccct cgatcccgag 1020

cgctttcctc ccgagctggt gaaagatctg gtggataccc tccacgctcg ggaccaacat 1080

tacatcgtca tggtcgatcc cgccgtctac tacagcgaac ccaaccccgc cctcgatgcc 1140

ggcctcaagt acgacgcctt catgaaggag ctcaacggta cccactacca aggcgtcgtg 1200

tgggctggcc cttcctactt ccccgattgg tttcacccca atgctcaaga gtactggacc 1260

gagcagtttc tgaatttctt cgatggcgtg aacggccccg atatcgacgc tctgtggatc 1320

gacatgaacg agcccgccaa tttctacaat cggccttacc ccggcaacaa caccaccccc 1380

gaggaattcg ctgaggccaa cgacaaccct cccgaacctc ccgccgtccg cgatggtccc 1440

gatgctccta tccccggctt ccccgattcc ctccagccca actttgccag cggtcagacc 1500

aacgagaaac gcgctgtcgt gactgtcgaa cgccgggctc gctcccaatc ccatcgccaa 1560

ctgggtgctg gtcggtggcg gagcgctgtc cggcattggc cccgcgatcc caaagccggc 1620

tggcaacatg gccggaagag cggtagcggt tgtggccctc atgaatgccg cggcctccct 1680

aatcgggagc tgatccgccc cccttacatg atccaaaacg gcgctggtcc caccctcgct 1740

gacaacactg ctgacaccga catcgtccaa agcggcggct acgtccagta cgatactcac 1800

tctctgtacg gtgccatgat gagcacccac tcccataatg ctatgcgcgc ccggcgcccc 1860

gatgatcgcg ctctcgtcat tacccgctcc acttttgccg gttccggtaa ggacgtgagc 1920

cattggctgg gtgataacat cagcgattgg ctgagctacc ggctcagcat ttcccagatt 1980

ctgcagttcg ctagcctcta tcagatcccc gtggtcggcc ccgatgtctg tggctttggt 2040

ggcaacgtca ctgaaactct ctgtgcccgg tgggctactc tgggtagctt ctacactttc 2100

ttccgcaacc acgctgagat cttcgccaac ccccaagagt tctatcgctg gcctattgtg 2160

gccgaggccg ctcgcaacgg catcgctatc cgctaccaac tgctcgacta catctacact 2220

gccatctaca agcagactca gaccggtact ccttccctca atcctctgtt ctttaactac 2280

cctttcgatc agaacaccta tggcatcgat ctgcagttct tttacggtcc cggcattctg 2340

gtcagccccg tcaccgaaga aaacagcact agcgtgagct attacctccc cgatgacatt 2400

ttctatgagt ggggcaccgg caaacccgtg cgcggtcatg gtgaatatgt gtccgctgag 2460

gtcgacgtga cccacattac cgtccattac aagggtggtc tcgtctaccc tcagcgcatc 2520

gaatccgcca acaccaccac tgctctgcgc cagaagggct tcaacattgt cattgccccc 2580

ggtctggacg gtagcgctca tggtgaactc tatctggacg acggcctctc ccaagtccaa 2640

gataaggtca gcgagatcga tttctcctac gtggacggcg tcttcgagat gaagggttcc 2700

ttcgagtacg accccggcgt cggcattgag cgcattacta ttctgggcgt cggcgctaaa 2760

cccgaagtcg ctgctgagga cgccgaggtc gaatacgatg aggagaacca gaagctcgtg 2820

ctccacgtcg acgtgcctct cactcgcaag tccagcatca aaatcgcctg a 2871

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tctgggatcc tcgaggattg cctgaacat 29

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttcatcccca gcatcattac a 21

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tctgggatcc tcgaggattg cctgaacat 29

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tctgaagctt gaggtgtaat gatgctgg 28

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcgaggattg cctgaacatt ga 22

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aatctcaatg ttcaggcaat cctcgagagg tgtaatgatg ctg 43

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catccccagc atcattacac ctctcgagga ttgcctgaac attgaca 47

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gaggtgtaat gatgctgggg atgaa 25

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tcgaggattg cctgaacatt gacattcgg 29

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

taccgccagg tgtcggtcac cgtcgcggag gtgtaatgat gctggg 46

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cccagcatca ttacacctcc gcgacggtga ccgacacctg gcggta 46

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aaatcagtgc cattgaagcc g 21

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatg 26

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gtcgtccgag ggcaaagaaa tagtgagact tttcaaaggg ta 42

<210> 25

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

taccctttgt tgaaaagtct cactatttct ttgccctcgg acgag 45

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

atgaaaaagc ctgaactcac 20

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ctaaaacaat tcatccagta aaat 24

<210> 28

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tcaggggggc ggagcctatg gaaaatggct aaaatgagaa tatgac 46

<210> 29

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gtgatattct cattttagcc attttccata ggctccgccc ccctga 46

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ttgagatcct ttttttctg 19

<210> 31

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

actggatgaa ttgttttaga tgaaaaacgg tgaactcacc gc 42

<210> 32

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cggtgagttc aggctttttc atctaaaaca attcatccag t 41

<210> 33

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tcgaggattg cctgaacatt gacattcggc g 31

<210> 34

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

catttggacg aggacacgct gaaaatcaga gcattgaagc c 41

<210> 35

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ggcttcaatg gctctgattt tcagcgtgtc ctcgtccaaa tg 42

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ttgagatcct ttttttctgc gcgt 24

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tcgaggattg cctgaacatt gaca 24

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

aaatcagagc cattgaagcc gttc 24

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

aaccgacgac tcgtccgt 18

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

ttgtttgcct ccctgctgcg 20

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

aaccgacgac tcgtccgt 18

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ttgtttgcct ccctgctgcg 20

Claims

1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含编码启动子的基因、第一酶切位点、GUS报告基因、第二酶切位点、目的基因、编码终止子的基因和抗性基因。

2.如权利要求1所述的一种重组质粒，其特征在于，所述编码启动子的基因位于GUS报告基因的上游；所述编码终止子的基因位于GUS报告基因的下游。

3.如权利要求1或2所述的一种重组质粒，其特征在于，所述第一酶切位点位于编码启动子的基因的下游且位于GUS报告基因的上游；所述第二酶切位点位于GUS报告基因的下游且位于目的基因的上游。

4.如权利要求1-3任一所述的一种重组质粒，其特征在于，所述抗性基因位于编码启动子的基因的上游且所述抗性基因的编码顺序与编码启动子的基因的编码顺序相反。

5.如权利要求1-4任一所述的一种重组质粒，其特征在于，所述目的基因位于第二酶切位点的的下游且位于编码终止子的基因的上游。

6.一种转化丝状真菌的方法，其特征在于，所述方法为先用权利要求1-5任一所述的重组质粒转化农杆菌，得到重组农杆菌，然后用重组农杆菌转化丝状真菌，得到重组丝状真菌。

7.应用权利要求6所述方法制备得到的重组丝状真菌。

8.权利要求1-5任一所述的重组质粒或权利要求6所述的方法在转化丝状真菌中的应用。

9.一种检测丝状真菌转化体系遗传稳定性的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求7所述的重组丝状真菌接种至固体培养基上进行传代培养后，取固体培养基上长出的重组丝状真菌的菌丝用GUS染色液进行染色，被染成蓝色的菌丝所对应的重组丝状真菌即为遗传稳定的重组黑曲霉。

10.权利要求9所述的方法在检测丝状真菌转化体系遗传稳定性方面的应用。