CN112011539A - 一种基于CRISPR-Cas9技术靶向敲除猪GDPD2基因的细胞系及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9技术靶向敲除猪GDPD2基因的细胞系及其构建方法，该细胞系采用以下步骤制备：(1)根据猪GDPD2基因设计sgRNA向导序列；(2)将正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成双链DNA；将双链DNA与线性化的pGK1.1载体连接获得阳性打靶载体；(3)将阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC‑J2获得GDPD2基因敲除的IPEC‑J2细胞。本发明首次利用CRISPR/Cas9技术建立猪GDPD2基因敲除的IPEC‑J2细胞系，有助于研究GDPD2的蛋白功能。CRISPR/Cas9敲除技术方法简单，设计sgRNA即可对靶基因进行高效敲除，导致GDPD2基因功能的缺失，是理想的GDPD2基因敲除的IPEC‑J2细胞模型。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及利用CRISPR/Cas9技术构建猪GDPD2基因敲除细胞系，也涉及猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)基因敲除模型的构建技术。
背景技术
CRISPR/Cas9系统是古细菌和细菌在长期发展过程中形成的适应性免疫防御系统。作为规律成簇间隔短回文重复系统，CRISPR/Cas9是一种基因编辑工具，通过Cas9核酸酶介导sgRNA识别并切割dsDNA，诱发由非同源末端连接修复机制造成的移码突变，从而实现对靶基因的编辑。由于该技术操作性强且效率高，近几年已经成为定点编辑的重要遗传手段，是最具有临床与应用前景的基因治疗技术之一。
猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)是来源于仔猪空肠中的柱状上皮细胞，是研究猪多种疾病的理想体外模型，广泛应用于产肠毒素大肠杆菌和病毒性腹泻抗性基因的功能鉴定。
GDPD2是甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD)家族成员,是一个蛋白质编码基因，这种蛋白在成骨细胞分化和生长中起调控作用，并参与细胞的形态变化。目前尚未有猪GDPD2基因的敲除载体及GDPD2基因敲除的小肠上皮细胞模型相关研究报道。
发明内容
发明的目的在于提供一组基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪GDPD2基因的sgRNA向导序列。
本发明的另一目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪GDPD2基因的双链DNA。
本发明的另一目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪GDPD2基因的敲除载体及其在敲除猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)中GDPD2基因的应用。
本发明的又一目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9技术特异性靶向敲除猪GDPD2基因的细胞系。
本发明的又一目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)中GDPD2基因的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一组基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪GDPD2基因的sgRNA向导序列，该sgRNA向导序列包括sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3：
sgRNA1：CTCACCATGGCCGAGTCCCGCGG；
sgRNA2：CCAACAAGGTGAAGTATGGGTGG；
sgRNA3：ACTGTCTGTATAGCTGCCACTGG。
一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪GDPD2基因的双链DNA，将上述sgRNA向导序列的5’端添加CACC并去除3’端的PAM(NGG)序列，形成正链sgRNA序列(需要注意的是，如果sgRNA 5’端的第一个碱基不是G，则添加CACCG)，将sgRNA向导序列的反向互补序列的5’端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列；将正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成双链DNA，该双链DNA包括(1)～(3)组双链DNA：
(1)GDPD2-1F：CACCGCTCACCATGGCCGAGTCCCG，GDPD2-1R：AAACCGGGACTCGGCCATGGTGAGC；
(2)GDPD2-2F：CACCGCCAACAAGGTGAAGTATGGG，GDPD2-2R：AAACCCCATACTTCACCTTGTTGGC；
(3)GDPD2-3F：CACCGACTGTCTGTATAGCTGCCAC，GDPD2-3R：AAACGTGGCAGCTATACAGACAGTC。
一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪GDPD2基因的敲除载体，该载体采用以下步骤构建：
(1)靶位点设计及sgRNA序列的合成：依据猪GDPD2基因CDS区所在的第一个外显子设计如上述的sgRNA向导序列，将各sgRNA向导序列的5’端添加CACC并去除3’端的PAM(NGG)序列，若sgRNA 5’端第一个碱基不是G，则添加CACCG，形成正链sgRNA序列，将各sgRNA向导序列的反向互补序列的5’端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列；
(2)载体构建：将所述的正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成如上述的三组双链DNA；将各组双链DNA分别与线性化的pGK1.1载体连接，得到连接产物并进行筛选获得三种阳性打靶载体即为靶向敲除猪GDPD2基因的敲除载体。
一种基于CRISPR/Cas9技术特异性靶向敲除猪GDPD2基因的细胞系，该细胞系为将上述的三种阳性打靶载体混合电转入IPEC-J2细胞并进行筛选和验证得到的；三种阳性打靶载体可以等比例混合电转，但不限于此。
一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪小肠上皮细胞系中GDPD2基因的方法，该方法包括以下步骤：
(1)靶位点设计及sgRNA序列的合成：依据猪GDPD2基因CDS区所在的第一个外显子设计如上述的sgRNA向导序列，将各sgRNA向导序列的5’端添加CACC并去除3’端的PAM序列，若sgRNA 5’端第一个碱基不是G，则添加CACCG，形成正链sgRNA序列，将各sgRNA向导序列的反向互补序列的5’端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列；
(2)载体构建：将所述的正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成如权利要求2中所述的三组双链DNA；将各组双链DNA分别与线性化的pGK1.1载体连接，得到连接产物并进行筛选获得三种阳性打靶载体即为靶向敲除猪GDPD2基因的敲除载体；
(3)细胞转染：将三种阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC-J2并进行筛选验证和培养获得猪GDPD2基因靶向敲除的IPEC-J2细胞。
作为一种优选技术方案，上述方法的步骤(2)中得到连接产物并进行筛选获得三种阳性打靶载体的过程为：将连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆，摇菌培养后，根据sgRNA向导序列设计菌液PCR引物组，进行PCR筛选验证获得三种阳性打靶载体；所述菌液PCR引物组包含三对引物对，各引物对的正向引物为通用引物，反向引物分别为sgRNA反向互补序列，各引物对的具体序列如下所示：
F1：CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG，
R1：CGGGACTCGGCCATGGTGAG；
F2：CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG，
R2：CCCATACTTCACCTTGTTGG；
F3：CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG，
R3：GTGGCAGCTATACAGACAGT。
作为一种优选技术方案，上述方法的步骤(3)中所述筛选验证的过程为：
(Ⅰ)将三种阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC-J2，经嘌呤霉素药筛，提取细胞基因组DNA，在敲除靶位点附近设计高特异性的引物进行PCR扩增，引物序列为：GDPD2-seqF：CCCCGGGCTCCTCAAATATC；GDPD2-seqR：TTCCTCCTGGGGAGAGAAAG；
(Ⅱ)CruiserTM酶切PCR扩增产物鉴定有效打靶的阳性克隆；
(Ⅲ)对CruiserTM酶切筛选的GDPD2基因敲除细胞进行TA克隆测序，获得GDPD2基因敲除的IPEC-J2细胞。
上述的sgRNA向导序列、双链DNA、敲除载体或敲除猪GDPD2基因的细胞系在猪抗病育种中的应用。
上述的方法在猪抗病育种中的应用。
本发明技术方案的详细步骤为：
(1)通过在线软件(http://crispr.mit.edu/)设计sgRNA向导序列，包括sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3，序列如下：
sgRNA1：CTCACCATGGCCGAGTCCCGCGG；
sgRNA2：CCAACAAGGTGAAGTATGGGTGG；
sgRNA3：ACTGTCTGTATAGCTGCCACTGG。
(2)在5’端添加额外碱基CACCG并去除3’端的PAM序列，反向互补序列添加额外碱基AAAC，退火后形成dsDNA。
(3)退火后dsDNA分别与线性化敲除载体PGK1.1连接，得到连接产物。后续进行菌液PCR的筛选并扩大培养，提取质粒得到三种阳性打靶载体。
(4)三种阳性打靶载体混合电转入IPEC-J2细胞系并进行药筛，提取GDPD2敲除细胞DNA，并进行PCR的扩增。
(5)CruiserTM酶切PCR产物以及PCR产物的测序验证，建立了GDPD2基因敲除细胞系。
本发明采用CRISPR/Cas9技术敲除IPEC-J2细胞系中GDPD2的基因序列，建立GDPD2基因的敲除细胞系，为进一步验证GDPD2基因在猪抗病育种中的功能，揭示GDPD2基因的作用机制。
本发明利用CRISPR-Cas9特异性靶向敲除猪GDPD2基因的技术中，sgRNA向导序列的设计起关键作用，sgRNA设计不好，后面单克隆筛选的细胞即没有敲除效率，因此sgRNA的序列为本发明的重要发明点之一。本发明通过实验从众多的sgRNA可能的序列中筛选出可以高效敲除猪GDPD2基因sgRNA向导序列。
本发明的有益效果：
(1)首次利用CRISPR/Cas9技术建立猪GDPD2基因敲除的IPEC-J2细胞系。
(2)CRISPR/Cas9敲除技术比起干扰、基因沉默等技术手段更有效果，能够有助于我们研究GDPD2的蛋白功能。
(3)CRISPR/Cas9敲除技术方法简单，设计sgRNA即可对靶基因进行高效敲除，且敲除测序结果显示GDPD2基因序列缺失，导致GDPD2基因功能的缺失，是比较理想的GDPD2基因敲除的IPEC-J2细胞模型。
附图说明
图1：菌液PCR凝胶电泳检测图；其中，M为100bp DNAMarker，1-6均为阳性菌液PCR条带，条带大小均为100bp。
图2：GDPD2基因敲除载体测序峰图；其中，A为sgRNA1对应的测序峰图，B为sgRNA2对应的测序峰图，C为sgRNA3对应的测序峰图。
图3：pool细胞测序峰图初步验证GDPD2基因的敲除效率。
图4：CruiserTM酶切筛选GDPD2基因敲除细胞DNA PCR产物凝胶电泳检测图。
图5：GDPD2基因敲除细胞的DNA序列与未敲除细胞DNA序列比对分析结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1
1.靶位点得设计及sgRNA序列的合成
根据NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找到GDPD2(Gene ID：100516309)CDS区，依据CDS区所在的第一个外显子进行敲除靶位点的设计，运用CRISPRDesign(http://crispr.mit.edu/)设计三条sgRNA向导序列：
sgRNA1：CTCACCATGGCCGAGTCCCGCGG
sgRNA2：CCAACAAGGTGAAGTATGGGTGG
sgRNA3：ACTGTCTGTATAGCTGCCACTGG
sgRNA向导序列5’端添加CACC并去除3’端的PAM(NGG)序列，若sgRNA向导序列5’端第一个碱基不是G，则添加CACCG，形成正链sgRNA序列；sgRNA向导序列的反向互补序列5’端添加碱基AAAC形成负链sgRNA序列。三对正负链sgRNA序列如下：
GDPD2-1F：CACCGCTCACCATGGCCGAGTCCCG
GDPD2-1R：AAACCGGGACTCGGCCATGGTGAGC；
GDPD2-2F：CACCGCCAACAAGGTGAAGTATGGG
GDPD2-2R：AAACCCCATACTTCACCTTGTTGGC；
GDPD2-3F：CACCGACTGTCTGTATAGCTGCCAC
GDPD2-3R：AAACGTGGCAGCTATACAGACAGTC。
2.GDPD2基因敲除载体的构建
(1)将上述合成的三对正负链sgRNA序列分别进行退火，获得双链sgRNA序列，退火反应体系如下：
PCR反应程序：37℃30min，95℃5min，梯度降温至5℃，自然冷却20min。
(2)BbsI酶对PGK1.1载体(购自Genloci，货号GP0132)进行线性化处理，酶切反应体系如下：
酶切体系37℃孵育3h，后对线性化载体进行切胶回收。
(3)线性化载体PGK1.1与各组双链sgRNA序列分别连接，连接反应体系如下：
上述连接体系16℃连接过夜，获得连接产物。
(4)取Top10感受态置于冰上融解，加入10μL连接产物，混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激60s，迅速拿出置于冰上静置2-3min。向管中加入无抗SOC液体培养基800μL，摇床(37℃/160rpm)孵育45min，4500rpm离心5min，弃去管中800μL上清，沉淀吹散混匀在100μL上清中，均匀涂布在提前准备好的含卡那霉素抗性的固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。
设计菌液PCR引物，正向引物为通用引物，反向引物分别为sgRNA反向互补序列：
F1：CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG
R1：CGGGACTCGGCCATGGTGAG；
F2：CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG
R2：CCCATACTTCACCTTGTTGG；
F3：CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG
R3：GTGGCAGCTATACAGACAGT。
菌液PCR筛选：从培养板上挑选单菌落加入含1mL卡那霉素抗性的LB培养基，摇床摇7-8h。PCR管中加入上述正反向引物各1μL，菌液8μL，普通Mix10μL。反应程序：95℃10min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，35-40个循环，72℃10min。
图1为菌液PCR凝胶电泳检测图，M为100bp DNA Marker，1-6均为阳性菌液PCR条带，条带大小均为100bp，说明获得了阳性打靶载体。
对得到的阳性菌落进行进一步测序验证，测序结果如图2所示，从测序图中可以找出sgRNA序列，表明sgRNA序列已与PGK1.1载体成功连接，获得GDPD2敲除载体。对阳性菌落进行扩大培养，提取GDPD2敲除载体，共获得三种阳性打靶载体用于后续实验。
3.细胞转染
将状态良好处于对数生长期的约为5×106个猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)置于15mL离心管中，1000rpm离心4min，弃上清，后将细胞沉淀悬浮于210μL DPBS中，转移至1.5mL离心管，取上述三种阳性打靶载体等比例混合加到离心管中，混匀。使用电转法进行转染，之后将细胞移至六孔板培养基中培养。
4.GDPD2基因的敲除
培养72h后以终浓度3μg/mL的嘌呤霉素进行药筛，待细胞长满之后进行pool细胞测序，结果如图3所示，测序结果显示有套峰，初步证明敲除有效率。
用有限稀释法稀释药筛后细胞到10块96孔板中，37℃CO2培养箱中培养，定期观察单克隆的生长情况，之后转移至48孔板中扩大培养，当细胞长满48孔板时，分离出部分细胞并用DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA。
5.GDPD2基因敲除细胞的筛选与验证
(1)PCR扩增目的片段：在GDPD2敲除靶位点附近设计高特异性引物，扩增产物长度为333bp，引物序列如下：
GDPD2-seqF：CCCCGGGCTCCTCAAATATC；
GDPD2-seqR：TTCCTCCTGGGGAGAGAAAG。
PCR扩增体系反应如下：
反应程序为：95℃5min，95℃30s，55-62℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10min。
(2)CruiserTM酶切筛选GDPD2敲除细胞：使用CruiserTM酶对上述PCR扩增产物进行酶切，酶切反应体系如下：
37℃孵育3h后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
图4为CruiserTM酶切GDPD2基因敲除细胞结果，产物扩增长度333bp，酶切之后片段长度明显变小的克隆为阳性克隆，图中82#克隆初步鉴定为有效打靶的阳性克隆。
(3)对CruiserTM酶切筛选出来的GDPD2基因敲除细胞做TA克隆测序，测序结果与野生型细胞(未进行基因敲除的IPEC-J2细胞)DNA序列比对，结果如图5，GDPD2基因敲除的细胞发生52bp的碱基缺失。
通过与未敲除细胞的DNA序列对比，可以看出本发明采用以上方法成功构建了GDPD2基因敲除的猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)，缺失片段为52bp，缺失序列如下：CCCGCGGCTGCTGCTCTGTCTGGGCCCGCTGCCTCCACTGTCTGTATAGCTG。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种基于CRISPR-Cas9技术靶向敲除猪GDPD2基因的细胞系及其构建方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcaccatgg ccgagtcccg cgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaacaaggt gaagtatggg tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actgtctgta tagctgccac tgg 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccgctcac catggccgag tcccg 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaccgggac tcggccatgg tgagc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccgccaac aaggtgaagt atggg 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaaccccata cttcaccttg ttggc 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caccgactgt ctgtatagct gccac 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaacgtggca gctatacaga cagtc 25
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catatgctta ccgtaacttg aaag 24
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgggactcgg ccatggtgag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccatacttc accttgttgg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtggcagcta tacagacagt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccccgggctc ctcaaatatc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttcctcctgg ggagagaaag 20
<210> 16
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cccgcggctg ctgctctgtc tgggcccgct gcctccactg tctgtatagc tg 52
Claims (9)
1.一组基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪GDPD2基因的sgRNA向导序列，其特征在于，该sgRNA向导序列包括sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3：
sgRNA1：CTCACCATGGCCGAGTCCCGCGG；
sgRNA2：CCAACAAGGTGAAGTATGGGTGG；
sgRNA3：ACTGTCTGTATAGCTGCCACTGG。
2.一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪GDPD2基因的双链DNA，其特征在于，该双链DNA包括(1)～(3)组双链DNA：
(1)GDPD2-1F：CACCGCTCACCATGGCCGAGTCCCG，GDPD2-1R：AAACCGGGACTCGGCCATGGTGAGC；
(2)GDPD2-2F：CACCGCCAACAAGGTGAAGTATGGG，GDPD2-2R：AAACCCCATACTTCACCTTGTTGGC；
(3)GDPD2-3F：CACCGACTGTCTGTATAGCTGCCAC，GDPD2-3R：AAACGTGGCAGCTATACAGACAGTC。
3.一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪GDPD2基因的敲除载体，其特征在于，该载体采用以下步骤构建：
(1)靶位点设计及sgRNA序列的合成：依据猪GDPD2基因CDS区所在的第一个外显子设计如权利要求1所述的sgRNA向导序列，将各sgRNA向导序列的5’端添加CACC并去除3’端的PAM序列，若sgRNA 5’端第一个碱基不是G，则添加CACCG，形成正链sgRNA序列，将各sgRNA向导序列的反向互补序列的5’端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列；
(2)载体构建：将所述的正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成如权利要求2中所述的三组双链DNA；将各组双链DNA分别与线性化的pGK1.1载体连接，得到连接产物并进行筛选获得三种阳性打靶载体即为靶向敲除猪GDPD2基因的敲除载体。
4.一种基于CRISPR/Cas9技术特异性靶向敲除猪GDPD2基因的细胞系，其特征在于，该细胞系为将权利要求3中所述的三种阳性打靶载体混合电转入IPEC-J2细胞并进行筛选和验证得到的。
5.一种基于CRISPR/Cas9技术靶向敲除猪小肠上皮细胞系中GDPD2基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)靶位点设计及sgRNA序列的合成：依据猪GDPD2基因CDS区所在的第一个外显子设计如权利要求1所述的sgRNA向导序列，将各sgRNA向导序列的5’端添加CACC并去除3’端的PAM序列，若sgRNA 5’端第一个碱基不是G，则添加CACCG，形成正链sgRNA序列，将各sgRNA向导序列的反向互补序列的5’端添加碱基AAAC，形成负链sgRNA序列；
(2)载体构建：将所述的正链sgRNA序列和负链sgRNA序列退火形成如权利要求2中所述的三组双链DNA；将各组双链DNA分别与线性化的pGK1.1载体连接，得到连接产物并进行筛选获得三种阳性打靶载体即为靶向敲除猪GDPD2基因的敲除载体；
(3)细胞转染：将三种阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC-J2并进行筛选验证和培养获得猪GDPD2基因靶向敲除的IPEC-J2细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中得到连接产物并进行筛选获得三种阳性打靶载体的过程为：将连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆，摇菌培养后，根据sgRNA向导序列设计菌液PCR引物组，进行PCR筛选验证获得三种阳性打靶载体；所述菌液PCR引物组包含三对引物对，各引物对的正向引物为通用引物，反向引物分别为sgRNA反向互补序列，各引物对的具体序列如下所示：
F1：CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG，
R1：CGGGACTCGGCCATGGTGAG；
F2：CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG，
R2：CCCATACTTCACCTTGTTGG；
F3：CATATGCTTACCGTAACTTGAAAG，
R3：GTGGCAGCTATACAGACAGT。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述筛选验证的过程为：
(Ⅰ)将三种阳性打靶载体混合电转染靶细胞IPEC-J2，经嘌呤霉素药筛，提取细胞基因组DNA，在敲除靶位点附近设计高特异性的引物进行PCR扩增，引物序列为：GDPD2-seqF：CCCCGGGCTCCTCAAATATC；GDPD2-seqR：TTCCTCCTGGGGAGAGAAAG；
(Ⅱ)CruiserTM酶切PCR扩增产物鉴定有效打靶的阳性克隆；
(Ⅲ)对CruiserTM酶切筛选的GDPD2基因敲除细胞进行TA克隆测序，获得GDPD2基因敲除的IPEC-J2细胞。
8.权利要求1中所述的sgRNA向导序列、权利要求2中所述的双链DNA、权利要求3中所述的敲除载体或权利要求4中所述的细胞系在猪抗病育种中的应用。
9.权利要求5所述的方法在猪抗病育种中的应用。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112553200A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-26 | 扬州大学 | 一种用于敲除猪ugt2c1基因的打靶载体制备方法及其应用 |
| CN112553202A (zh) * | 2020-12-12 | 2021-03-26 | 华中农业大学 | 三对特异性识别猪GDF11基因的sgRNA及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160272965A1 (en) * | 2013-06-17 | 2016-09-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof |
| CN110004145A (zh) * | 2019-04-02 | 2019-07-12 | 扬州大学 | 一种sgRNA、敲除载体、KLF4基因的敲除方法及其应用 |
-
2020
- 2020-08-26 CN CN202010867825.9A patent/CN112011539A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160272965A1 (en) * | 2013-06-17 | 2016-09-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof |
| CN110004145A (zh) * | 2019-04-02 | 2019-07-12 | 扬州大学 | 一种sgRNA、敲除载体、KLF4基因的敲除方法及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HAIFEI WANG: "Global Mapping of H3K4 Trimethylation (H3K4me3) and Transcriptome Analysis Reveal Genes Involved in the Response to Epidemic Diarrhea Virus Infections in Pigs", 《ANIMALS》, vol. 9, no. 8, 2 August 2019 (2019-08-02) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112553200A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-26 | 扬州大学 | 一种用于敲除猪ugt2c1基因的打靶载体制备方法及其应用 |
| CN112553202A (zh) * | 2020-12-12 | 2021-03-26 | 华中农业大学 | 三对特异性识别猪GDF11基因的sgRNA及应用 |
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