CN107475256A - 一种基于内源tRNA加工系统的多靶序列sgRNA表达载体及其在植物基因编辑中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种tRNA‑sgRNA表达序列，其特征在于：tRNA、typeII内切酶位点、sgRNA依次连接构成单元序列，4个所述单元序列串联排列，串联排列的4个单元序列中所述type II内切酶位点依次分别为BbsI、BsaI、BsmBI和BfuAI。本发明提供的tRNA‑sgRNA表达序列，使多个目标靶序列的组装可以逐步组装到tRNA‑sgRNA表达载体中，实现烟草、甘蓝等诸多植物多位点的基因编辑；通过将组装有不同目标靶序列的tRNA‑sgRNA表达序列单元重复插入Cas9基因表达载体，可实现多个基因的编辑或者根据目标进行不同基因的组合编辑。

Description

一种基于内源tRNA加工系统的多靶序列sgRNA表达载体及其 在植物基因编辑中的应用

技术领域

本发明属于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体设计及应用领域，特别涉及利用酶切插入法构建多个靶位点序列sgRNA表达载体，实现植物多基因编辑的方法。

背景技术

2013年，成簇的规律间隔性短回文重复序列及相关核酸酶Cas9被报道可用于基因的编辑。该系统经过几年的发展，迅速成为最火热的基因组编辑技术。对于四倍体的油菜、六倍体的小麦等多倍体作物来说，大多数基因存在多个拷贝，基于传统的正向或反向遗传学来解析其基因功能或进行性状改良具有很大的难度。因此，开发能够同时修饰多个位点的CRISPR/Cas9基因编辑系统对于植物基因功能研究、品种改良等都具有十分重要的意义。

CRISPR/Cas9表达系统进入生物体细胞内转录后，需要独立的靶向sgRNA序列与Cas9蛋白结合完成目标位点的编辑。目前，常用的CRISPR/Cas9系统将含不同靶位点序列的sgRNA表达盒和Cas9表达盒整合到双元载体上同时表达，每一个靶位点sgRNA表达盒由不同的启动子启动表达，导致针对同一基因多位点或多基因进行编辑的载体构建变得很复杂，在很大程度上限制了CRISPR/Cas9系统同时进行多位点或者多个基因编辑的能力。真核生物中的tRNA前体(pre-tRNAs)在真核细胞中可被内源的RNase P和RNase Z 识别剪切去除5′和3′端的多余序列，且该识别剪切主要针对tRNA接纳茎，D-loop臂以及TψC-loop臂结构而非特定的tRNA前体序列。另外，tRNA所含的内部启动子元件 box Aand B可以协助招募RNA聚合酶III复合体，使tRNA自身序列可以作为转录增强子而提升RNA聚合酶Pol III型启动子的表达水平。根据tRNA的上述剪接加工特点，可以将tRNA与sgRNA序列融合，形成一个多顺反子基因，将两个或者更多的sgRNA序列串联在同一表达载体上，利用内源tRNA加工系统生成大量的携带靶向序列的sgRNA，引导Cas9核酸酶对同一基因的多个位点或多个基因多个位点进行编辑，提高突变效率。另外，鉴于tRNA及其加工系统在所有生物中是相当保守的，用该系统表达sgRNA序列进行靶向序列选择时，摆脱了针对不同的Pol III型启动子对于靶向序列第一个碱基应为G 碱基或者A碱基的限制，因此，基于该系统的使用，可大大拓宽目标位点序列的可选择范围。因此，基于tRNA-sgRNA序列很快就在水稻、玉米、小麦等单子叶植物中被应用于基因编辑。

早先报道的tRNA-sgRNA表达系统进行目标靶序列的组装是通过Golden Gate法进行，实现含目标靶序列的多个tRNA-sgRNA表达序列的串联需要设计多条引物，进行多轮PCR才能完成多个靶位点的组装。另外，将目标靶序列连同tRNA-sgRNA序列直接进行化学合成则大大增加了成本。目前，利用tRNA-sgRNA/Cas9系统进行多位点基因编辑尚未在双子叶植物中被报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种tRNA-sgRNA表达序列，使针对多个目标靶序列的组装可以通过简单的酶切插入的方式逐步组装到tRNA-sgRNA表达载体中，实现多位点的基因编辑；组装有不同目标靶序列的tRNA-sgRNA表达序列单元重复插入Cas9基因表达载体，可同步实现多个靶位点或者多基因的编辑；另外，针对不同性状的编辑需要，可灵活进行不同基因的组合编辑。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种tRNA-sgRNA表达序列，其特征在于：tRNA序列、type II内切酶位点、sgRNA 序列依次排列为独立的转录单元，将4个所述转录单元串联排列，串联排列的4个转录单元中所述type II内切酶依次分别为BbsI、BsaI、BsmBI和BfuAI。本发明将特定的type II 内切酶BbsI、BsaI、BsmBI和BfuAI的酶切位点引入到该tRNA-sgRNA系统中，并通过特定的组合方式构成了一种新的tRNA-sgRNA表达序列及载体，基于该表达序列载体，(1) 可利用酶切法插入多个靶向序列，无需采用Golden Gate法进行多靶位点序列的组装时大量的引物合成和PCR扩增组装；(2)避免了直接化学合成包含多个靶位点序列在内的 sgRNA表达序列导致成本较高的问题；(3)该新的tRNA-sgRNA表达序列及其载体中，在每一个sgRNA序列与Cas9蛋白结合的42bp柄状区域序列均延长10bp，同时将该区域序列中的一串胸腺嘧啶(T)第四个胸腺嘧啶碱基替换成胞嘧啶碱基(C)，改造后的 sgRNA序列有利于基因编辑效率的提高；(4)利用该tRNA-sgRNA序列表达载体与Cas9 基因共表达，可灵活进行单基因多位点或多目标基因定点敲除的组合，有利于农作物多基因调控性状的改良。

上述tRNA-sgRNA表达序列，其特征在于：序列如SEQ ID NO.1所述。

将上述tRNA-sgRNA表达序列的4个串联转录单元的上游连接RNA聚合酶III型启动子，如来自拟南芥的III型启动子U6-26，U6-29，U6-1或U3-b启动子(或者来自其他植物的类似RNA聚合酶III型启动子)融合，可获得相应的tRNA-sgRNA表达盒。如 U6-26：：tRNA-sgRNA表达盒序列信息如SEQ ID NO.2所述。

上述序列中的U6-26启动子可分别置换为下述拟南芥的III型启动子如U6-29，U6-1 和U3-b等不同的启动子序列，例如启动子序列依次分别为SEQ ID NO.3-5。本发明中驱动tRNA-sgRNA序列表达的启动子也包括除拟南芥外的其他植物的RNA聚合酶III型启动子。

上述tRNA-sgRNA表达序列及表达盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)人工合成可分别由如拟南芥的RNA聚合酶III型启动子U6-26，U6-29，U6-1和U3-b等不同的启动子驱动的tRNA-sgRNA表达盒(合成的详细序列信息见前面所述)并克隆于常见的pUC质粒、pBluescriptII SK质粒中。其中tRNA-sgRNA结构重复序列中分别在合成时引入BbsI，BsaI，BsmBI和BfuAI内切酶识别位点，用于不同靶序列的插入，同时在tRNA-sgRNA表达盒的5’端和3’端在合成时直接添加或另行通过PCR扩增的方式引入不同的酶切位点，满足插入Cas9表达载体不同位置，实现tRNA-sgRNA序列和Cas9 基因共表达以及进行多个tRNA-sgRNA表达盒插入Cas9表达载体，实现多基因组合编辑的目的。

(2)目标基因靶向序列组装入tRNA-sgRNA表达盒

靶位点引物设计

根据目标基因待编辑的靶位点序列，按如下序列信息设计两条互补引物对：

引物1：5’-TGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

引物2：5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(N＝A，T，C或G)

靶序列的组装

按如下所述程序分别将不同的靶序列逐次装载入tRNA-sgRNA表达盒相应位点。如先组装靶向序列A到Bbs I位点，获得含有第一个靶向序列的载体用BsaI酶切后再组装第二个靶向序列B；获得的含有A、B靶向序列的载体再用BsmBI酶切后组装第三个靶向序列C；获得的含有A、B、C靶向序列的载体再用BfuAI酶切后组装第四个靶向序列 D，这样依次获得组装有4个不同靶向序列的tRNA-sgRNA表达盒载体。而上述针对不同靶向位点组装的先后顺序可利用上述四个酶切位点随机进行，不局限于仅按上述顺序组装 4个不同靶位点。

靶序列的组装方法：

按表1所示，将靶向位点互补引物对(引物1和引物2)加ddH₂O轻微混匀后，95℃变性5min，放置室温1h以上。室温下复性后的引物对按1∶250比例稀释备用。

表1目标基因靶序列引物互补为DNA双链体系

按表2所示酶切体系进行U6-26：：tRNA-sgRNA表达盒载体的酶切，琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下切下目的条带。

表2 tRNA-sgRNA表达盒载体酶切体系

按表3所示体系添加各成分，轻微混匀后，4℃过夜连接。

表3靶序列组装连接体系

将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板后用表4所示的PCR体系筛选含插入靶序列的阳性克隆。其中上游的F引物分别为：

U6-26F：5′-CGTTGAACAACGGAAACTCGACTTG-3′(U6-26：：tRNA-sgRNA)

U6-29F：5′-CTGATAGATTGTATATCCATGTTT-3′(U6-29：：tRNA-sgRNA)

U6-1F：5′-CCGTGGGAGAAATCTCAAAATTCC-3′(U6-1：：tRNA-sgRNA)

U3-bF：5′-TTTACTTTAAATTTTTTCTTATGC-3′(U3-b：：tRNA-sgRNA)

或其他植物RNA聚合酶III型启动子5′端上游序列。下游R引物则分别为插入靶位点的反向互补引物：5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’。筛选到的阳性克隆进行测序验证，确认靶向位点序列已经成功插入tRNA-sgRNA表达序列相应位置中。

表4含目标靶序列克隆的PCR筛选体系

装载目标靶序列的tRNA-sgRNA表达盒与Cas9基因表达框的组装

将上述测序验证后的tRNA-sgRNA含1-4个靶向序列的表达盒用表达盒两端的限制性酶切位点切下(如U6-26：：tRNA-sgRNA表达盒两端位点分别为BamHI和EcoRI位点) 插入pCACas9载体(该载体能在植物细胞中表达Cas9蛋白，且Cas9基因表达框外序列含单一的HindIII，EcoRI，BamHI，XbaI等酶切位点)用BamHI和EcoRI酶切后相应位置，获得同时表达含目标靶向序列的tRNA-sgRNA序列以及Cas9基因的载体。获得的这个共表达载体可继续装载含其他基因靶向序列的tRNA-sgRNA表达盒，从而实现更多目标基因的编辑。

tRNA-sgRNA序列和Cas9基因共表达载体进行植物基因编辑

将含目标靶向位点的tRNA-sgRNA序列和Cas9基因共表达载体转化农杆菌EHA105或者LBA4404，利用农杆菌介导的遗传转化法将相应共表达载体导入目标植物细胞中获得转基因植株。获得的转基因植株利用CTAB法提取植株总DNA，在目标基因相应的靶位点上下游设计引物，用高保真PCR聚合酶进行扩增。转基因植株获得的PCR产物与相应野生植株PCR产物进行测序比对分析，确定靶基因是否发生片段缺失或者碱基突变，并计算相应的基因编辑效率。进一步对突变植株用高保真酶扩增目标区域片段，插入 pBluescript II SK质粒的EcoRV位点。连接产物转化大肠杆菌后在涂布20μL X-Ga1(50 mg/mL)和20μL IPTG(0.1mol/L)的平板上进行蓝白斑筛选，挑白斑进行阳性克隆检测以及测序分析，统计靶基因碱基突变类型及频率。根据上述结果分析tRNA-sgRNA序列中不同位置的靶向位点是否能够在植物中完成相应的基因编辑。

有益效果

1.利用本发明tRNA-sgRNA表达序列和表达盒可以实现多靶位点、多基因组合编辑。本发明中单个tRNA-sgRNA表达盒仅能插入4个靶向位点，但通过在Cas9植物表达载体中串联tRNA-sgRNA表达盒可以实现远超4个靶向位点的目的。(1)不同III型启动子驱动的tRNA-sgRNA表达盒串联。如U6-26：：tRNA-sgRNA/U6-29：：tRNA-sgRNA串联表达盒可以实现8个靶向位点的编辑； U6-26：：tRNA-sgRNA/U6-29：：tRNA-sgRNA/U6-1：：tRNA-sgRNA串联表达盒可以实现12个靶向位点的编辑；U6-26：：tRNA-sgRNA/U6-29：：tRNA-sgRNA/ U6-1：：tRNA-sgRNA/U3-b：：tRNA-sgRNA串联表达盒可以实现高达16个靶向位点的编辑。 (2)通过改变表达盒两端的酶切位点(如引入同尾酶BglII和BamHI酶切连接后两个酶识别位点缺失)，可以实现相同启动子驱动的tRNA-sgRNA表达盒的多次插入，如 U6-26：：tRNA-sgRNA/U6-29：：tRNA-sgRNA/U6-1：：sgRNA-tRNA/U3-b：：tRNA-sgRNA/U6-26：：tRNA-sgRNA，该串联结构中含2个U6-26：：tRNA-sgRNA表达盒，可靶向30个位点，从而实现更多的靶向位点或多个基因的组合编辑。(3)由于本发明中针对目标基因的靶向位点的组装是在中间载体中完成，因此，在将其插入Cas9表达载体时，可以根据拟研究目标性状，针对相应调控目标基因进行多个表达盒的串联组装，从而灵活实现不同目标基因编辑的自由组合，达到改良多基因调控性状的目的。

2.本发明提供的基于植物细胞内源tRNA加工系统的sgRNA表达序列可用于单子叶植物以及双子叶植物的基因编辑，利用tRNA-sgRNA/Cas9系统进行多位点基因编辑尚未在双子叶植物中被报道。将sgRNA序列和拟南芥Gly-tRNA前体tRNA结构序列融合形成一个多顺反子的tRNA-sgRNA结构序列，融合的多顺反子的tRNA-sgRNA结构序列在RNA 聚合酶III启动子的驱动下表达，表达产物能被诸如烟草、甘蓝等双子叶植物细胞内源 RNase P和RNase Z识别并剪切，生成大量的携带靶向序列的sgRNA，引导Cas9核酸酶对同一基因多个位点或多个基因多个位点进行编辑。相对已有的基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术，本发明提供了一套更为高效、简便、易操作的适用于植物的多位点、多基因编辑的技术方案，该方案对多基因调控性状的研究以及农作物多性状的改良有重要意义。基于基本的生物化学原理，推断该tRNA-sgRNA结构序列还可用于昆虫如果蝇的基因编辑，应用范围广泛。

3.本发明tRNA-sgRNA表达序列(盒)及其载体不仅具有高效的基因编辑效率，而且其靶向作用具有较高的特异性，可实现定点的点突变。

附图说明

图1实施例1甘蓝SRK3基因靶位点C区域PCR产物测序

图2实施例1甘蓝SRK3基因各靶位点突变统计

图3实施例1 SLG3基因的靶位点与SRK3基因靶位点的序列比对

图4实施例1 SLG3基因靶位点1突变类型统计

图5实施例2 pCACas-tRNA-PDS-ABC介导的烟草NtPDS基因突变的表型

图6实施例3 MS1基因靶位点C区域的PCR产物测序

图7实施例3 MS1基因各靶位点单克隆测序统计

图8实施例3 SRK3基因靶位点C区域PCR产物测序

图9实施例3 SRK3基因各靶位点单克隆测序统计

具体实施方式

结合以下具体实施案例，进一步说明本发明。应理解，这些实施例不用于限制本发明的范围。本实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所使用材料均可由公司购进。

实施例1利用tRNA-sgRNA序列表达实现甘蓝自交不亲和相关基因SRK的突变

1、人工合成本发明所示U6-26：：tRNA-sgRNA表达盒序列。

2、根据甘蓝自交不亲和系F416的SRK3单倍型基因序列以及CRISPR/Cas9基因编辑系统对靶位点序列要求，选取SRK3基因A、B、C、D四个目标靶位点，设计如下靶位点互补引物退火为双链DNA片段。

(1)SRK3基因靶位点A互补引物序列：

sgSRK-1F：5-TGCAGTGGCAGAGCTTCTCGCCAA-3

sgSRK-1R：5-AAACTTGGCGAGAAGCTCTGCCAC-3

(2)SRK3基因靶位点B互补引物序列：

sgSRK-2F：5-TGCAAACCCTATATCCAACTCCAC-3

sgSRK-2R：5-AAACGTGGAGTTGGATATAGGGTT-3

(3)SRK3基因靶位点C互补引物序列：

sgSRK-3F：5-TGCAGTGGGATCTTTAGAGTGCAT-3

sgSRK-3R：5-AAACATGCACTCTAAAGATCCCAC-3

(4)SRK3基因靶位点D互补引物序列：

sgSRK-4F：5-TGCAGGCAATAATCTTGTCCTCCT-3

sgSRK-4R：5-AAACAGGAGGACAAGATTATTGCC-3

含合成的U6-26：：tRNA-sgRNA序列的载体用BbsI酶切，将退火后的SRK3基因靶位点A双链DNA片段插入U6-26：：tRNA-sgRNA中，获得含有靶位点A的表达盒 tRNA-SRK-A；tRNA-SRK-A再用Bsa I酶切，将退火的SRK3基因靶位点B双链DNA 片段插入tRNA-SRK-A，获得含有靶位点A、B的表达框tRNA-SRK-AB；随后依次将SRK 基因靶位点C、D双链DNA片段组装到tRNA-SRK-AB以及tRNA-SRK-ABC中，获得含有表达4个SRK基因靶位点序列的tRNA-SRK-ABCD载体。

3、用BamHI和EcoRI酶切含有4个靶位点的tRNA-SRK-ABCD载体，将切下的tRNA-SRK-ABCD表达盒插入pCACas9载体BamHI和EcoRI切后的位点，获得同时表达 tRNA-SRK-ABCD序列以及Cas9基因的植物共表达载体。

4、将含tRNA-SRK-ABCD序列以及Cas9基因共表达载体利用液氮冻融法转化农杆菌感受态EHA105后转化甘蓝下胚轴，经过多轮筛选培养获得转基因甘蓝植株。

5、对获得的29株甘蓝转基因植株的靶位点序列区域PCR产物进行测序，与对应的野生型植株PCR产物序列比对，发现29株植株的SRK基因在靶位点序列区域有突变发生，编辑效率达到100％(图1)。为进一步判断发生突变的具体类型，随机挑选3株植株，将靶位点区域的PCR产物序列插入pBluescript II SK质粒EcoRV位点，挑阳性克隆进行测序(每株单克隆测序不少于5个)分析(图2)。结果表明，tRNA-sgRNA/Cas9系统能够实现单基因的多位点进行编辑。

将4个SRK3基因的靶位点与F416自交不亲和系中与SRK3基因高度同源的SLG3 基因比对后发现：在SLG3基因序列中有与SRK3基因靶位点D完全相同的序列；和靶位点A有两个碱基的错配；和靶位点C有五个碱基的错配。因此，在SLG3基因靶位点A、 C存在脱靶风险(图3)。对获得的29株转基因植株的SLG3目标区域测序分析，有潜在脱靶效应的靶位点A、C未发生脱靶效应，10株转基因植株在SLG3基因靶位点D发生了突变，编辑效率为34.5％。对突变植株靶位点做单克隆测序突变频率达81.3％(图4)。本案例结果表明tRNA-sgRNA表达序列对甘蓝基因的靶向作用具有较高特异性，同时可实现导入一个tRNA-sgRNA表达序列进行多个同源基因的敲除。

实施例2利用tRNA-sgRNA序列表达实现烟草PDS基因的突变

1、人工合成本发明所示U6-26：：tRNA-sgRNA表达盒序列。

2、根据普通烟草PDS基因序列以及CRISPR/Cas9基因编辑对靶位点序列要求，选取PDS 基因A、B、C共3个目标靶位点，设计如下靶位点互补引物退火为双链DNA片段。

(1)NtPDS基因靶位点A互补引物序列：

sgNtPDS1F：5-TGCAGCCGTTAATTTGAGAGTCCA-3

sgNtPDS1R：5-AAACCGGACTCTCAAATTAACGGC-3

(2)NtPDS基因靶位点B互补引物序列：

sgNtPDS2F：5-TGCAGCTGCATGGAAAGATGATGA-3

sgNtPDS2R：5-AAACTCATCATCTTTCCATGCAGC-3

(3)NtPDS基因靶位点C互补引物序列：

sgNtPDS3F：5-TGCAGAGGCAAGAGATGTCCTAGG-3

sgNtPDS3R：5-AAACCCTAGGACATCTCTTGCCTC-3

含合成的U6-26：：tRNA-sgRNA序列的载体用BbsI进行酶切，将退火后的NtPDS基因靶位点A双链DNA片段插入U6-26：：tRNA-sgRNA中，获得含有靶位点A的表达盒 tRNA-PDS-A；获得的tRNA-SRK-A再用Bsa I酶切，将退火后的NtPDS基因靶位点B 双链DNA片段插入，获得含有靶位点A、B的表达框tRNA-PDS-AB；将退火后的NtPDS 基因靶位点C双链DNA片段插入tRNA-PDS-AB载体的BsmBI位点，获得含有表达3个 NtPDS基因靶位点序列的tRNA-sgRNA-ABC载体。

3、将含有NtPDS基因靶位点的tRNA-sgRNA-ABC载体用BamHI和EcoRI酶切下表达盒插入到pCACas9载体BamHI和EcoRI切后的位点，获得同时表达针对烟草NtPDS基因的tRNA-sgRNA-ABC序列以及Cas9基因的植物共表达载体。

4、将含tRNA-sgRNA-ABC序列以及Cas9基因共表达载体利用液氮冻融法转化农杆菌感受态EHA105后转化烟草叶盘，经过多轮筛选培养获得转基因烟草植株。

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因编码植物类胡萝卜素合成关键酶，敲除该基因可使植物叶绿素合成受阻而出现白化现象，突变容易被发现，快速判断是否发生基因功能丧失(图5)。将转化叶盘数、出现白化芽的叶盘数、分化出的愈伤数、出现白化的愈伤数、愈伤中突变位点数作为参数进行统计(表5)。观察比较pCACas-tRNA-PDS-ABC介导的 NtPDS基因的叶盘突变率达到100％，获得的抗除草剂愈伤的突变率为94.2％。说明 tRNA-sgRNA/Cas9系统能够高效的编辑烟草基因组。

表5 pCACas-tRNA-PDS-ABC编辑烟草NtPDS基因的统计

实施例3利用tRNA-sgRNA序列表达实现甘蓝MS1基因以及SRK基因的双突变

1、人工合成本发明所示U6-26::tRNA-sgRNA表达盒序列。

2、根据甘蓝自交不亲和系F416的MS1基因(雄性不育相关基因)序列以及CRISPR/Cas9 基因编辑系统对目标靶位点序列要求，选取MS1基因中A、B、C、D四个目标靶位点，设计如下靶位点互补引物退火为双链DNA片段。

(1)MS1基因靶位点A互补引物序列：

sgMS1-1F：5-TGCAGCCTTTCTAAAACTAGAAGG-3

sgMS1-1R：5-AAACCCTTCTAGTTTTAGAAAGGC-3

(2)MS1基因靶位点B互补引物序列：

sgMS1-2F：5-TGCAGAGTAGCAAAAGGAGAGCCG-3

sgMS1-2R：5-AAACCGGCTCTCCTTTTGCTACTC-3

(3)MS1基因靶位点C互补引物序列：

sgMS1-3F：5-TGCAGAGGTTAAGAGAGGCTTCGA-3

sgMS1-3R：5-AAACTCGAAGCCTCTCTTAACCTC-3

(4)MS1基因靶位点D互补引物序列：

sgMS1-4F：5-TGCAAAGTTGGTCCTTTCAGCTCG-3

sg MS1-4R：5-AAACCGAGCTGAAAGGACCAACTT-3

合成的U6-26::tRNA-sgRNA序列通过下述引物进行PCR扩增： U6-26FX：5’-CCTCTAGATTCGTTGAACAACGGAAACTCGACT-3’；tRNA-R1：5’-GAGGATCCATTCGAAGGGACAAAAAAAAAGCACCG-3’。在其PCR扩增产物两端分别导入 XbaI和BamHI位点，PCR产物插入pBluescript II SK质粒的EcoRV位点处，获得 U6-26::tRNA-sgRNA表达盒5’为XbaI位点，3’为BamHI位点的载体。该载体用BbsI进行酶切，将退火后的MS1基因靶位点A双链DNA片段插入U6-26::tRNA-sgRNA中，获得含有靶位点A的表达盒tRNA-MS1-A；再用BsaI酶切tRNA-MS1-A，将退火后的MS1 基因靶位点B双链DNA片段插入tRNA-MS1-A，获得含有靶位点A、B的表达框 tRNA-MS1-AB；依次将MS1基因靶位点C、D双链DNA片段组装到tRNA-MS1-AB以及tRNA-MS1-ABC，获得含有表达4个MS1基因目标靶位点序列的tRNA-MS1-ABCD载体。

3、将tRNA-MS1-ABCD载体用XbaI和BamHI切下含有MS1基因4个靶位点序列表达盒插入到案例1中含tRNA-SRK-ABCD序列、Cas9基因共表达载体的XbaI和BamHI切后位点，获得同时表达tRNA-MS1-ABCD序列、tRNA-SRK-ABCD序列以及Cas9基因的植物共表达载体。

4、将含tRNA-MS1-ABCD序列、tRNA-SRK-ABCD序列以及Cas9基因共表达载体利用液氮冻融法转化农杆菌感受态EHA105后转化甘蓝下胚轴，经过多轮筛选培养获得转基因甘蓝植株。

5、首先对获得的18转基因植株的MS1基因的靶位点序列区域进行PCR扩增片段的测序，与野生型植株PCR产物序列比对发现，有5株转基因植株MS1基因的靶位点序列区域发生了突变，编辑效率达到27.8％(图6)。为了进一步判断发生突变的具体类型，PCR克隆5株植株靶位点区域序列，插入pBluescript II SK质粒的EcoRV位点处，挑选阳性克隆进行测序分析。

结果发现MS1基因在4个靶位点均有突变发生，其中有1个单株在两个靶位点同时发生了突变(图7)。另外，对MS1基因已经发生突变的5株植株中的SRK3基因进行突变检测。首先设计引物对SRK3基因4个靶位点区域序列进行扩增，扩增产物PCR测序后与从野生型植株获得的PCR产物序列进行比对，发现已经检测到MS1基因突变的5株转基因甘蓝植株中均发生了SRK3基因的突变(图8)。进一步的克隆测序分析显示在SRK3 基因的4个位点均发生了碱基插入以及缺失等类型突变(图9)。其中在2个靶位点发生突变的有3株，3个靶位点发生突变的l株，4个靶位点均发生突变的1株。

上述结果显示，将多个tRNA-sgRNA表达盒序列进行串联表达，可以在同一植株中实现多个基因的突变。

上述实施例为本发明的具体实施提供了参考，在本发明的基础上做出一些改进或修改，但不偏离本发明精神同样属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120>一种基于内源tRNA加工系统的多靶序列sgRNA表达载体及其在植物基因编辑中的应用

<160>

<210> 1

<211> 757

<212> tRNA-sgRNA表达序列

<213> Artificial(人工序列)

<220>

<221>

<222> （1）..（77）

<223> 拟南芥Gly-tRNA序列

<222> （78）..（99）

<223> type II 内切酶BbsI

<222> （100）..（185）

<223> sgRNA序列

<222> （186）..（262）

<223> 拟南芥Gly-tRNA序列

<222> （263）..（282）

<223> type II 内切酶BsaI

<222> （283）..（368）

<223> sgRNA序列

<222> （369）..（445）

<223> 拟南芥Gly-tRNA序列

<222> （446）..（465）

<223> type II 内切酶BsmBI

<222> （466）..（551）

<223> sgRNA序列

<222> （552）..（628）

<223> 拟南芥Gly-tRNA序列

<222> （629）..（654）

<223> type II 内切酶BfuAI

<222> （655）..（740）

<223> sgRNA序列

<400> 1

aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60

gattcccggc tggtgcaggg tcttcgttac agaagacctg tttcagagct atgctggaaa 120

cagcatagca agttgaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 180

ggtgcaacaa agcaccagtg gtctagtggt agaatagtac cctgccacgg tacagacccg 240

ggttcgattc ccggctggtg caagagaccc tgcagggtct ctgtttcaga gctatgctgg 300

aaacagcata gcaagttgaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga 360

gtcggtgcaa caaagcacca gtggtctagt ggtagaatag taccctgcca cggtacagac 420

ccgggttcga ttcccggctg gtgcaagaga cggttacacg tctctgtttc agagctatgc 480

tggaaacagc atagcaagtt gaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac 540

cgagtcggtg caacaaagca ccagtggtct agtggtagaa tagtaccctg ccacggtaca 600

gacccgggtt cgattcccgg ctggtgcaaa tcgcaggtgt tacaacctgc attcgtttca 660

gagctatgct ggaaacagca tagcaagttg aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 720

aagtggcacc gagtcggtgc tttttttttg tcccttc 757

<210> 2

<211> 1212

<212> tRNA-sgRNA表达盒序列

<213> Artificial(人工序列)

<220>

<221>

<222> （1）..（6）

<223> 限制性内切酶识别位点

<222> （7）..（449）

<223> AtU6-26启动子

<222> （1207）..（1212）

<223> 限制性内切酶识别位点

<400> 2

ggatcccgtt gaacaacgga aactcgactt gccttccgca caatacatca tttcttctta 60

gctttttttc ttcttcttcg ttcatacagt ttttttttgt ttatcagctt acattttctt 120

gaaccgtagc tttcgttttc ttctttttaa ctttccattc ggagtttttg tatcttgttt 180

catagtttgt cccaggatta gaatgattag gcatcgaacc ttcaagaatt tgattgaata 240

aaacatcttc attcttaaga tatgaagata atcttcaaaa ggcccctggg aatctgaaag 300

aagagaagca ggcccattta tatgggaaag aacaatagta tttcttatat aggcccattt 360

aagttgaaaa caatcttcaa aagtcccaca tcgcttagat aagaaaacga agctgagttt 420

atatacagct agagtcgaag tagtgattga acaaagcacc agtggtctag tggtagaata 480

gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgcagggt cttcgttaca 540

gaagacctgt ttcagagcta tgctggaaac agcatagcaa gttgaaataa ggctagtccg 600

ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgcaacaaa gcaccagtgg tctagtggta 660

gaatagtacc ctgccacggt acagacccgg gttcgattcc cggctggtgc aagagaccct 720

gcagggtctc tgtttcagag ctatgctgga aacagcatag caagttgaaa taaggctagt 780

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcaac aaagcaccag tggtctagtg 840

gtagaatagt accctgccac ggtacagacc cgggttcgat tcccggctgg tgcaagagac 900

ggttacacgt ctctgtttca gagctatgct ggaaacagca tagcaagttg aaataaggct 960

agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc aacaaagcac cagtggtcta 1020

gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc gattcccggc tggtgcaaat 1080

cgcaggtgtt acaacctgca ttcgtttcag agctatgctg gaaacagcat agcaagttga 1140

aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct ttttttttgt 1200

cccttcgaat tc 1212

<210> 3

<211> 353

<212> U6-29启动子

<213> Artificial(人工序列)

<400> 3

ctgatagatt gtatatccat gtttagttgg attaaatatc aaagatctct tacagttagt 60

ttcgttctta atccaaacta ctgcagcctg acagacaaat gaggatgcaa acaattttaa 120

agtttatcta acgctagctg ttttgtttct tctctctggt gcaccaacga cggcgttttc 180

tcaatcataa agaggcttgt tttacttaag gccaataatg ttgatggatc gaaagaagag 240

ggcttttaat aaacgagccc gtttaagctg taaacgatgt caaaaacatc ccacatcgtt 300

cagttgaaaa tagaagctct gtttatatat tggtagagtc gactaagaga ttg 353

<210> 4

<211> 313

<212> u6-1启动子

<213> Artificial(人工序列)

<400> 4

ccgtgggaga aatctcaaaa ttccggcaga acaattttga atctcgatcc gtagaaacga 60

gacggtcatt gttttagttc caccacgatt atatttgaaa tttacgctga gtgtgagtga 120

gacttgcata agaaaataaa atctttagtt gggaaaaaat tcaataatat aaatgggctt 180

gagaaggaag cgagggatag gcctttttct aaaataggcc catttaagct attaacaatc 240

ttcaaaagta ccacatcgct taggtaaaga aagcagctga gtttatatat ggttagagac 300

gaagtagtga ttg 313

<210> 5

<211> 325

<212> u3-b启动子

<213> Artificial(人工序列)

<400> 5

tttactttaa attttttctt atgcagcctg tgatggataa ctgaatcaaa caaatggcgt 60

ctgggtttaa gaagatctgt tttggctatg ttggacgaaa caagtgaact tttaggatca 120

acttcagttt atatatggag cttatatcga gcaataagat aagtgggctt tttatgtaat 180

ttaatgggct atcgtccata gattcactaa tacccatgcc cagtacccat gtatgcgttt 240

catataagct cctaatttct cccacatcgc tcaaatctaa acaaatcttg ttgtatatat 300

aacactgagg gagcaacatt ggtca 325

<210> 6

<211> 527

<212>甘蓝SRK3基因靶位点区域序列:＞SRK3

<213> Artificial(人工序列)

<400> 6

gacattgtcc gacagaacct atgtatggat tgccaacaga gataacccta tatccaactc 60

cactggaacc ctcaaaatct caggcaataa tcttgtcctc cttggtgact ccaataaacc 120

tgtttggtcg acgaatctaa ctagaagaag tgagagatct ccagtggtgg cagagcttct 180

cgccaacgga aacttcgtga tgcgagactc caacaacaac gatgcaagtc aatttttatg 240

gcaaagtttc gattacccta cagatacttt gcttcctgac atgaaactgg gttacgacct 300

aaaaacaggg ctggacagat tccttacatc atggagaagt ttagatgatc cgtcaagcgg 360

gaatttctcg tacaggctcg aaacccgaaa gtttcctgaa ttttatttaa ggagtgggat 420

ctttagagtg catcggagtg gtccatggaa tggaatccga tttagtggca taccagatga 480

ccaaaagttg agttacatgg tttacaattt cacagataat agtgaag 527

<210> 7

<211> 4543

<212> 烟草NtPDS基因靶位点区域序列:＞NtPDS

<213> Artificial(人工序列)

<400> 7

aaacagttga gtacttcttt aatccttcct aattctttgt caggggtatc tttttgtggg 60

taacggccaa accaccacaa atttccagtt cccactttta actctttaac ttcaattcaa 120

ctagtttatt tccttttgct tcctacaact ataacatagt cttggtttca gaatccacaa 180

cttgaaatac aactcctagg cggtttcatt ccgaggtaag aaatgatttt gcttttcttt 240

ggttacatca gctgaatgct ttacttgaga aaagctttct ctttttttcc tttctttgat 300

gtgtaccgcc cgtttatgat cttggtattt gctctttttt gtactcgtcc ggactttaac 360

ttgattttgt gggtgaagta ttaaaacaag ttttatatgg actgtaaaag ctagaatctt 420

ttttactttt gcatataaat ttgtataata aatgcttatg aacctgcata taaatttgta 480

taataaatgc atatggccat ttgaaaaaga aaaggaattc cacatagtat ttagattcac 540

aagtgggaca atcttcttac actgaaatat ctttatgtca ggcttaattt accgctattt 600

tgctcagtaa aatgccccaa attggacttg tttctgccgt taatttgaga gtccaaggta 660

attcagctta tctttggagc tcgaggtctt cgttgggaac tgaaagtcaa gatggtcgct 720

tgcaaaggaa tttgttatgt tttggtagta gcgactccat ggggcataag ttaaggattc 780

gtactcccag tgccacgacc agaagattga caaaggactt taatccttta aaggtttgtt 840

ttgaatgcga aagtgtgatg atggatttat ggtcattgaa tttatgatct tgggcatata 900

ttctctaaaa taagagaagt atatcttgcc attcaggtag tctgcattga ttatccaaga 960

ccagagctag acaatacagt taactatttg gaggcggcgt tattatcatc atcatttcgt 1020

acttcctcac gcccaactaa accattggag attgttattg ctggtgcagg tgattttttc 1080

cggtcatcta tatttgtagt cttcatttct ctttcttcgg aaggaagatc attctattag 1140

ttgtattatc actagaatat ttacctgggc attcttttct gattaactgt tttggaccgc 1200

aaaattttag gttcttactt cttcgccatt ttgcaactaa tcaacaagtc ccagctgatt 1260

agattaggag cggtttgaaa attcgtttgt tttgatctat ttttgccgtc actccattta 1320

tatacatatc tattctctct tatcatctga gccatgataa gcaggtgaac gtgctgtcta 1380

ttgggtggca tgtccaaagg atcattctga aatattggag gctaatgaat caatatcttg 1440

tgcaagattg atctcactat acctataatc agagtactta gagttccaaa aatttcaaaa 1500

ccaattgaaa agtcaaacga gttacatata ggggttgcac tcttctaagg cttgcaatct 1560

gtgagaaaaa gatgagaagg agatcttcat atttcatctt tactagtctg gaccactgac 1620

cggttagcag ttttcaacgt gttcttcaac ttggcttgca aaatactgtg ccggtcattt 1680

ctcttgtatt gtcatcaact ggttgattat ctgagtacct aaagaaagaa tgttatatgc 1740

atgattcatt ctgctgtact ataaaagata taataaagaa tgctagccga ggtactacat 1800

agccttttcc aataaataga agctgtaaca tgattctaat tcattttttt tgcaatatca 1860

ggtttgggtg gtttgtctac agcaaaatat ctggcagatg ctggtcacaa accgatattg 1920

ctggaggcaa gagatgtcct aggtggaaag gtgaagaaga tccagtcttt cctttaattt 1980

tattcctttt tcttttgtgt ccttccctat tgatagtccc ttttcaggaa ggcttctgtt 2040

tgttttattt aaaatcattt ttcatactct ttaaacattc agttgctcaa acaattgcaa 2100

gggtgttcac tattcctatt cntatatata tatctgtttt tggaggaaat tgatatgtcc 2160

taaaattttc cagctttact actaataaag ttggttgtcg aaaaattata cagcatatta 2220

ggtaaaagat atggaaagta tattattatc attctctatt attttatgat tcagtcaatt 2280

ttacccgtcc tgttgggtgt atttctcgta taaatacagt cttatctgtg agatgctatg 2340

tgaattagct gttgttttca gtatagaaca ctatcttagt ctgttttatc ttactgaagc 2400

agtcaccaag aatctagctg tataggctaa aatattgaat tagcattaat ctttatctgt 2460

tctgcacctg aatacttata cctccctttt aggtagctgc atggaaagat gatgatggag 2520

attggtatga gactgggttg catatattct gtaagtttga ctcctcaaga atgcgtactt 2580

taatcttcta atacagtcat agcaatttct ttcaagatct tttttgtcca ttaatcagat 2640

agcaatccct gtttgtcttt tgttttttgc aaataaccaa tttttgtcag tcgatctgta 2700

ttctgccttg cctctctttt ttcatctgtt aatttcgtat ggtgactcat acaagttggt 2760

gcatctcctt taagttgggg cttacccaaa tatgcagaac ctgtttggag aactagggat 2820

taacgatcga ttgcagtgga aggaacattc aatgatattt gcgatgccta acaagccagg 2880

ggaattcagc cgctttgatt ttcctgaagc tcttcctgcg ccattaaatg gtaagtactt 2940

aatcatgagt aaattttttc ccttctgtat tgaatattga ttatgcaaac ttccccagta 3000

aggtatgaaa ttgattagtc cattaatacc tctggcgcat tgctaacatt aaaagaacat 3060

aaaggttcat tacgtcttga tcagaatttc tgcatgtagc taaagtgatt gagtgtatgt 3120

acaaattttt acacattgca agcataagcc agttattgtt atctcttatt ttcatttctc 3180

tagctgtatc tcttattctc atttctctat ctatgtgtta ttacttctac aggaattttg 3240

gccatactaa agaacaatga aatgcttaca tggcccgaaa aagtcaaatt tgctattgga 3300

ctcttgccag caatgcttgg agggcaatct tatgttgaag ctcaagacgg tttaagtgtt 3360

aaggactgga tgagaaagca agtgcgtgat cattttatct tactctttta gctcataacc 3420

ttgaagacat agttgacttg caagttgttg atttaacatg ttagaaatgt ctacctgcct 3480

ttccttttct aacaacatac atcttgcaaa actcatcagc agctatttgc ttaattgctt 3540

ttcagggtgt gcctgatagg gtgacagatg aggtgttcat tgccatgtca aaggcactta 3600

acttcataaa ccctgacgag ctttcgatgc agtgcatttt gattgctttg aacagatttc 3660

ttcaggttag aatcctgatc caccctcaaa acaaaaagag agaaagggat atagtcctac 3720

caaagctgta aatcatgttt gggacctgac atattggtgc aggaaactta tgagtgaact 3780

tgtccactca gtttaacttt tctgatatat ttgaattatc aatttgcagg agaaacatgg 3840

ttcaaaaatg gcctttttag atggtaaccc tcctgagaga ctttgcatgc cgattgttga 3900

acatattgag tcaaaaggtg gccaagtcag actaaactca cgaataaaaa agattgagct 3960

caatgaggat ggaagtgtca aatgttttat actgaataat ggcagtacaa ttaaaggaga 4020

tgcttttgtg tttgccactc caggtataat atccattata ctagtatcga tgcttccagt 4080

tttcacattt ttaatatgaa tttataaatt tttgctggct tttgattatc cgattagtgg 4140

atatcttcaa gcttcttttg cctgaagact ggaaagagat cccatatttc caaaagttgg 4200

agaagctagt gggagttcct gtgataaatg tccatatatg gttagtgatg aaaattttac 4260

ttgtcagtgt ttgttcttcc tctagcatat ctatgtatgt gcgtgtaaat gtctatacgt 4320

acataaacat gtagtcctct gtttttgtgt taacttccat tgaatgagga acttatggat 4380

gtacgctttt ccaaaacttt gattggacac attgctttgt gttttcaact ttgatgagca 4440

gaactaccat tgtttagcta ttagtggttg agattcctat tgaaaagatt tgtataaatt 4500

taatttgcag gtttgacaga aaactgaaga acacatctga taa 4543

<210> 8

<211> 1699

<212> 甘蓝MS1基因靶位点区域序列：>BoMS1

<213> Artificial(人工序列)

<400> 8

atgtcgaatc tgattcgaac agatcttcca aagaagagga agagaggaga aagtacggtt 60

tttaggctga agactttcgg agagacagga catcccgctg agctgaacca gttgtctttt 120

agagacaacc ttgggaagct tcttgagttt ggtcactttg agagctccgg tctcatggga 180

agttggtcct ttcagctcga ggttcatcgt cacccaaatc ctctatatgt tcttctcttt 240

gtcgtcgaag agcccatcga agcctctctt aacctccgtt gcaaccattg ccaatatgtt 300

ggtgacgtca tctccctctt tctctccact tctctcattg tctatatata ttttgcatat 360

cgatatctat ctatctatat gtgtgtgtgc atgctgatac atccataata tgatcaacga 420

tcacaacgta acaataaaaa gacctgataa gataatttag ctcaccgagt aagcattttt 480

cgttgcatat ctatgaaaaa tataacaagc ggaaaaaaaa atgatatggt gatccaagag 540

tgttggaggc tcaacctctt ttagaaggat gatagtttca ttgattcaaa tttcatatgt 600

taattttaat atgttacatg taataggtca acaatatgta ttatgcattt atttatggaa 660

cattacaggt tggggaaacc acatgatatg caacaagaag taccatttcg tgatcccctc 720

aaaggaaaca atggccgcct ttctaaaact agaaggagga atcttggttt ctcccgaaaa 780

agaaagcctc tcccatcttg tggaacttca aggccatgtc cttcacggct ttttccactc 840

caacggattt ggtcacttgc tctcaatcaa tggcatcgag tccggttccg acttaaccgg 900

tcatcaagtc atggagttgt gggatcgcct ctgctctggt ttaaaggcca ggtatacgta 960

ttaagattat aattatcatc ttttatattt gtatacgttg tgcaatgttc acgtgataca 1020

tatcatatgg tactaaacca ttcagcagaa ttctatgact tgtcataaat aataaagttt 1080

ggatttttaa ccatttaatt catggtagtc aagtgctttg aagattcaac acatggttga 1140

gagcaatttc aaccatacta gtaactttgt taactcaaga aaccaccact ttatagaact 1200

tgggacgaaa ttctggattt tagtttcgaa ttatagatat tattcgaatt ttctcttttg 1260

cttttagtta taaatttcac atattaggcc attttattag aaatggtaac aattatttgt 1320

atcttattat gttatggtat atatgttgga tataggaaaa tagggttgaa cgatgcatcg 1380

cacaagaaag ggatggaact gaggctgctg catggagtag caaaaggaga gccgtggttc 1440

ggtcgttggg gttaccggtt cgggtcaggg acatacggag tgactcaaaa gatttacgag 1500

aaggcacttg agtcggtccg caacgtaccc ttgtgtttgc ttaaccatca cctaaccagc 1560

cttaaccgtg agactccaat cctcttgtca aggtatcaaa ctttatccac cgagccattg 1620

attactctca gtgatctctt catgttcatg cttcatctcc attcgcgtct tccaagagac 1680

aactacatga ataactccc 1699

<210> 9

<211> 13969

<212> pCACas9植物表达载体序列：>pCACas9

<213> Artificial(人工序列)

<400> 9

gaattcctcg agtacgtagg atccatttaa attctagagg cgcgccgata tcctctctta 60

aggtagcgag ctcttaatta atagggataa cagggtaatt aactataacg gtcctaaggt 120

agcgatggca aacagctatt atgggtatta tgggtggttc tttatgcgga cactgacggc 180

tttatgcctg caggtcgcga gcgatcgcgg taccgcccgg gcgtcgacag gcctgatcta 240

gtaacataga tgacaccgcg cgcgataatt tatcctagtt tgcgcgctat attttgtttt 300

ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata 360

acgtcatgca ttacatgtta attattacat gcttaacgta attcaacaga aattatatga 420

taatcatcgc aagaccggca acaggattca atcttaagaa actttattgc caaatgtttg 480

aacgatctgc agtcacttct tcttcttagc ctgtccagcc ttcttggtag cagctggtct 540

cttatctcct ccaagctgag aaagatcgat tctggtctcg taaagtccgg tgatagactg 600

gtggataagg gtagcatcaa gaacctcctt ggtagaggtg tatctttttc tatcgatggt 660

ggtatcgaag tacttgaaag cagctggagc accaaggttg gtaagggtga aaaggtggat 720

gatgttctca gcctgctctc tgattggctt atctctgtgc ttgttgtaag cagaaagaac 780

cttatcaagg ttagcatcag caaggataac tctcttagag aactcagaga tttgctcgat 840

gatctcatca aggtagtgct tgtgctgctc aacgaaaagc tgcttctgct cgttatcctc 900

tggagatccc ttcaacttct cgtagtgaga agcaaggtaa aggaagttaa cgtacttaga 960

tggaagagca agctcgtttc ccttctgaag ctctccagca gaagcaagca ttctctttct 1020

tccgttctca agctcgaaaa gagagtactt tggcaacttg atgataagat ccttcttaac 1080

ctccttgtat cccttagcct caaggaaatc gattgggttc ttctcgaaag aagaacgctc 1140

catgatggtg attccaagaa gctccttaac agacttcaac ttcttagact ttcccttctc 1200

aaccttagca acaacaagaa cagagtaagc aacggttgga gaatcgaatc ctccgtactt 1260

ctttgggtcc caatccttct ttctagcgat caacttatca gagtttctct ttggaaggat 1320

agactcctta gagaatcctc cggtctgaac ctcggttttc ttaacgatgt taacctgtgg 1380

catagaaaga acctttctaa cggtagcgaa atctcttccc ttatcccaaa cgatctctcc 1440

ggtctctccg ttggtctcga taagtggtct ctttctgatc tctccgttag caagggtgat 1500

ctcggtcttg aagaagttca tgatgttaga gtagaagaag tacttagcgg tagcctttcc 1560

gatctcctgc tcagacttag cgatcatctt tctaacatcg taaaccttgt aatctccgta 1620

aacgaactca gactccaact ttgggtactt cttgataaga gcggttccaa caacagcgtt 1680

aaggtaagca tcgtgagcgt ggtggtagtt gttgatctct ctaaccttgt agaactggaa 1740

atcctttctg aaatcagaaa ccaacttaga cttcaaggtg ataaccttaa cctctctgat 1800

caacttatcg ttctcatcgt acttggtgtt catacgagaa tcaaggatct gagcaacgtg 1860

cttggtgatc tgtctggtct caacaagctg tctcttgatg aatccagcct tatcaagctc 1920

agaaagtcct cctctctcag ccttggtaag gttatcgaac tttctctggg tgatcaactt 1980

agcgttaaga agctgtctcc agtagttctt catcttctta acaacctcct cagatggaac 2040

gttatcagac tttcctctgt tcttatcaga acgggtaaga accttgttat cgatagaatc 2100

atccttcaag aaagactgtg gaacgatgtg atcaacatcg taatcagaaa gtctgttgat 2160

gtcaagctcc tgatcaacgt acatatctct tccgttctga aggtagtaaa ggtacaactt 2220

ctcgttctga agctgggtgt tctcaactgg gtgctccttc aagatttgag atccaagctc 2280

cttgattccc tcctcgattc tcttcattct ctcacgagag ttcttctgtc ccttctgggt 2340

ggtctggttc tctctagcca tctcgataac gatgttctct ggcttgtgtc tacccataac 2400

cttaacaagc tcatcaacaa ccttaacggt ctgaaggatt cccttcttga tagctggaga 2460

tccagcaagg ttagcgatgt gctcgtgaag agaatctccc tgtccagaaa cctgagcctt 2520

ctggatgtcc tccttgaagg taagagaatc atcgtggata agctgcatga agtttctgtt 2580

agcgaatcca tcagacttca agaaatcaag gatggtcttt ccagactgct tatctctgat 2640

tccgttgatc aacttacgag aaagtctacc ccatccggtg tatcttcttc tcttcaactg 2700

cttcataacc ttatcatcga aaaggtgagc gtaggtcttg agtctctcct cgatcatctc 2760

tctatcctcg aaaagggtaa gggtaagaac gatgtcctca aggatgtcct cgttctcctc 2820

gttatcaagg aaatccttat ccttgatgat cttcaaaaga tcgtggtagg ttccaagaga 2880

agcgttgaat ctatcctcaa ctccagagat ttcaacagaa tcgaagcact cgatcttctt 2940

gaagtaatcc tccttcaact gcttaacggt aacctttctg ttggtcttga aaagaagatc 3000

aacgatagcc ttcttctgct ctccagaaag gaaagctggc tttctcattc cctcggtaac 3060

gtacttaacc ttggtaagct cgttgtaaac ggtgaagtac tcgtaaagaa gagagtgctt 3120

tggaagaacc ttctcgtttg gaaggttctt atcgaagttg gtcattctct cgatgaaaga 3180

ctgagcagaa gctcccttat caacaacctg cacatcaaca aattttggtc atatattaga 3240

aaagttataa attaaaatat acacacttat aaactacaga aaagcaattg ctatatacta 3300

cattctttta ttttgaaaaa aatatttgaa atattatatt actactaatt aatgataatt 3360

attatatata tatcaaaggt agaagcagaa acttacctcc tcgaagttcc aaggggtgat 3420

ggtctcctca gactttctgg tcatccaagc gaaacgagag tttcctctag caagtggtcc 3480

aacgtagtat gggattctga aggtaaggat cttctcgatc ttctctctgt tatccttcaa 3540

gaatgggtag aaatcctcct gtctacgaag gatagcgtga agctctccaa ggtggatctg 3600

gtgtgggata gatccgttat cgaaggttct ctgctttcta agaagatcct ctctgttcaa 3660

cttaacaaga agctcctcgg ttccatccat cttctcaagg attggcttga tgaacttgta 3720

gaactcctcc tgagaagctc ctccatcgat gtatccagcg tatccgttct tagactgatc 3780

gaagaagatt tccttgtact tctctggaag ctgctgtcta acaagagcct tcaaaagggt 3840

aagatcctgg tggtgctcat cgtatctctt gatcatagaa gcagaaagtg gagccttggt 3900

gatctcggtg ttaactctaa ggatgtcaga aagaaggata gcatcagaaa ggttcttagc 3960

agcaaggaaa agatcagcgt actgatctcc gatctgagca agaaggttat caagatcatc 4020

atcgtaggta tccttagaaa gctgcaactt agcatcctca gcaagatcga agttagactt 4080

gaagtttggg gtaagtccaa gagaaagagc gataaggttt ccgaaaagtc cgttcttctt 4140

ctctcctgga agctgagcga taaggttctc aagtctacga gacttagaaa gtctagcaga 4200

aaggatagcc ttagcatcaa ctccagaagc gttgattggg ttctcctcga aaagctggtt 4260

gtaggtctga acaagctgga tgaacaactt atcaacatca gagttatctg ggttaaggtc 4320

tccctcgata aggaagtgtc ctctgaactt gatcatgtga gcaagagcaa ggtagataag 4380

tctaagatca gccttatcgg tagaatcaac caacttcttt ctaaggtggt agatggttgg 4440

gtacttctcg tggtaagcaa cctcatcaac gatgtttccg aagattgggt gtctctcgtg 4500

cttcttatcc tcctcaacaa ggaaagactc ctcaagtctg tggaagaaag aatcatcaac 4560

cttagccatc tcgttagaga agatttcctg aaggtagcag attctgttct ttcttctggt 4620

gtatcttctt ctagcggttc tcttcaatct ggtagcctca gcggtctctc cagaatcgaa 4680

aagaagagca ccgataaggt tcttcttgat agagtgtcta tcggtgtttc caagaacctt 4740

gaacttctta gatggaacct tgtactcatc ggtgataaca gcccatccaa cagagttggt 4800

tccgatgtca agtccgatag agtacttctt atcagcagct ggaactccgt ggattccaac 4860

ctttctcttc ttctttggag ccatcttatc atcatcatcc ttgtaatcct tatcatcatc 4920

atccttgtaa tccatggtgg aagtatttga aagaaaatta aaaataaaaa gatctcctct 4980

ccaaatgaaa tgaacttcct tatatagagg aagggtcttg cgaaggatag tgggattgtg 5040

cgtcatccct tacgtcagtg gagatatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg 5100

gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt 5160

cggcagaggc atcttcaacg atggcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggagc 5220

caccttcctt ttccactatc ttcacaataa agtgacagat agctgggcaa tggaatccga 5280

ggaggtttcc ggatattacc ctttgttgaa aagtctcaat cggaccatca catcaatcca 5340

cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg 5400

gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg catcttcaac gatggccttt cctttatcgc 5460

aatgatggca tttgtaggag ccaccttcct tttccactat cttcacaata aagtgacaga 5520

tagctgggca atggaatccg aggaggtttc cggatattac cctttgttga aaagtctcaa 5580

tcggacctgc aggcatgcaa gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga 5640

aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg 5700

taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga 5760

atgctagagc agcttgagct tggatcagat tgtcgtttcc cgccttcagt ttaaactatc 5820

agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa cctaagagaa aagagcgttt attagaataa 5880

cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg tgcatgccaa 5940

ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg ctatagtgca 6000

gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct tctgaaaacg acatgtcgca caagtcctaa 6060

gttacgcgac aggctgccgc cctgcccttt tcctggcgtt ttcttgtcgc gtgttttagt 6120

cgcataaagt agaatacttg cgactagaac cggagacatt acgccatgaa caagagcgcc 6180

gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc agcaccgacg accaggactt gaccaaccaa 6240

cgggccgaac tgcacgcggc cggctgcacc aagctgtttt ccgagaagat caccggcacc 6300

aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg cttgaccacc tacgccctgg cgacgttgtg 6360

acagtgacca ggctagaccg cctggcccgc agcacccgcg acctactgga cattgccgag 6420

cgcatccagg aggccggcgc gggcctgcgt agcctggcag agccgtgggc cgacaccacc 6480

acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt cgagcgttcc 6540

ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc gaggccgcca aggcccgagg cgtgaagttt 6600

ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag atcgcgcacg cccgcgagct gatcgaccag 6660

gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc gaccctgtac 6720

cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg cggtgccttc 6780

cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga acgccaagag 6840

gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt accgaagaga 6900

tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac gtctcaaccg 6960

tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt ctgatgccaa gctggcggcc tggccggcca 7020

gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta tttgagtaaa 7080

acagcttgcg tcatgcggtc gctgcgtata tgatgcgatg agtaaataaa caaatacgca 7140

aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag gcaagacgac 7200

catcgcaacc catctagccc gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc tgttagtcga 7260

ttccgatccc cagggcagtg cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc aaccgctaac 7320

cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga ccgcgacgtg aaggccatcg gccggcgcga 7380

cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg cgatcaaggc 7440

agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg ccaccgccga 7500

cctggtggag ctggttaagc agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac aagcggcctt 7560

tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg aggcgctggc 7620

cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct acccaggcac 7680

tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg cccgcgaggt 7740

ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg taaagagaaa 7800

atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc ggccgtccga gcgcacgcag cagcaaggct 7860

gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt tcagttgccg 7920

gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac cattaccgag 7980

ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat aaatgagtag 8040

atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag gcaccgacgc 8100

cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg gctgggttgt 8160

ctgccggccc tgcaatggca ctggaacccc caagcccgag gaatcggcgt gacggtcgca 8220

aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg gagaagttga 8280

aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc ggtgaatcgt 8340

ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca gccggtgcgc 8400

cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt ccgatgctct 8460

atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc cgtctgtcga 8520

agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg cacgtagagg 8580

tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta ctgatggcgg 8640

tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac aagcccggcc 8700

gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc gatggcggaa 8760

agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac gttgccatgc 8820

agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt gaagccttga 8880

ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc gagatcgagc 8940

tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg ctgacggttc 9000

accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc ctggcacgcc 9060

gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa cgcagtggca 9120

gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg tcaaatgacc 9180

tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta gtcatgcgct 9240

accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag cagatgctag 9300

ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg gatagcacgt 9360

acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg aacccaaagc 9420

cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa aaaggcgatt 9480

tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg gcctgtgcat 9540

aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt cggtcgctgc 9600

gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc tcaaaaatgg 9660

ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg ccactcgacc 9720

gccggcgccc acatcaaggc accctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc 9780

tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 9840

caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag 9900

tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 9960

tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 10020

tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 10080

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 10140

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 10200

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 10260

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 10320

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 10380

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 10440

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 10500

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 10560

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 10620

agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 10680

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 10740

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 10800

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 10860

ggattttggt catgcattct aggtactaaa acaattcatc cagtaaaata taatatttta 10920

ttttctccca atcaggcttg atccccagta agtcaaaaaa tagctcgaca tactgttctt 10980

ccccgatatc ctccctgatc gaccggacgc agaaggcaat gtcataccac ttgtccgccc 11040

tgccgcttct cccaagatca ataaagccac ttactttgcc atctttcaca aagatgttgc 11100

tgtctcccag gtcgccgtgg gaaaagacaa gttcctcttc gggcttttcc gtctttaaaa 11160

aatcatacag ctcgcgcgga tctttaaatg gagtgtcttc ttcccagttt tcgcaatcca 11220

catcggccag atcgttattc agtaagtaat ccaattcggc taagcggctg tctaagctat 11280

tcgtataggg acaatccgat atgtcgatgg agtgaaagag cctgatgcac tccgcataca 11340

gctcgataat cttttcaggg ctttgttcat cttcatactc ttccgagcaa aggacgccat 11400

cggcctcact catgagcaga ttgctccagc catcatgccg ttcaaagtgc aggacctttg 11460

gaacaggcag ctttccttcc agccatagca tcatgtcctt ttcccgttcc acatcatagg 11520

tggtcccttt ataccggctg tccgtcattt ttaaatatag gttttcattt tctcccacca 11580

gcttatatac cttagcagga gacattcctt ccgtatcttt tacgcagcgg tatttttcga 11640

tcagtttttt caattccggt gatattctca ttttagccat ttattatttc cttcctcttt 11700

tctacagtat ttaaagatac cccaagaagc taattataac aagacgaact ccaattcact 11760

gttccttgca ttctaaaacc ttaaatacca gaaaacagct ttttcaaagt tgttttcaaa 11820

gttggcgtat aacatagtat cgacggagcc gattttgaaa ccgcggtgat cacaggcagc 11880

aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc taccctccgc gagatcatcc gtgtttcaaa 11940

cccggcagct tagttgccgt tcttccgaat agcatcggta acatgagcaa agtctgccgc 12000

cttacaacgg ctctcccgct gacgccgtcc cggactgatg ggctgcctgt atcgagtggt 12060

gattttgtgc cgagctgccg gtcggggagc tgttggctgg ctggtggcag gatatattgt 12120

ggtgtaaaca aattgacgct tagacaactt aataacacat tgcggacgtt tttaatgtac 12180

tgaattaacg ccgaattaat tcgggggatc tggattttag tactggattt tggttttagg 12240

aattagaaat tttattgata gaagtatttt acaaatacaa atacatacta agggtttctt 12300

atatgctcaa cacatgagcg aaaccctata ggaaccctaa ttcccttatc tgggaactac 12360

tcacacatta ttatggagaa actcgagtta aatctcggtg acgggcagga ccggacgggg 12420

cggtaccggc aggctgaagt ccagctgcca gaaacccacg tcatgccagt tcccgtgctt 12480

gaagccggcc gcccgcagca tgccgcgggg ggcatatccg agcgcctcgt gcatgcgcac 12540

gctcgggtcg ttgggcagcc cgatgacagc gaccacgctc ttgaagccct gtgcctccag 12600

ggacttcagc aggtgggtgt agagcgtgga gcccagtccc gtccgctggt ggcgggggga 12660

gacgtacacg gtcgactcgg ccgtccagtc gtaggcgttg cgtgccttcc aggggcccgc 12720

gtaggcgatg ccggcgacct cgccgtccac ctcggcgacg agccagggat agcgctcccg 12780

cagacggacg aggtcgtccg tccactcctg cggttcctgc ggctcggtac ggaagttgac 12840

cgtgcttgtc tcgatgtagt ggttgacgat ggtgcagacc gccggcatgt ccgcctcggt 12900

ggcacggcgg atgtcggccg ggcgtcgttc tgggctcatc tcgagagaga tagatttgta 12960

gagagagact ggtgatttca gcgtgtcctc tccaaatgaa atgaacttcc ttatatagag 13020

gaaggtcttg cgaaggatag tgggattgtg cgtcatccct tacgtcagtg gagatatcac 13080

atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg 13140

tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc 13200

ctttatcgca atgatggcat ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc cttttgatga 13260

agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa 13320

aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga 13380

gagtgtcgtg ctccaccatg ttatcacatc aatccacttg ctttgaagac gtggttggaa 13440

cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc atctttggga ccactgtcgg 13500

cagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg atggcatttg taggtgccac 13560

cttccttttc tactgtcctt ttgatgaagt gacagatagc tgggcaatgg aatccgagga 13620

ggtttcccga tattaccctt tgttgaaaag tctcaatagc cctttggtct tctgagactg 13680

tatctttgat attcttggag tagacgagag tgtcgtgctc caccatgttg gcaagctgct 13740

ctagccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 13800

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 13860

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 13920

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattac 13969

Claims (9)

1.一种tRNA-sgRNA表达序列，其特征在于：tRNA序列、type II内切酶、sgRNA序列依次排列为独立的转录单元，将4个所述转录单元串联排列，串联排列的4个转录单元中所述type II内切酶依次分别为BbsI、BsaI、BsmBI和BfuAI。

2.如权利要求1所述tRNA-sgRNA表达序列，其特征在于：序列如SEQ ID NO.1所述。

3.一种tRNA-sgRNA表达盒，包括权利要求1或2所述表达序列。

4.如权利要求3所述tRNA-sgRNA表达盒，所述tRNA-sgRNA表达序列的上游连接RNA聚合酶III型启动子。

5.如权利要求3或4所述tRNA-sgRNA表达盒，所述启动子为拟南芥的III型启动子U6-26，U6-29，U6-1或U3-b。

6.如权利要求5所述tRNA-sgRNA表达盒，表达盒序列如SEQ ID NO.2所述，或者U6-29序列如SEQ ID NO.3所述，或者U6-1序列如SEQ ID NO.4所述，U3-b如EQ ID NO.5所述。

7.一种tRNA-sgRNA表达载体，包括权利要求1或2所述表达序列或权利3-6任一所述表达盒。

8.一种tRNA-sgRNA表达载体，将权利要求3-6任一所述表达盒插入pCACas9载体。

9.一种宿主细胞，包括权利要求1或2所述表达序列，或者权利3-6任一所述表达盒，或者权利要求7或8所述表达载体。