CN108531481A - 一种合成基因及其构建烟草多基因定点突变载体的方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种合成基因及其构建烟草多基因定点突变载体的方法与应用，所述合成基因的序列是以tRNA+sgRNA+gRNA的核苷酸序列顺序合成的一个或多个基因重复序列。合成的基因连接进pUC57‑Kan大肠杆菌克隆载体中。有两种方法扩增获得合成基因序列。构建好的载体转化烟草，通过测序挑选出成功敲除多基因的转基因烟草植株。本发明适用于在一株转基因烟草中同时造成多个目的基因定点突变及应用，为研究烟草中多个基因之间的相互作用提供一种快速、简便的方法。

Description

一种合成基因及其构建烟草多基因定点突变载体的方法与 应用
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种合成基因及其构建烟草多基因定点突变载体的方法与应用。
背景技术
多基因突变体在植物基础功能研究及作物育种中有着重要意义。传统获得多突变体的方法是通过单突变体间的相互杂交、子代分离来完成。但是此方法存在以下问题：1、基因突变的位点随机性，并不能都能得到所需基因位点的单突变体；2、通过杂交重组得到多突变体，若几个基因间存在紧密连锁，则几乎无法获得多突变体；3、整个过程耗时耗力。
CRISPR-Cas9是编辑基因组简单、高效且应用广泛的工具。该系统主要利用内切酶Cas9及定位的向导gRNA(sgRNA)分子，对基因组中特定的DNA序列进行精细改造，在特定的位置敲除或者插入基因。在植物中，获得稳定的多突变体植株需要用转基因技术将Cas9及多个gRNA功能元件导入来发挥功能。因此，如何将多个gRNA元件（包含sgRNA）及Cas9序列整合在一个双元载体上，是植物中实现多基因同时敲除的关键。这里有个难点，如何保证串联在载体上的多个gRNA元件在体内表达的时候，能够被体内的系统进行正确的分解成单个的gRNA在生物体内，DNA分子上的tRNA基因经过转录生成tRNA前体，然后被精确加工成成熟的tRNA。所以我们利用这个体系，在体外设计tRNA+gRNA+tRNA的合成基因，这个基因一旦转化到植物体内，可以被体内的RNA内切酶识别，将合成基因的前体切成tRNA和gRNA。利用这个体系可以保证多个gRNA在大量表达的同时也能够正确的被分割。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种合成基因；第二目的在于提供所述的合成基因构建烟草多基因定点突变载体的方法；第三目的在于提供所述的合成基因的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述合成基因的序列是以tRNA + sgRNA +gRNA 的核苷酸序列顺序合成的一个或多个基因重复序列。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
A、通过合成基因构建CRISPR/Cas9载体：根据基因序列设计多个靶位点sgRNA1-n序列，合成Bsa I +（tRNA + sgRNA1-（n-1）+ gRNA）+tRNA + sgRNAn + Bsa I基因序列；
B、合成后的基因序列连接进无Bsa I酶切位点的pUC57-Kan大肠杆菌克隆载体上；
C、PCR扩增合成基因片段：根据合成基因插入pUC57-Kan大肠杆菌克隆载体位置，利用通用引物M13和高保真酶以pUC57-Kan质粒为模板扩增合成基因片段；
D、Bsa I酶切电泳切胶回收合成基因；
E、Bsa I酶切电泳切胶回收pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；
F、通过T4连接酶将合成基因与pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体连接起来。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的合成基因在构建烟草多基因定点突变载体并转化烟草植株同时获得多个目的基因定点突变中的应用。
本发明采用pORE-CRISPR/Cas9载体，利用化学合成一段靶位点基因序列，省却了大量的载体构建中间过程的同时还能少合成一个gRNA序列；不仅如此，为方便载体构建，在合成基因两端添加了Bsa I的酶切位点与载体连接接头；最终在构建载体的时候只需通过1次PCR、酶切、连接过程就能够简便的构建出所需多基因突变的植物表达载体；在保证突变效率的同时，大量简化了中间步骤，加快了实验进程。该构建载体的方法具有良好的应用推广前景。
附图说明
图1为Ntab1和Ntab2基因突变靶序列；
图2为pUC57-Kan和pORE-CRISPR/Cas9酶切图；
图3为Ntab1在sgRNA1后的突变；
图4为Ntab2在sgRNA2后的突变；
图5为Ntab3、4、5基因突变靶序列；
图6为PCR产物酶切图；
图7为Ntab3在sgRNA1后的突变；
图8为Ntab4在sgRNA2后的突变；
图9为Ntab5在sgRNA3后的突变；
图10为Ntab6、7基因突变靶序列；
图11 为PCR产物酶切图；
图12为Ntab6在sgRNA1后的突变；
图13为Ntab7在sgRNA2后的突变；
图14为pORE-CRISPR/Cas9表达载体示意图；
图15为pUC57-Kan质粒结构图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述合成基因的序列是以tRNA + sgRNA + gRNA 的核苷酸序列顺序合成的一个或多个基因重复序列。
所述合成基因的序列5’端与3’端需要加上限制性内切酶Bsa I的酶切位点：
5’… GGTCTCN▼ …3’
3’… CCAGAGN(N)4 ▲…5’ 。
所述合成基因的序列5’端与3’端在限制性内切酶Bsa I的酶切位点后需要加上与pORE-CRISPR/Cas9载体连接的接头（5’GATT和3’GTTTT），顺序如下：
5’-Bsa I (GGTCTCN▼)+GATT-3’+（tRNA + sgRNA1-（n-1）+ gRNA）+tRNA + sgRNAn +5’-▼GTTTT+Bsa I(GAGACC)-3’。
所述的合成基因连接进无限制性内切酶Bsa I酶切位点的克隆载体上。
本发明所述的合成基因构建烟草多基因定点突变载体的方法，包括以下步骤：
A、通过合成基因构建CRISPR/Cas9载体：根据基因序列设计多个靶位点sgRNA1-n序列，合成Bsa I +（tRNA + sgRNA1-（n-1）+ gRNA）+tRNA + sgRNAn + Bsa I基因序列；
B、合成后的基因序列连接进无Bsa I酶切位点的pUC57-Kan大肠杆菌克隆载体上；
C、PCR扩增合成基因片段：根据合成基因插入pUC57-Kan大肠杆菌克隆载体位置，利用通用引物M13和高保真酶以pUC57-Kan质粒为模板扩增合成基因片段；
D、Bsa I酶切电泳切胶回收合成基因；
E、Bsa I酶切电泳切胶回收pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；
F、通过T4连接酶将合成基因与pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体连接起来。
PCR扩增体系为50µl，其中包含10.0µl的5 X buffer （10 mM Tris-HCl，50 mMKCl，1.5 mM MgCl2，pH 8.3 @ 25℃。），4µl的 2.5 mM dNTPs（Takara Biotechnology Co.Ltd., Dalian, China），2µl 浓度10µM 的M13上下游引物，0.5µl的2000U/ml高保真DNA聚合酶（NEB），20-50ng模板pUC57-Kan质粒DNA，最后用ddH2O补齐50µl。
PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min，30个循环（95℃变性30ｓ，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5min，4℃保存。
本发明所述的合成基因构建烟草多基因定点突变载体的方法，具体操作如下：
1、多基因靶序列人工合成：
按照Bsa I +GATT+（tRNA + sgRNA1-（n-1）+ gRNA）+tRNA + sgRNAn +GTTTT+ Bsa I顺序设计好的基因序列交与公司进行化学合成，要求合成好的基因序列连接进pUC57-Kan大肠杆菌质粒。
2、多基因靶序列PCR扩增：
PCR扩增体系为50µl，其中包含10.0µl的5 X buffer （10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1.5 mM MgCl2，pH 8.3 @ 25℃。），4µl的 2.5 mM dNTPs（Takara Biotechnology Co.Ltd., Dalian, China），2µl 浓度10µM 的M13上下游引物，0.5µl的2000U/ml高保真DNA聚合酶（NEB），20-50ng模板pUC57-Kan质粒DNA，最后用ddH2O补齐50µl。
反应条件为：95℃预变性5min，30个循环（95℃变性30ｓ，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5min，4℃保存。
3、摇菌：
3.1、配制LB液体培养基（称取12.5g LB Broth于1L试剂瓶，加入500 ml蒸馏水，121℃高温高压灭菌20min）。
3.2、取3ml LB液体培养基于15ml离心管中，加入100mg/ml卡那霉素（Kanamycin）溶液3ul，加入含有合成多敲除基因的靶位点序列pUC57-Kan大肠杆菌菌液2-3ml。37℃、220rpm培养过夜。
4、质粒提取：（QIAGEN Plasmid Midi Kit）
4.1、根据提取质粒量的需求，准备相应数量的离心管置于冰上备用。
4.2、摇过夜培养的菌从培养管中倒入预冷的离心管中，13200rpm离心30-60s收集菌体，弃上清。
4.3、在含有菌体的离心管中加入250μl 的SolutionⅠ，盖紧管盖，置蜗旋振荡器上剧烈振荡至菌体全部悬浮；快速加入250μl SolutionⅡ，立即上下轻柔翻转混匀 4-8次，静置5min；再快速加入350μl Solution Ⅲ，立即上下轻柔翻转混匀5-6次，放冰上静置5min；13200rpm离心10min。
4.4、取质粒提取试剂盒离心柱、编号，将离心管中的上清移入离心柱中，13200rpm离心1min，弃废液。
4.5、在离心柱中加入500μl Washing bufferⅠ，13200rpm离心1min，弃废液；加入700µl Washing buffer Ⅱ，13200rpm离心1min，弃废液；空管13200rpm离心1min。
4.6、将离心柱套进新的离心管里，取50μl去离子水滴入离心柱中心，静置1min，12000rpm离心1min；然后将离心管中液体重新吸取出来滴入离心柱，静置1min，12000rpm再次离心1min；弃离心柱，留下含有液体离心管，标明日期与样品名称；-20℃冰箱储存备用。
5、质粒与PCR产物酶切：
酶切体系 20µl
质粒或多基因靶序列PCR产物 10µl
Bsa I酶 1µl
10×buffer 2µl
去离子水 7µl
37℃酶切4小时
6、酶切回收——得到目标片段（多基因敲除靶位点序列）
利用QIAquick Gel Extraction Kit回收试剂盒回收电泳后DNA片段。
6.1、制备琼脂糖凝胶，将水浴锅或金属浴温度设定为50℃。
6.2、加入20μl酶切产物至琼脂糖凝胶中的上样孔，220V 电泳25min，EB染色10min。
6.3、在紫外切胶仪中切取含有目标条带的胶块（切胶的位置要尽量贴近目标条带，每切一个胶条要流水冲洗刀片，避免交叉污染），切好的胶块装入离心管中，称重后记下胶块重量。
6.4、换算要加入的QG buffer的量，即：QG buffer μl＝胶重（g）ｘ3ｘ1000μl。
6.5、向离心管中加入QG buffer，置50℃水浴10min，每隔3min翻转2-3次。
6.6、再向离心管中加入相应体积异丙醇，即：异丙醇μl＝胶重（g）ｘ1000μl。
6.7、取Qiagen胶回收试剂盒，将上一步骤中溶液加入离心柱，13200rmp离心1min，弃废液。
6.8、向步骤4.7中的离心柱中加入500μl 的QG buffer，13200rmp离心1min，离心后弃废液，加入750μl PE buffer到离心柱上，13200rmp离心1min，离心后弃废液，空管再离心1 min。
6.9、将离心柱套入新离心管上，加50-100μl 去离子水（注意水要滴在离心柱中心，但枪尖不能碰触离心柱表面。），静置 1min，13200rmp离心1min；吸取离心管中的液体复滴于离心柱中，静置 1min，取新离心管套在离心柱上，13200rmp离心1min；离心后弃离心柱，（可在真空离心机上将体积浓缩为20μl）盖紧离心管，标明编号与日期，-20℃冰箱储存备用。
7、pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体酶切
含有pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体的大肠杆菌按照步骤3和4后，获得pORE-CRISPR/Cas9质粒，获得的空载体质粒按照下列酶切体系进行处理：
酶切体系 20µl
质粒 10µl
Bsa I酶 1µl
10×buffer 2µl
去离子水 7µl
37℃酶切4小时。
酶切后的载体按照步骤4的流程回收。
8、多基因敲除pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体连接
体系 10µl
空载体片段 2µl
靶位点片段 1µl
T4连接酶 1µl
10×buffer 1µl
去离子水 5µl
25℃连接1小时。
9、大肠杆菌转化
9.1、取大肠杆菌DH5α 感受态细胞于冰上解冻，解冻后取40µl于离心管，加入10µl连接产物，轻弹混匀，冰浴30min。
9.2、离心管放入42℃水浴锅热激30ｓ，然后冰浴2min。
9.3、吸取500µl SOC培养基（SOC medium）加入到离心管中，37℃、220rpm摇菌1h。
9.4、摇好的菌液1200rpm离心1min，弃200µl上清液，剩余菌液重悬后涂板（卡那霉素抗性，称取20g LB Broth Agar于试剂瓶，加入500ml去离子水，121℃高温高压灭菌20min。灭菌好后待冷却到50 ℃左右，加入Kana母液各500µl，混匀，倒入多个培养皿平板后待用）。
9.5把涂好的板放入37℃温箱培养过夜。
10、阳性菌落筛选
PCR体系：
体系 10µl
引物JC-F 0.3µl
反向引物sgRNA 0.3µl
Mix 5µl
去离子水 4.4µl
选用pORE-CRISPR/Cas9载体上距离Bsa I酶切位点上游的一段序列作为上游引物：5'-TTAGGTTTACCCGCCAATA-3'，与sgRNAn基因靶位点引物DNA的反向引物配合PCR检测阳性菌落。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送测序验证。
11、pORE-CRISPR/Cas9表达载体的农杆菌转化及烟草的遗传转化
11.1、挑取测序正确的菌落，进行小摇(5 mL)扩繁培养。提取质粒后转化农杆菌LBA4404。
11.2、菌株在含卡那霉素抗性的LB培养基平板上进行筛选培养，按照步骤8.中的方法筛选阳性农杆菌斑进行测序。
11.3、挑取测序正确的农杆菌斑进行大摇(500 mL)扩繁培养，离心收集菌体，用MS液体培养液重悬菌体，测量菌液的OD值达到0.5后，浸染烟草叶盘8-10 min。
11.4、侵染后的叶盘在25℃、黑暗条件共培养2天，被侵染的烟草叶盘转移至含有NAA、6-BA和卡那霉素(50 mg/L)以及头孢噻肟钠(500 mg/L)的MS固体培养基中进行筛选，最终获得含抗性基因的阳性烟草小苗。
本发明所述的合成基因的应用为所述的合成基因在构建烟草多基因定点突变载体并转化烟草植株同时获得多个目的基因定点突变中的应用。
实施例1
针对Ntab1和Ntab2基因设计了2条sgRNA序列，sgRNA1：agcactaggagggaaaagaa；sgRNA2：gggatctcacagacaatgat。然后按照图1所示合成突变这2个基因的靶位点基因序列。通过提取扩繁后pUC57-Kan大肠杆菌质粒（质粒中含多基因敲除靶位点序列），如图2所示，经Bsa I酶切后，白色箭头标记的DNA条带显示的是合成基因的条带。切胶回收合成基因后，用T4连接酶将BsaI酶切后的pORE-CRISPR/Cas9（图2黑色箭头标记的位置）植物表达载体连接起来，连接产物转化大肠杆菌，通过筛选测序验证后，获得敲除多基因CRISPR/Cas9载体。构建好的载体转化烟草，通过测序检测Ntab1和Ntab2基因（如图3、4）在靶位点处出现双峰。说明突变这2个基因获得成功。
实施例2
针对Ntab3、4、5基因设计了2条sgRNA序列，sgRNA1：agtgtttggaaaaccctagg；sgRNA2：tggagtgtttggaaaaccct：sgRNA3：gcacttgaaaccctagccct。然后按照图5所示合成突变这2个基因的靶位点基因序列。以M13为引物，以含有合成基因的pUC57-Kan质粒为模板在高保真DNA聚合酶的作用下PCR扩增合成基因片段（图6左边箭头）。扩增的基因片段利用Bsa I酶切后，经电泳（图6右边箭头）、切胶后回收即为带接头的合成基因序列。然后将pORE-CRISPR/Cas9载体同样进行Bsa I酶切（如图2黑色箭头），经过电泳、切胶回收后得到线性化的粘性末端。利用T4连接酶将合成基因序列和线性化的载体连接起来就构成了敲除这2个基因的敲除载体。载体转化农杆菌后，再转化烟草。通过测序检测这3个基因在靶位点处出现双峰（如图7、8、9）。说明突变这2个基因获得成功。
实施例3
针对Ntab6、7基因设计了2条sgRNA序列，sgRNA1：aacattaggaggaaaacgca；sgRNA2：gacattaggaggaaaacgca。然后按照图10所示合成突变这2个基因的靶位点基因序列。以M13为引物，以含有合成基因的pUC57-Kan质粒为模板在高保真DNA聚合酶的作用下PCR扩增合成基因片段（图11左边箭头）。扩增的基因片段利用Bsa I酶切后，经电泳、切胶后回收即为带接头的合成基因序列（图11右边箭头）。然后将pORE-CRISPR/Cas9载体同样进行Bsa I酶切（如图2.黑色箭头），经过电泳、切胶回收后得到线性化的粘性末端。利用T4连接酶将合成基因序列和线性化的载体连接起来就构成了敲除这2个基因的敲除载体。载体转化农杆菌后，再转化烟草。通过测序检测这2个基因在靶位点处出现双峰（图12、13）。说明突变这2个基因获得成功。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种合成基因及其构建烟草多基因定点突变载体的方法与应用
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<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> Ntab1和Ntab2基因突变靶序列
<400> 1
atggacagcg ttccatatta caagatccct cgcatgtcca agcttcgtaa gcggccccct 60
gcccaagacg tgagtgagga gtatatagcc aagtaccagt tagccactag taaaatgagg 120
gaattagaca aagacccatt tgatcctctt ggcttcaagc aacaagctaa tatccattgt 180
gcttattgca acgatgctta cacaatgggt gaccaaaagt tacaagttca ccaatcgtgg 240
cttttcttcc cgtttcatag atggtacttg tacttctacg agagaatctt gggctccctc 300
atcgatgatc caacttttgc tctgccatat tggaactggg accatccaag cggcatgcgt 360
ttgcctgcta tgttcgatgt cgaaggttct tccctctacg atgcaagacg taatccacat 420
gtccgtaatg gaaccataat cgatcttggt tttttcggtg atgaagtcaa aactaatgaa 480
atacagatga taactaacaa cttaattcta atgtatcgtc aaatgataac taatgctcca 540
tgcccgctgt tgttcttcgg agagccttac agattcggat ctaaacccaa tccggggcag 600
ggaaccattg aaaacattcc tcatactccg gttcacattt ggactggtac tgtgcggtgt 660
acggatttgg gtaattgtgt gccatcatac ggtgaggata tgggtaattt ctactcagct 720
ggtttagacc cagtttttta cagccaccac gccaatgtgg accgcatgtg gaatgaatgg 780
aaagcactag gagggaaaag aagggatctc acagacaatg attggttaaa ctcggagttc 840
tttttctacg atgaaaaccg cgacccatgg cgtgtgaaag tccgagactg tttggacagc 900
aagaagatgg ggtatgatta cgaaccgaaa gccacaccat ggcgtaactt taagccaggg 960
aaaaagacca caccgggcaa ggtgaatcta cgttcagtta agccagccag caaggtattc 1020
ccactctcaa atctggacag agcaatttgc tttagcatag agaggccagc tacatcaagg 1080
agtcagcagg agaaagatga atttgaggag gtgctaacat tcaagaattt aaagtatgat 1140
gatagcaagt atataaagtt tgatgtgttc gtcaatgcag acaagactgt gaatgcagat 1200
gacattgaca agaaagaata tgcagggagc tataccagct tgccacatgt tcatggacct 1260
aatagtggca atcatgcggt tgaagtacaa gaattcaagc tagccatcac tgaactgcta 1320
gaggactgtg gtttggaaga tgaagacatt attgcggtaa ctgtggttcc aaagacgggg 1380
ggcgaagtgg tcagcatcaa cagtgtgttg attgaactta aggattgtta ttaa 1434
<210> 2
<211> 1788
<212> DNA
<213> Ntab1在sgRNA1后的突变
<400> 2
atggcttctt cttctactct acctttatgc accagcaaaa ctcccttttc ttcctccgcc 60
gccaaatatt tatttgcaaa accctctcag cttttcctca atggaaaacg taaccaaagt 120
ttcaaggttt catgcacggg cgagcatgat ggaaaccttg acgcaattaa agaaggagtt 180
gttgaccgaa ggattgtcct tttgggttta ggagggctgt atggcgcagc taatcttgtg 240
ccattagcct ctgctgctcc cgtaccaccc cccaatctaa actcatgtgg aacggccacg 300
ataacggatg gtccagctgt accatatagt tgttgccccc ctaaaccgga tgatatggac 360
agcgttccat attacaagat ccctcgcatg tccaagcttc gtaagcggcc cgctgcccaa 420
aacgtgactg aggagtatat agccaagtac cagttagcca ctagtaaaat gaaggaatta 480
gacaaagacc aacttgatcc tcttggcttc aagcaacaag ctaatatcca ttgtgcttat 540
tgcaacgatg cttacacaat gggtgacaaa aagttgcaag ttcacgaatc gtggcttttc 600
ttcccatttc atagatggta cttgtatttt tacgagagaa tcgtaggctc cctcatcgat 660
gatccaactt ttgctctgcc atattggaac tgggacaatc caagcggcat gcgtttgcct 720
tatatgttcg atgtcgaagg ttcttccttg tacgatgcaa gacgtaatcc acatgtccgt 780
aatggaacca taatcgatct tggttttttc ggtgatgaag tcaaaactaa tgaactacag 840
atgataacta acaacttaat tctaatgtat cgtcaaatga taactaacgc tccatgcccg 900
ctgttgttct tcggagagcc ttatagattc ggatctaatc ccgaacctgg gatgggaacc 960
attgaaaaca tccctcacaa tccggtccac atttggactg gtactgtgcg ggggacggat 1020
ttgggtaatg gtgcgaaatc atacggtgag gatatgggta atttctactc aactgcttta 1080
gacccagttt ttttctgcca ccacgccaat gtggaccgct tgtggaatga atggaaagca 1140
ctaggaggga aaagaaggga tctaagagac aaagattggt taaactcgga gttctttttc 1200
tacgatgaaa accgcgaccc atggcgtgtg aaagtccgag actgtttgga cagtaagaag 1260
atggggtatg attacgaacc gacagccaca ccatggcgta attttaagcc agggaaaaag 1320
agcacagcgg gcaaggtgaa tccaagttca gttaagccag ccagcaaggt attcccactc 1380
tcaaatctgg acagagccat ttgctttagt atagagaggc cagctacatc aaggagtcag 1440
caggagaaag atgaattcga ggagatccta acattcaagg gtgtaaagta tgatgatagc 1500
aagtatataa ggtttgatgt gttcctcaat gcagacaaga ctgtgaatgc agatgacatt 1560
aacaagagag agtatgcagg gagctatacc agcttgccac atgttcatgg acctaataat 1620
gccactcatg agtttaaacc aaaagaattc aatctagcca tcactgaact gcttgaggac 1680
tgtggtttgg aagatgaaga cattattgcg gtaactgtgg ttccaaagaa ggggggcgaa 1740
gtagtcagca tccacagtgt ggagattgta cttaaggatt gttactaa 1788
<210> 3
<211> 2267
<212> DNA
<213> Ntab2在sgRNA2后的突变
<400> 3
atggcttctc ttccactccc caccaccaat gccatctctt cttcgtcttc ggcctcttca 60
actaccacaa cttttcccaa tttgcattct tcttctttct ttacaaagac atcaaaagtt 120
tccactataa gaaagtacgg taaccgtagt ttccaagtct catgcaaggg ttcagaagat 180
gatcaaacca tttataacac ttccaaaaat tctgattctt caaacaataa gatcattgat 240
agaagaaaca tactacttgg actaggaggt ctttatggtg ctgctactat tgttggtggt 300
cattcctttg ccttcgccgc tcctgtgaac ggacctgacg tttccaaatg tggccctgca 360
gatctaccac caggtactgt tacgtggtct gtaatatata tgaagtgaga atatctcacg 420
tcgaaacaca aatatgaatt tgaaggctct tcatatatta gtaaaatact tgctattttg 480
atttttattt aaaatttgaa tttagatctg aattttaaag ttaaatgaat atgacatgtt 540
ggaatatata gccagtgcta gctacagagg aagttaaatg aatatgcatg ttcattaaat 600
aagagataaa cgatcatttt gaatagtcca aaactgatct atgaattcag gccttttatg 660
agaagtggtt aagttaattt gtaacttagt attctgataa aacttgtcta tattttccaa 720
ataatatacg ggcaatatac attaaaaagt tactttcacg cctcaaagcc tttttttcaa 780
atttgtctaa tttctttttt tctgtaacag gtgcagcacc agtcaactgt tgtcctccga 840
caacggcaaa catcatcgac ttccaacttc ctccaccatc aaccacactc cgcactcggc 900
cagcagctca tgccgccgat agtgcctata tagagaaatt caacagagct attcagctca 960
tgaaacaact tccagatgac gatccacgta gcttcaagca acaagcaaat gttcattgtg 1020
cttattgtga tggtgcttat gaccaactcg gttttccgaa ctctgagctc caagttcatt 1080
tctcttggct tttccttcct ttccaccgtt gttatctcta ctttttcgaa aaaaacttgg 1140
gaagtttaat aaatgaccct actttcgcta tcccattttg gaactgggat catcctgatg 1200
gcatgagact tcctgccatg tatacgaacc gtagttcttc tctcttcgat cctctccgtg 1260
atcggaggca tcagcctccg gtcatggttg atctcgactt caatggaacg gatcctaaca 1320
taagtaacgc tcaacaaact tcccaaaatc tcactatcat gtataggcaa atggtttctc 1380
ttggaagtac tccgacgact ttcctcggag acccttaccg ggccggtggt gaacccggtg 1440
gagctgggtc cctcgagaac attcctcacg gaccggtcca tgtttggacc ggtgatagaa 1500
cccaacctaa ttttgaaaac atgggagatt tttattcagc tgctagagac cctattttct 1560
atgctcatca ttctaatatt gatagattgt ggagtgtttg gaaaacccta ggaggtagac 1620
gtcaagattt cactgaccct gatttcttaa atgcttcatt tttgttttat gatgagaaag 1680
ctcaaatggt acgtattagg gtacgtgact gtttggatac aacgagactt ggatatgctt 1740
atcaaaatgt agctaatccg tggataaatt ctcgtccaag ggctagggtt tcaagtgctt 1800
tgagtagtgt aaggaggctt gttgaagcaa gagcagctga taattttcct agtgcaaaag 1860
atgttttccc aacgaaactt gaccatgtga taagagttat ggtaaaaagg ccaaataaga 1920
agaagagaaa caagaaggag aaagatgcaa aagaggagat tttagtggtt gaagggatag 1980
agctggaaac tgatgttttt gtcaagtttg atgtattgat taatgatgaa gatgagactg 2040
tgatttcgcc gaataatgct gagtttgcag gtagttttgt taacgtgcca catcatagtc 2100
atggtaagag tggcaagaaa cgtaagacta agctaaaatt ggctataact gaattattgg 2160
aggatttgga tgctgaggat gatgatcatg tgttggtgac ttttgttccc aagaatggtt 2220
ctggtgctgt gaaaattgga ggagtcaaga ttgtgcttga ggattga 2267
<210> 4
<211> 2109
<212> DNA
<213> Ntab3、4、5基因突变靶序列
<400> 4
atggcttctc ttccactccc caccaccaac gccatctctt cttcatcttc ctcttcaact 60
acttcaactc tttccaattt gcattcttct actttcttta cgaagacatc aaaagtttcc 120
actttaagaa agtacggtaa ccatagtttc caagtctcat gcaagggtac agaagatgac 180
caaactatta acacttccaa atcttctgat tcttcaaaca ataagatcat tgatagaaga 240
aacatgctac ttggattagg aggcatttat ggtgctgcta ctcttgttgg tggtcatccc 300
tttgccttcg cggctcctgt gcccggacct gacgtttcca aatgtggcgc tgcagatttg 360
ccaccaggta ctgttacata gtctgtaata tatatgaact atgaagtcat gagcttgtct 420
tacgttgaaa cacaaaaatg gtttgcttga aagctttata aataaaaaaa tcttgataca 480
ttaaactgat aaatccaggc cttctatgat aaatggttag gttaatatgt ataatatatt 540
gtacttttat tgtattctga taaaagttgt ctatatgttt ccaaataata tggagttgtt 600
tttacgcttc aaagcctttt gtctcaaatt tgtctaattt ctatttttgt cacaggtgca 660
gcaccagtca actgttgtcc tccgacaacg gcgaacatca tcgacttcca acttccacca 720
ccgtcagcca ccctccgtac acggccagca gctcattccg ccgatagtgc ctatatagag 780
aaattcaaca gagctattca gctcatgaaa caacttccag acgatgatcc acgtagcttc 840
aggcaacaag caaatgttca ttgtgcttac tgtgacggtg cctatgacca actaggtttc 900
ccaaactctg aactccaagt tcatttctct tggcttttcc tcccttttca tcgttgttat 960
ctctacttct tcgaaaaaat cttgggaagt ttgataaatg accctacttt cgttatccca 1020
ttttggaact gggatcatcc tgatggcatg agacttcctg ccatgtatgc gaaccgtagt 1080
tcttctctct ttgatcctct ccgtgatcgg aggcatcagc ctccggtcat ggtcgatctc 1140
gacttcaatg gaacggatcc taacataagt aacgctcaac aaacttccca aaatctcact 1200
atcatgtata ggcaaatggt ttcactagga agtactccag cgactttcct cggagaccct 1260
taccgtgccg gtggcgaacc gggtggtgct gggtccctcg agaacattcc acatggaccg 1320
gtccatgttt ggaccggtga tagaacccaa cctaattttg agaacatggg agatttttat 1380
tcagctgcta gagaccctat tttctatgct catcattcta atattgatag attgtggagt 1440
gtttggaaaa ccctaggtgg aagacgtcaa gattttactg accctgattt cttaaatgct 1500
tcgtttttgt tttatgatga gaaagcacaa atggtacgta ttagggtacg tgactgtttg 1560
gatacaacaa gacttggata cgtttatcaa ggtgtagcta atccgtggat aaattctcgt 1620
ccaagggcta gggtttcaag tgctttgagt agtgtaagga ggcttgttga agcaagagca 1680
gctgataatt ttccaagtgc aaaagatgtt ttcccaacga aacttgacca tgtgataaga 1740
gttatggtaa agaggccaat taagaagaga aacaagaagg agaaagatgc aaaagaggag 1800
tttttagtag ttgaagggat agagctggaa actgatgttt ttgtcaagtt tgatgtgttg 1860
attaatgatg aagatgagac tgtaatttcg ccgaataatg ctgagtttgc aggtagtttt 1920
gttaacgtgc cacatcatag tcatggtaag agtgacaaga aacgtaaaac taagttgaag 1980
ttggctataa ctgagctgtt ggaagattta gatgctgagg atgatgatca tgtggtggtg 2040
acttttgttc caaagaatgg ttctggtgct gtaaaaattg gaggtgtcaa gattgtgctt 2100
gaggattga 2109
<210> 5
<211> 4496
<212> DNA
<213> Ntab3在sgRNA1后的突变
<400> 5
atgctacttg gattaggagg catttatggt gctgctactc ttgttggtgg tcatcccttt 60
gccttcgcgg ctcctgtgcc cggacctgac gtttccaaat gtggtcctgc agatttgcca 120
ccaggtattg ttagatagtt tttttttttt tgtgtgtgtg tatatattta gtactcgaat 180
attacaaata atttaaattg agctttgcga aaactaaaaa tatttgtaat tttgctttga 240
aagatagtcg aagcatataa gttttaaagc tccaatacta aggtactttt cgatatttaa 300
tttttcaaaa gctaaaccat aagtcatatc aaaacaaaac ctctaaagtg aacacaaaaa 360
gataatagcc acgacaacat aacaatagaa aggctaaagt aacagtgtcg tcgaacctgt 420
tcatgctttc gggaaaatag aattgactaa taatttgatt acaataaaaa ttaaatatat 480
ttaggccata aatctaagat ataataattt tatcaccttt ctgtgtgact gaagctgacg 540
cacacctcgt ttaattttac taatcaattc cgatgggtaa atagcaccat gagccttact 600
ttcaaccaaa tactactata aattcttgtg tttttatcat atatcaaact tttgacaaat 660
attatcaatc tttttattta atgttaactt gcattacatc cttgtaagaa tagtaaatat 720
ataaaaatca ttatgagcga taaaattttt gtatacagat gtctttgtaa ttctcttaga 780
gagaagggac atgtacgccg aataactctg ttaattttca tagaaggacc aatataactc 840
aatatactat atattctaat atactataga aagagcgttg aacgactata tatccaatat 900
caatttctga ggctacaatg aaaatctaat atagtttaaa cttcatatca ctaaattata 960
tataagcaac atttatagat attgttgtcg aatgcttgtt ttggaggaag agaagtacca 1020
ggaagttgaa cttctatgca ataccaaaat ccaagtttat aataagaatc taatatgttc 1080
taaactccat aacactaaac tatatgtaaa caacatttat agatattgtt gttcaaggcg 1140
tgacctcatc tgctaaaagt gaaacggtat ttttcgtaga gctgcaacta aattaaactc 1200
taatagtgtt gatgaactga aactttaaaa tttggtttga aacgctgttg ttttcgagaa 1260
acgtgaaatg gtgcttttag tccttcatag cttaattgtc agaatttagt ataattgagt 1320
atcctattaa aatgagagga gaaaactcaa aactgagaaa ttaaataaat catacaaaga 1380
caatcacaat gttcatcaca cttcacttaa tatgtctaca ttccaagtag tgattaggta 1440
taaaattatc tttgttatca attttttttg atttcaccca aacaactttt ttagacacgt 1500
atattttcta ccatctctct ttttaataat tatttatagt tttttaaagg gagaaaatac 1560
tattaaaaaa agttcatttt cttattttaa aaataggtga gttacttgaa cttgttttat 1620
atttaaatac aatattagct tcaatagata aatttcaaat gggagctaac atatagaaag 1680
gagagagcct catgacacca atttcagcca ctaatttcaa ttaacgaatg actaatttca 1740
attatgaaat aatctcaacc gaggaaatca atattgccgc tcatgaatag tttaaattag 1800
cactattagg agtctactca aacatcattt gtgaatatct ctctatttaa atctcaagtt 1860
ctgaacacta cactattcca aataaatatg cacattcttt tgtatacatc cagtgcatct 1920
ccatcactaa agatcttaac gaaaacttac ctctttccaa gatgatgtta ccttcctcat 1980
aataacatat gttgcatgat tcaaatgatt atttgaaact cagcaaagaa aaaaaatctt 2040
aacaaataaa aatatcatca tttttaagaa aagtgaagat gccaatataa acctggccaa 2100
ttggaaaatg taaaatttac acttgactaa cgtccgcgca taagagaaag cctttctaga 2160
tcaaaactac aacatcaagg atctctctgt ccttgcgcca aatttcaggc ttcaaatctt 2220
ttcttctgaa cctgaaaaca accaagttta tgcaggatat ttgtgaaatc ggtacaacta 2280
caattgctat attaacaaaa aatctcaaaa atacttatat tttctagata tcagatagag 2340
agaaacaaaa tatgtagaaa tcaagatgtg gactggaaat atgcaaaaca ataatctaca 2400
taaggttgaa attcaaacgc cgacatccat tcaaatggga taagtaagta aaggagtaaa 2460
aaaaaatgca tgtttgaacg aaggtaggag aacaaacttt ttaaaaaggg gagaggatgc 2520
atccactcaa tagagatgga caaaatgttt gaaagatgac caatgaattt taaagtcaaa 2580
tatgaaaaac tttttctgtt acgtaccatt tgctatataa ttgctacggg tcttttaaaa 2640
tgtggtcatt gggttggtta tcagttgtaa tggcttttgg aattcatttt caagagacat 2700
gacttttgga atcctacatt attaaaaaaa aaaaatttaa aaaaaaagaa tgggtgggag 2760
aaataagaaa aaatgtaatc tgaattttaa aattaaatta atgaatatgc atgttcgtta 2820
agtaagggat aaaaattttg aatagtccaa aaattatcta tgaattcagt ccttctatat 2880
gagaagtggt taagttaatt aatttgcaac atatcgtgcc taatttattg tcttctgata 2940
aaacttagct tgtccatatt tttcctaata atatacgggc aatatacttt aaaaaagtta 3000
cttgcacgcc tcaaagcctt ttttttcttc attgtctaat tacagtaatt tatatttttg 3060
taacaggtgc agcaccagtc aactgttgtc ctccgacaac ggcgaacatc atcgacttcc 3120
aacttccacc accgtcaacc accctccgta cacggccagc agctcattcc gccgatagtg 3180
cctatataga gaaattcaac agagctattc agctcatgaa acaacttcca gataacgatc 3240
cacgtagctt caagcaacaa gcaaatgttc attgtgctta ctgtgatgga gcttatgaac 3300
aactaggttt cccaagttct gaactccaag ttcattcctc ttggcttttc ttccctttcc 3360
atcgttgtta tctctacttc ttcgaaaaaa tcttgggaag tttaataaat gaccctactt 3420
tcgctatccc attttggaac tgggatcatc ctgatggcat gagacttccg gccatgtatg 3480
cgaaccgtag ttcttctctc ttcgatcctc tccgtgatca gaagcatcag cctccggtca 3540
ttgttgatct cgacttcaat ggagcggatc ctaacataag taacgctcaa caaacttccc 3600
agaatctgac aatcatgtat aggcaaatgg tctctctagg aagtactccg gcagctttcc 3660
tcggagaccc ttaccgtgcc ggtggcgaac cgggtggtgc tgggtccctc gagaacattc 3720
cacatggaac ggtccatgtt tggaccggtg atagaaccca acctaatttt gaaaatatgg 3780
gagtttttta tgcagctggt agagacccta ttttctatgc tcatcattct aatattgata 3840
gattgtggag tgtttggaaa accctaggtg gaagacgtca agattttact gaccctgatt 3900
ttttaaattc ttcgtttttg ttttacgatg agaaagcaca aatggtacgt attagggtac 3960
gtgactgttt ggatacaaca agacttggat acgtttatca aggtgtagtt aatccgtgga 4020
taaattctcg tccaagggct agggtttcaa gtgctttgag tagcgtaagg aggcttgctg 4080
aagcaaaaga ttatttccca acaaaacttg accatgtgat aagagtaatg gtgaaaaggc 4140
caaataataa aaagagaaac aaggaggaga aagatgcaaa agaggagttt ttagtggttg 4200
aagggataga gctggaaact gatgtttttg tcaagtttga tgtgttgatt aatgatgaag 4260
atgagactgt aatttcgccg aataatgctg agtttgcagg tagttttgtg aacgtgccac 4320
atcttagtca tggtaagagt gacgagaaac gtaagactaa gttgaagttg gctataactg 4380
agctgctgga agatttagat gctgaggatg atgatcatgt ggtggtgact tttgttccaa 4440
agaatggttc tggtgctgtg aaaattggag gtgtcaagat tgtgcttgag gattga 4496
<210> 6
<211> 2044
<212> DNA
<213> Ntab4在sgRNA2后的突变
<400> 6
atggcatcaa gtgttatttc accagtgtgc aatagcacac cactcaaaac accctttaca 60
tcaaccacca agtcttcttc tttagcatcc actccaaaac cctctcaact tttcctccgc 120
ggaaaacgta accatagctt caaagtctca tgcaaggtct ccaatggtga tgaaaacaaa 180
actgttgaag caaattctgt tgataggaga aatgttcttc taggtttagg aggtctctat 240
ggtgcttcta atgttgtacc attggcttca gccactccca ttccagcccc tactacttca 300
tgtagcaaga ctggcgccac aattaaaccc ggtgtaccag taccttattc ttgttgcccc 360
cctccgctaa aaattgatcc taaggatatt ccttattaca agtttccaac agggtccaag 420
ctccgtattc ggccagcttc tcatgccgtg gatgaagagt acatggctaa gtacaactta 480
gccattacta aaatgaagga gctcgacgtc accgatccag atgatccacg tggattcacg 540
gcgcaagcca aaatccactg tgcttattgc aatggtgcat acaccgtcgc tggcaaagag 600
ctacaaattc acttctcatg gctttttttc ccattccata gatggtattt gtacttctat 660
gaaagaatct tgggctcttt aatcaatgat cctacttttg gtttgccata ttggaactgg 720
gatcatccaa agggcatgcg tttgccacac atgtttgatc aaccaaacgt gtaccctgat 780
ctttacgatc caagacgtaa ccaagagcac cgtggttctg taatcatgga ccttggtcat 840
tttggtcaag acgtgaaagg aactgacttg caaatgatga gcaataacct tactctaatg 900
tatcgtcaaa tgattaccaa ttcaccatgt ccacaactct ttttcggtaa gccatattgt 960
acggaagttg gacccaaacc agggcaggga gctattgaaa acatccctca tactcctgtc 1020
cacatttggg ttggtagtaa gcctaatgag aataactgta aaaacggtga agatatggga 1080
aatttctatt cagctggtaa ggatcctgct ttctatagtc accatgcaaa tgtagatcgc 1140
atgtggacaa tatggaaaac attaggagga aaacgcaagg acatcaacaa gccagattat 1200
ttgaacactg agttcttttt ctacgacgag aagaaaaacc cttatctcgt caaagtccgt 1260
gactgtttgg acaataagaa aatgggatat gatttccaag caatgccaac cccatggcgt 1320
aattttaagc cattgaagaa gagcaagagc aaggtcaatg cacgttcggt tcagtcagct 1380
acccaaacat tccctattgc aaagattgac aaacccataa cattttctat caaaagggaa 1440
acttcaggta ctttcaactg ttatttaaaa gtttaaacgg ttagaaataa cacattttta 1500
attactaaac ttaattagat ctatcaggta gttggataaa aataaagttt ttgtttttcg 1560
tgtgacggtg aaatttaaaa acatgacctc atttcaatcg ctcatgccat gttaacttgc 1620
tagagagagc atatttttaa tttgttagag tacactttca attatttaat tatattacgt 1680
cttaacaggc aggactcagc aggagaaaga cgcaaaagag gagatgttaa ctttcttgga 1740
actcaacatt gatcagcgaa agcacataag gtttgatgtc ttcattaacg cagatgcaaa 1800
ctccaactgg catgagctag acagggcaga gtttgcagga agttacactg ccttgcctca 1860
tgttcattca gatcccagta aaccacatgt cgcccctgtt gcaaaattcc agctggccat 1920
taccgagttg ctcgaggaaa ttggccttga agatgaagat gatatagtgg tgactctggt 1980
cccgaaaact gggggcgaat ttgtcgccat taaatctgtg gttattacac ttgaagcttg 2040
ttga 2044
<210> 7
<211> 2036
<212> DNA
<213> Ntab5在sgRNA3后的突变
<400> 7
atggcgtcaa gtgttattcc accagtgtgc aatagcacaa cagtcaaaac tccctttact 60
tcaaccacca agtcttcttc tttagcttcc actccaaaac cctctcaact tttcctccgt 120
ggaaaacgta accacagctt caaagtctca tgcaaggtct ccaatggtga tgaaaaccaa 180
agtgttgaaa caaataattc tgttgatagg agaaatgtgc ttctaggttt aggaggtcta 240
tatggtgctg ctaatgttgt accattggct tcagccactc ccattccagc ccctactact 300
tcatgtagca agactggtgc cacaattaaa cccggtttac cagtacctta ttcttgttgt 360
ccccctccgc taaaaattga tcctaaggat attcctcatt acacgtttcc aacaggatcg 420
aagctccgta ttcgaccagc ttctcatgcc gtggatgaag agtacatggc taagtacaac 480
ttagccatta ctaaaatgaa ggagctcgac gtcactgatc cagatgatcc acgtgggttc 540
gcggcgcaag ccaaaatcca ctgtgcttat tgcaacggtg catacaccgt tgctggcaaa 600
gagctacaaa ttcacttctc gtggcttttt ttcccattcc atagatggta cttgtacttc 660
tatgagagaa tcttgggttc tttaatcaat gatcctactt ttggtttgcc atattggaac 720
tgggatcatc caaagggcat gcgtttgcca cacatgtttg atcaaccaaa tgtgtaccct 780
gatctttacg atccaagacg taaccaagag caccgtggtt cggtaatcat ggaccttggt 840
cattttggtc aagacgtgaa aggaactgac ttacaaatga tgagaaataa ccttactcta 900
atgtatcgtc aaatgattac caattcaccg tgtccacaac tgttttttgg taagccatat 960
tgtacggaag ttggacccaa accagggcag ggagctattg aaaacatccc tcatactcct 1020
gtccacattt gggttggtag taagcctaat gagaataact gtaaaaacgg tgaagatatg 1080
ggaaatttct attcagctgg taaggatcct gctttctata gtcaccatgc aaatgtagat 1140
cgcatgtgga caatatggaa gacattagga ggaaaacgca aggacatcaa caagccagat 1200
tatttgaaca gtgagttctt cttctacgac gaaaagaaaa acccttttct cgtgaaagtc 1260
cgtgactgtt tggacaataa gaaaatggga tatgatttcc aagcaatgcc aaccccatgg 1320
cgcaatttta agccattgaa gaagagcaag agcaaggtca atgcacgttc agttcctcca 1380
gttacccaaa cattccctat tgcaaagatt gacaaagcca taacattttc catcaaaagg 1440
gaaacttcag gtactttcaa gtcatgttat ttaaaagttt aaactgttag aaataacaca 1500
cttttaatta ctaaacttaa ttagatcata taggtggata aaaataaagt ttttgcggtt 1560
agatttaaac ccatgacctc ttttgaatct ctcgtgccat tgttaagttg ctagagagca 1620
catattttta atttgttaga gtacaccttc aattatttaa ttatattatg tctttaacag 1680
gccggactca gcaggagaaa gacgcagaag aggagatgtt aactttcttg gaactgaaca 1740
tcgatcagcg aaagcacata aggtttgatg tgttcattaa cgcagatgca aactccaact 1800
ggtatgagct agacagggca gagtttgcag gaagttacac tgccttgcct catgttcatt 1860
cagatcccac taaaccacat gtcgccccta ttgcaaaatt ccagctggcc attaccgagt 1920
tgctcgagga aattggcctt gaagatgaag atgatatagt ggtgactctg gtcccgaaaa 1980
ctgggggcga atttgtcgcc attaaatctg ctgtgattac acttgaagct tgttga 2036
<210> 8
<211> 950
<212> DNA
<213> Ntab6、7基因突变靶序列
<400> 8
taatatttgt caggtgcagc accagtcact gttgtcctcc gacaacggcg aacatcatcg 60
acttccaact tccaccaccg tcagccaccc tccgtacacg gccagcagct cattccgccg 120
atagtgccta tatagagaaa ttcaacagag ctattcagct catgaaacaa cttccagacg 180
atgatccacg tagcttcagg caacaagcaa atgttcattg tgcttactgt gacggtgcct 240
atgaccaact aggtttccca aactctgaac tccaagttca tttctcttgg cttttcctcc 300
cttttcatcg ttgttatctc tacttcttcg aaaaaatctt gggaagtttg ataaatgacc 360
ctactttcgt tatcccattt tggaactggg atcatcctga tggcatgaga cttcctgcca 420
tgtatgcgaa ccgtagttct tctctctttg atcctctccg tgatcggagg catcagcctc 480
cggtcatggt cgatctcgac ttcaatggaa cggatcctaa cataagtaac gctcaacaaa 540
cttcccaaaa tctcactatc atgtataggc aaatggtttc actaggaagt actccagcga 600
ctttcctcgg agacccttac cgtgccggtg gcgaaccggg tggtgctggg tccctcgaga 660
acattccaca tggaccggtc catgtttgga ccggtgatag aacccaacct aattttgaga 720
acatgggaga tttttattca gctgctagag accctatttt ctatgctcat cattctaata 780
ttgatagatt gtggagtgtt tggaacacac gaggaggacg acgacattat actgatgatg 840
ctgacttctt agctgcttct tttttgtatt atgagaaaaa agaactgatg gtacgtatta 900
gggtacatgt gtgttgggtt acgaaagacg cgtgtacatt tatcagcatg 950
<210> 9
<211> 431
<212> DNA
<213> Ntab6在sgRNA1后的突变
<400> 9
tcgtgccggt ggcgaaccgg gtggtgctgg gtccctcgag aacattccac atggaacggt 60
ccatgtttgg accggtgata gaacccaacc taattttgaa aatatgggag ttttttatgc 120
agctggtaga gaccctattt tctatgctca tcattctaat attgatagat tgtggagtgt 180
ttggaaaacc ctgtgggaaa cacctcgata tttttgagcc cgagttttta aattctcctc 240
ttttgtgttt taataagaaa aagcacatgg gacacataat aggacacgag tgtgtgtata 300
caccacaaca tgtgtacact tatatcgggg tgtataatcc ccggatatat tctctccccc 360
agggttcggg tgctttgagc tttgaataga ggattgatga ttgctgaaat taaatcccat 420
catcccaaca a 431
<210> 10
<211> 950
<212> DNA
<213> Ntab7在sgRNA2后的突变
<400> 10
tcggcagctt ctcatgccgt ggatgaagag tacatggcta agtacaactt agccattact 60
aaaatgaagg agctcgacgt caccgatcca gatgatccac gtggattcac ggcgcaagcc 120
aaaatccact gtgcttattg caatggtgca tacaccgtcg ctggcaaaga gctacaaatt 180
cacttctcat ggcttttttt cccattccat agatggtatt tgtacttcta tgaaagaatc 240
ttgggctctt taatcaatga tcctactttt ggtttgccat attggaactg ggatcatcca 300
aagggcatgc gtttgccaca catgtttgat caaccaaacg tgtaccctga tctttacgat 360
ccaagacgta accaagagca ccgtggttct gtaatcatgg accttggtca ttttggtcaa 420
gacgtgaaag gaactgactt gcaaatgatg agcaataacc ttactctaat gtatcgtcaa 480
atgattacca attcaccatg tccacaactc tttttcggta agccatattg tacggaagtt 540
ggacccaaac cagggcaggg agctattgaa aacatccctc atactcctgt ccacatttgg 600
gttggtagta agcctaatga gaataactgt aaaaacggtg aagatatggg aaatttctat 660
tcagctggta aggatcctgc tttctatagt caccatgcaa atgtagatcg catgtggaca 720
atatggaaaa cattaggagg aaacgccaag gacttcacca agcagaataa tttgacaact 780
gaagtccttt ttcctacgac gaagaagaaa aacccttaat ctcgtcaaag tcgtgactgt 840
ttgaacaata gaaaatggga taatgattca aagcaatgca accatggcgt aattagcatg 900
agagagcaga gcagtcatgc acgtccgtca gtcagctaca aaaacatcca 950

Claims (8)

1.一种合成基因，其特征在于所述合成基因的序列是以tRNA + sgRNA + gRNA 的核苷酸序列顺序合成的一个或多个基因重复序列。
2.根据权利要求1所述的合成基因，其特征在于所述合成基因的序列5’端与3’端需要加上限制性内切酶Bsa I的酶切位点：
5’… GGTCTCN▼ …3’
3’… CCAGAGN(N)4 ▲…5’ 。
3.根据权利要求2所述的合成基因，其特征在于所述合成基因的序列5’端与3’端在限制性内切酶Bsa I的酶切位点后需要加上与pORE-CRISPR/Cas9载体连接的接头（5’GATT和3’GTTTT），顺序如下：
5’-Bsa I (GGTCTCN▼)+GATT-3’+（tRNA + sgRNA1-（n-1）+ gRNA）+tRNA + sgRNAn +5’-▼GTTTT+Bsa I(GAGACC)-3’。
4.根据权利要求1所述的合成基因，其特征在于所述的合成基因连接进无限制性内切酶Bsa I酶切位点的克隆载体上。
5.一种权利要求1~4任一所述的合成基因构建烟草多基因定点突变载体的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、通过合成基因构建CRISPR/Cas9载体：根据基因序列设计多个靶位点sgRNA1-n序列，合成Bsa I +（tRNA + sgRNA1-（n-1）+ gRNA）+tRNA + sgRNAn + Bsa I基因序列；
B、合成后的基因序列连接进无Bsa I酶切位点的pUC57-Kan大肠杆菌克隆载体上；
C、PCR扩增合成基因片段：根据合成基因插入pUC57-Kan大肠杆菌克隆载体位置，利用通用引物M13和高保真酶以pUC57-Kan质粒为模板扩增合成基因片段；
D、Bsa I酶切电泳切胶回收合成基因；
E、Bsa I酶切电泳切胶回收pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；
F、通过T4连接酶将合成基因与pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体连接起来。
6.根据权利要求5所述的合成基因构建烟草多基因定点突变载体的方法，其特征在于PCR扩增体系为50µl，其中包含10.0µl的5 X buffer （10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1.5 mMMgCl2，pH 8.3 @ 25℃，4µl的 2.5 mM dNTPs（Takara Biotechnology Co. Ltd., Dalian,China），2µl 浓度10µM 的M13上下游引物，0.5µl的2000U/ml高保真DNA聚合酶（NEB），20-50ng模板pUC57-Kan质粒DNA，最后用ddH2O补齐50µl。
7.根据权利要求5所述的合成基因构建烟草多基因定点突变载体的方法，其特征在于PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min，30个循环（95℃变性30ｓ，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5min，4℃保存。
8.一种权利要求1~4任一所述的合成基因的应用，其特征在于所述的合成基因在构建烟草多基因定点突变载体并转化烟草植株同时获得多个目的基因定点突变中的应用。
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