CN109628493B - 一种用于制备可异体移植t细胞的基因编辑系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统，其特征在于，该系统包括在CRISPR/Cas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA，所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′‑G(21N)NNGRRT‑3或者5′‑ARRCNN(21N)C‑3′的序列排列规则，所述靶向敲除TCR基因的靶序列以病毒为转染载体，其中5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因可以通过所述的病毒为载体，使用时与含有TCR基因的靶序列的病毒共同转染细胞，或把TCR基因的靶序列、Cas9、5′端和3′端都带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因，三者一起包装到杆状病毒中，以杆状病毒为载体转染细胞。

Description

一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统

技术领域

本发明涉及基因靶向编辑领域，尤其涉及一种利用基因编辑技术制备可异体移植T细胞技术，具体的为一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统。

背景技术

近年来，利用免疫疗法来治疗肿瘤，受到广泛的关注。在众多的免疫疗法中，基于嵌合抗原受体T细胞(ChimericantigenreceptorTcells，CAR-T)疗法，效果最为显著和成熟。目前已经有多例临床试验证明，该技术可以治愈多种肿瘤，例如B细胞肿瘤。其基本原理是利用基因工程的方法，将能识特异识别肿瘤细胞的受体基因，利用整合型病毒作为载体，将该受体基因整合到患者T细胞基因组中，从而使改造后的T细胞具有特异性识别和杀伤肿瘤细胞的目的，从而达到治疗肿瘤的效果。另一方面，该技术还存在一些急需解决的障碍，首先，该技术只能针对病人自体T细胞进行编辑，大大提高了其治疗成本及延长治疗周期(利用病人自身T细胞制备CAR-T细胞，一般耗时长)；第二，由于T细胞表面不仅表达CAR还有自身的TCR受体表达，研究发现TCR受体会影响CAR受体的功能，有临床研究表面，可对神经系统造成伤害，形成脑水肿。

为解决以上CAR-T治疗技术的问题，多个研究小组利用基因编辑技术(ZFN，TALEN)针对TCR受体敲除，取得了显著效果。有研究报道，目前利用TALEN技术敲除TCR受体来制备MCAR-T技术(MniversalCAR-T)，该技术一方面将TCR受体通过TALEN定点敲除，另一方面通过同源重组技术将CAR基因定点整合到TCR基因位点。该技术不仅有效的避免了异体移植导致的移植物抗宿主反应GVHD(GhostVersμsHostDisease)，使得CAR-T细胞的制备摆脱个性化的缺陷而进入到标准化和规模化的时代，同时还避免了TCR基因对CAR受体功能的干扰。此外，由于CAR基因定点整合到TCR位点上，避免了现行CAR-T制备中CAR基因随机整合基因组所导致的潜在癌变风险。目前该技术已经获得了FDA的临床试验批文，而且利用该技术成功为两患者进行了治疗。然而由于ZFN或者TALEN技术属于第一，二代基因编辑技术，在应用方面存在很大的局限性，例如构建流程复杂、周期长、成本高等。

近几年基因编辑技术突破性的发展，利用现在的编辑手段，可以将目的基因进行精准编辑。尤其是第三代基因编辑技术CRISPR具有明显的优势，例如构建简单，效率高，成本低等。CRISPR系统均包含以下几个部分：1)PAM位点，位于靶序列的下游，只有几个nt(例如，SpCAS9/NGG；SaCAS9/NNGRRT)，根据此位点来选取靶序列；2)靶序列(sgRNA)，识别并与切割位点结合的序列，一般在20nt左右；3)TracRNA，连接于靶序列之后的一段回文RNA序列；4)Cas9内切酶，具有独立酶活性，Cas9含有在氨基末端的RμvC和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点，Cas9中的HNH活性位点剪切sgRNA的互补DNA链，RμvC活性位点剪切非互补链。其工作原理为：sgRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于sgRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-Ioop，使sgRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切sgRNA的互补DNA链，RμvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR技术目前已经广泛应用于多个领域，例如动植物育种，疾病治疗，以及基础科研等领域。

CRISPR-SACAS9系统，是一种来自金黄色葡萄球菌的CAS9酶。其在哺乳动物细胞中的基因编辑效率高，而且其基因比较小(3.1kb)。因此，该系统能够利用多种转染系统转染，例如电转化、腺相关病毒等。另外由于SACAS9系统PAM序列较长(NNGRRT)，且靶点识别序列在21-23nt，导致该系统具有靶向性高、脱靶效率低等优点。

鉴于现有CAR-T技术还有待进一步完善和优化，以及CRISPR/SACAS9技术在基因精准编辑上等高效性和安全性，本发明将二者有机结合，用CRISPR/SACAS9技术敲除人TCR基因，制备可异体移植的通用型T细胞，用以改善和优化CAR-T制备技术。

CRISPR/Cas9介导的定点同源重组必备两个条件：一是CRISPR/Cas9，含有效切割目的基因的gRNA；二是同源重组供体(图1)，一般含上、下游同源臂，以及在两同源臂之间的需要定点整合的外源DNA序列(该外源序列可以含启动子或不含启动子，如不含启动子，则必须插入外显子序列并保持插入后读码框正确)。当宿主的基因组DNA被gRNA识别并引导Cas9定点切割，同源重组供体存在下，宿主细胞倾向于通过同源重组的方式修复基因组DNA，从而在基因组DNA特定位点引入了外源DNA序列(图2)。经我们研究发现，同源臂序列的长度，以及外源DNA序列的长度，对重组效率都有极大影响。目前我们确定最优的同源臂长度在800bp以内(含800bp)，而外源DNA序列长度以5kb以内为佳。

采用CRISPR/Cas9介导的定点同源重组技术，在敲除人TCR基因的同时，在TCR基因特定位点(Cas9切割位点)，通过同源重组技术插入嵌合抗原受体(CAR)基因，从而达到TCR敲除和CAR表达的双重效果。利用该技术可以制备特异性攻击肿瘤组织的通用型T细胞，这种通用型T细胞具有以下几方面的优点：1)敲除了TCR基因，避免了异体移植导致的移植物抗宿主反应，所以利用该技术可以实现T细胞的异体移植，实现CAR-T的标准化和规模化生产，降低成本并缩短生产周期；2)TCR基因敲除减低TCR对细胞表面CAR功能的影响，降低临床安全风险；3)CAR定点插入TCR位点，达到TCR敲除和CAR表达的双重效果，避免现有技术中心CAR随机插入带来的癌变风险。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种能够异体移植的通用型T细胞制备技术，该技术制备的T细胞具备以下优点：第一，能够异体移植，使用于制备CAR-T的T细胞成为一种储备型生物药品，便于大规模、批量化、标准化生产；第二，提高CAR受体的功能活性，避免了TCR受体的干扰。同时，利用CRISPR/SACAS9介导的TCR基因位点定点同源重组技术，该技术制备的T细胞具备以下优点：第一，TCR基因敲除，可以异体移植，规模化生产；第二，避免TCR受体干扰CAR受体的功能；第三，TCR基因位点定点插入外源基因，可实现CAR基因定点整合到TCR基因位点，避免异体移植导致的移植物抗宿主反应。

本发明筛选出了针对人TCR基因的多个CRISPR-SACAS9的高效sgRNA靶序列，并将这些sgRNA靶序列单独或配对或组合使用，通过六型腺相关病毒(AAV6)或慢病毒来敲除TCR基因。

本发明的技术方案如下：

一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统，该系统包括在CRISPR/SaCas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA，所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′-G(21N)NNGRRT-3或者5′-ARRCNN(21N)C-3′的序列排列规则，所述系统还包括5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因。

一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统，该系统包括在CRISPR/SaCas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA，所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′-G(21N)NNGRRT-3或者5′-ARRCNN(21N)C-3′的序列排列规则，所述靶向敲除TCR基因的靶序列以病毒为转染载体，所述系统还包括5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因，其可以通过所述的病毒为载体，使用时与含有TCR基因的靶序列的病毒共同转染细胞。

一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统，该系统包括在CRISPR/SaCas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA，所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′-G(21N)NNGRRT-3或者5′-ARRCNN(21N)C-3′的序列排列规则，所述系统还包括5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因，使用时把TCR基因的靶序列、Cas9基因、5′端和3′端都带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因，三者一起包装到杆状病毒中，以杆状病毒为载体转染细胞。

优选的，以所述人TCR基因α链和β链恒定区作为靶标，通过靶向TCR基因α链和β链的sgRNA筛选，由此获得了在CRISPR-SACAS9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA，所述人TCR基因α链和β链恒定区基因号为NC_000014.9；NC_000007.14。

优选的，以所述人TCR基因α链和β链恒定区作为靶标，依据SACAS9F.AnnRanetal.2015编辑规则筛选出了多个靶序列，其中21N的靶序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：30中任意一条序列。

优选的，所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′-G(20N)NGG-3′或者5′-CCN(20N)C-3′的序列排列规则，并满足SEQIDNO：37～SEQIDNO：62中任意一条序列。

优选的，所述靶向敲除TCR基因的靶序列配对组合为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4，SEQIDNO：3和SEQIDNO：8，SEQIDNO：4和SEQIDNO：8，SEQIDNO：3和SEQIDNO：13，SEQIDNO：3和SEQIDNO：14，SEQIDNO：3和SEQIDNO：17)以及多个靶序列(≥3)组合形成的CRISPR/Sacas9系统。

优选的，所述靶向敲除TCR基因的靶序列以病毒为转染载体，所述病毒转染载体为腺相关病毒、慢病毒、腺病毒、杆状病毒、逆转录病毒中的一种，所述腺相关病毒包括各种血清型腺相关病毒以及其突变型，所述慢病毒包括整合型以及非整合型。

优选的，所述靶向敲除TCR基因的靶序列为DNA或相对应的RNA。

优选的，所述TCR基因包含α链和β链，所述基因改造具体方法为在TCR的α链和β链的一种或两种的CDS序列或恒定区域的相应编码基因的外显子区，利用CRISPR/SaCas9进行定点切割，从而使TCR基因失活，达到T细胞表面无TCR受体的目的，编辑后的T细胞在有异体移植过程中避免移植物抗宿主反应。

优选的，所述靶向TCR基因α链和β链的sgRNA筛选包括如下步骤：

步骤1)构建sgRNA的寡核苷酸双链：

S1：根据选择的sgRNA，通过化学合成法合成寡核苷酸链，格式如下：

正义链：5′-G(21N)NNGRRT-3′或者5′-ARRCNN(21N)C-3′，引物不含PAM，

反义链：与正义链互补，分别在正义链引物的5′端加上CACC，在反义链引物5′端加上AAAC，以形成BbsI酶切位点的粘性末端；其中，21N代表靶序列的21个碱基序列；

S2：把正义链引物和反义链引物经过退火，形成带有BbsI酶切位点的粘性末端的双链核苷酸小片段；

步骤2)CRISPR-SACAS9载体构建；

步骤3)细胞系转染；

步骤4)突变效率检测。

本发明还提供了一种应用，应用于上述所述的用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统，其特征在于，用外周血或脐带血来源的T细胞，通过上述用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统，制备成一种可异体移植的T细胞。附图说明

图1A为本发明中同源重组供体(含启动子)的结构图；

图1B为本发明中同源重组供体(不含启动子)的结构图；

图2为本发明中基因重组示例图；

图3为本发明中PX601的结构图；

图4为本发明中PX458的结构图；

图5为本发明中同源重组供体质粒pDONOR-mCMV-EGFP的结构图；

图6a\6b\6c\6d\6e为本发明实施例中以DL2000为参照的电泳结果图；

图7a\7b\7c为本发明实施例中以DL2000为参照的电泳结果图；

图8a\8b为本发明实施例中以DL2000为参照的CR产物的长度的电泳结果图；

图9为本发明实施例中T7E1的酶切和电泳结果图；

图10为本发明实施例中pDonor-mCMV-EGFP-上下游同源臂的结构图；

图11为本发明实施例中SEQIDNO：71的结构图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

以下实施例中使用到的实验材料包含：商品化的CRISPR-Cas9载体，如PX601(参照图3)，PX458(参照图4)；HEK293T细胞；大肠杆菌感受态细胞TOP10；同源重组供体质粒pDONOR-mCMV-EGFP(参照图5)。

实施例1gRNA初步筛选

1、针对TCRA基因的gRNA准备

(1)根据TCRA基因的序列(包括包含α链和β链恒定区)设计的gRNA序列：

CRISPR/SpCas9系统的gRNA对应的靶序列如下表所示：

表1针对TCRA基因的CRISPR/SpCas9系统的gRNA对应的靶序列。

CRISPR/SaCas9系统的gRNA对应的靶序列如下表所示：

表2针对TCRA基因的CRISPR/SaCas9系统的gRNA对应的靶序列。

(2)分别合成gRNA对应的靶序列的正义链和反义链(正义链的5′-端加cacc，若正义链5′-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在正义链的5′-端加caccG；在反义链的5′-端加aaac，若正义链5′-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在反义链的3′-端加C)；

(3)将上述gRNA正义链和反义链溶解成100μM的母液，各取1μL加入到98μLddH2O混合稀释到1μM，90℃处理30s后，移至室温冷却完全退火。反应体系如下：

2、载体准备

(1)将100μL的TOP10-pX601和TOP10-pX458菌液分别加入100mLLB液体培养基(Amp)中，恒温摇床37℃200rpm摇菌12-16h；

(2)分别提取pX601质粒和pX458质粒，并测定质粒浓度；

(3)采用Bsal对pX601进行酶切，采用BbsI对pX458进行酶切，37℃酶切1h，反应体系如下：

(4)1％琼脂糖凝胶回收经酶切的质粒pX601和pX458，并测定回收酶切质粒的浓度，-20℃保存备用。

3、连接转化

(1)将表1对应的退火后的gRNA与酶切纯化过的pX458载体进行连接反应将表2对应的退火后的gRNA与酶切纯化过的pX601载体进行连接反应。25℃连接20min，反应体系如下：

(2)将上述连接产物各5μL分别加入两管20μL的TOP10感受态细胞中，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min。42℃热击45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置5min。向每个离心管中加入230μL无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。

(3)将复苏后的感受态细胞直接倒至LB固体平板(Amp抗性)上，晃动平板使菌液涂布均匀，超净工作台吹干平板，将平板倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。

(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到500μLLB液体培养基(Amp)中扩大培养4h。

(5)使用正向测序引物SEQIDNO：63(5′-ATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3′)对pX458的连接产物转化的菌液进行测序；使用正向测序引物SEQIDNO：64(5′-TTCCTTgACCCTggAAggTg-3′)对pX601的连接产物转化的菌液进行测序；

(6)将上述测序正确的菌种扩大培养后提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

4、细胞转染

(1)HEK293T细胞铺板

(2)采用Lipofectamine3000试剂盒将上述3(6)中提取的质粒分别转染HEK293T细胞；

(3)转染后的细胞培养48小时，收集细胞。

5、T7E1酶切分析突变效率

(1)将上述4(3)收集的细胞提取细胞基因组，并检测基因组浓度；

(2)分别在gRNA结合位点上下游设计PCR检测引物，见表1和表2；

(3)使用高保真PCR试剂盒分别扩增带有靶位点的目的片段，PCR反应条件：

95℃3min→95℃15s→55℃15s→72℃30s→72℃5min，35cycles。

(4)使用产物纯化试剂盒回收PCR产物，并测定产物浓度；

(5)将上述纯化的PCR产物退火处理，即先加热至95℃，保温10min，然后以每30s下降2～3℃的速度降温至室温；：

(6)上述每管退火产物分别加入T7核酸内切酶1(T7E1)，设置mock组(未转化的细胞)和空白对照(CK)组(不加T7E1，用ddH2O代替)，37℃酶切1h。

(7)以DL2000(TAKARA)为参照，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，电泳结果见图6和图7。

图6为CRISPR/SaCas9系统对TCRA基因的gRNA筛选，图7为CRISPR/SpCas9系统对TCRA基因的gRNA筛选。(a)(b)(c)分别为以SEQIDNO：31和SEQIDNO：32，SEQIDNO：33和SEQIDNO：34，SEQIDNO：35和SEQIDNO：36为检测引物的gRNA对TCRA基因的突变效率检测，泳道编号对应gRNA靶序列编号。根据T7E1的酶切原理，突变效率高与酶切效率成正比，图中编号带下划线的泳道酶切效率较高，即所对应的gRNA对TCRA基因的突变效率较高。

(8)在上述T7E1酶切电泳图中突变效率较高的PCR产物中，随机挑取4个，给PCR产物3′-末端加一个腺嘌呤(A)，然后用1％琼脂糖凝胶电泳后分别切胶回收目的片段，并测定回收产物浓度；

(9)将上述4份回收产物分别与pMDTM18-T载体进行连接反应，16℃反应30min；

(10)将上述4份连接产物分别按3(2)-(3)方法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，并分别涂布LB平板(AMP)；

(11)从上述4个平板上分别随机挑取10-50个单菌落，进行Sanger测序；

(12)上述测序结果统计如下表3所示。由测序结果可知：

表3Sanger测序比较突变效率。

注：有效测序菌落总数指，随机挑取进行测序的菌落总数，减去发生载体自连的菌落数。

实施例2针对TCRA基因的gRNA组合筛选

将实施例1中经过T7E1酶切和琼脂糖电泳分析，筛选出来的突变效率较高的gRNA，组合起来对TCRA基因进行突变操作，具体步骤如下：

1、gRNA组合如下表所示：

表4针对TCRA基因的CRISPR/SaCas9系统的gRNA组合对应的靶序列：

将实施例1中3(6)制备的质粒，按照上述组合方式，共同转染HEK293T细胞，转染方式参照实施例1的4(1)～4(3)；

转染后48小时，按照实施例1中5(1)～5(4)的方法扩增并纯化含有靶位点的目的片段；

以DL2000(TAKARA)为参照，用2％琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR产物的长度。结果如图8所示：(a)(b)分别为以SEQIDNO：31和SEQIDNO：32，SEQIDNO：31和SEQIDNO：34为检测引物的gRNA靶序列组合对TCRA基因的突变效率检测，泳道编号对应gRNA靶序列组合的编号。如表4标识，共转的gRNA其靶序列之间相距一定的距离，理论上双gRNA共同作用会在TCRA基因上形成片段缺失，通过PCR产物电泳，会形成两条大小不同的条带，图8结果与理论相符，说明本方案所选择的gRNA组合能有效突变TCRA基因。

对上述PCR产物片段大小无明显变化的gRNA组合，按照实施例1中5(5)～5(7)的方法进行T7E1的酶切和电泳检测。结果见图9所示：SEQIDNO：3和SEQIDNO：4靶序列之间相距51bp，其gRNA组合共同突变TCRA基因后其PCR产物未形成两条独立条带，但对其通过T7E1酶切进一步验证发现具有较高的突变效率。

本方案所选择的gRNA其靶序列之间的距离覆盖了51-2322bp，同理可证，在实施例1中筛选出来的突变效率较高的靶序列中选取靶序列相距51-2322bp之间的两个gRNA组合，均能有效突变TCRA基因。

对上述组合中随机挑取4组gRNA组合，按照实施例1中5(8)～5(11)的方法进行Sanger测序分析。结果如下表5所示：

表5Sanger测序比较gRNA组合突变效率

实施例3CRISPR/Cas9介导的TCRA基因定点同源重组

将实施例1或者实施例2中筛选出来突变效率较高的gRNA或者gRNA组合，用于CRISPR/Cas9介导的，在TCRA基因特定位点(Cas9切割位点)，整合插入一段外源DNA序列。以下实施例以gRNA靶序列SEQIDNO：3为例，同理可证其他gRNA或者gRNA组合的实施效果。

1、同源重组供体载体构建

(1)以HEK293T细胞基因组为模板，以SEQIDNO：65和SEQIDNO：66为引物扩增上游同源臂，以SEQIDNO：67和SEQIDNO：68为引物增下游同源臂，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收目的片段；

表6TCRA基因靶位点SEQIDNO：3上下游同源臂扩增引物65、66、67、68

引物类型	引物编号	引物序列
			上游同源臂扩增引物-F	SEQIDNO：65	gttctagtggttggctacgtatgctcaaggccttatatcgag
上游同源臂扩增引物-R	SEQIDNO：66	gtacacgcctaccgtcgacctgtgggacaagaggatcag
			下游同源臂扩增引物-F	SEQIDNO：67	actagttctagagcggccgcctgcctattcaccgattttga
下游同源臂扩增引物-R	SEQIDNO：68	actgcaggctctagattcgaatgcgtgagactgacttagtg

(2)提取pDonor-mCMV-EGFP质粒，用SnabI和SalI-HF酶切pDonor-mCMV-EGFP质粒，37℃酶切1h，80℃失活20min；

(3)酶切后的pDonor-mCMV-EGFP和上游同源臂PCR产物进行同源重组，37℃重组30min，冰浴5min；

(4)5μL上述重组产物和20μLTop10大肠杆菌感受态混合后冰浴30min，42℃热击60s，冰上静置5min后加入230mLLB培养基(不加抗生素)，37℃摇床45min，涂板，37℃培养过夜；

(5)从上述平板上分别挑取单菌落接种到500μLLB液体培养基(Amp)中扩大培养4h后测序；

(6扩大培养测序正确(上游同源臂重组到pDonor-mCMV-EGFP载体上)的单菌落并提取质粒，用NotI-HF，37℃酶切1h，然后加入BstBI，65℃酶切1h，酶切后纯化回收；

(7)上述酶切产物与下游同源臂PCR产物进行同源重组，37℃重组30min，冰浴5min；

(8)按本实施例4～5的方法转化Top10大肠杆菌感受态、挑取单菌落，测序鉴定，序列正确的质粒即为同源重组供体载体pDonor-mCMV-EGFP-上下游同源臂(图10)，对其扩大培养和保存，。

2、TCRA基因定点同源重组

(1)将实施例1中3(6)中提取的SEQIDNO：3对应的质粒，与上述同源重组供体质粒共同转染HEK293T细胞，转染方式参照实施例1的4(1)～4(3)；

(2)转化后的细胞培养48小时，收集细胞提取基因组，并测定基因组浓度；

(3)以上述基因组DNA为模板，在上游同源臂的5′端设计上游PCR引物(SEQIDNO：69：5′-CTGTGGCTCTGCATGACTCACTAG-3′)，在外源DNA序列mCMV-EGFP中间设计下游引物(SEQIDNO：70：5′-ATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAG-3′)，进行PCR扩增，PCR产物进行Sanger测序。测序结果见SEQIDNO：71，结果分析见图11所示：5′端126bp为TCRA基因的序列，127-731bp为上游同源臂，732-1266bp为同源重组供体质粒的外源DNA序列的一部分，含mCMV启动子和部分EGFP基因序列。该结果说明，同源重组供体质粒的外源DNA序列已成功整合到TCRA基因的特定位点。

按照本实施例的方法，同理可将嵌合抗原受体(CAR)基因定点同源重组到TCR的特定位点。

SEQIDNO：71：如下：

ATTAAATAGATGTTTATATGGAGAAGCTCTCATTTCTTTCTCAGAAGAGCCTGGCTAGGAAGGTGGATGAGGCACCATATTCATTTTGCAGGTGAAATTCCTGAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGCGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGGTCGACGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTAT

SEQUENCE LISTING

<110>广东赤萌医疗科技有限公司

<120>一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统

<130> 1

<160> 1

<210> 1

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ATTAAATAGA TGTTTATATG GAGAAGCTCT CATTTCTTTC TCAGAAGAGC 50

CTGGCTAGGA AGGTGGATGA GGCACCATAT TCATTTTGCA GGTGAAATTC 100

CTGAGATGTA AGGAGCTGCT GTGACTTGCT CAAGGCCTTA TATCGAGTAA 150

ACGGTAGCGC TGGGGCTTAG ACGCAGGTGT TCTGATTTAT AGTTCAAAAC 200

CTCTATCAAT GAGAGAGCAA TCTCCTGGTA ATGTGATAGA TTTCCCAACT 250

TAATGCCAAC ATACCATAAA CCTCCCATTC TGCTAATGCC CAGCCTAAGT 300

TGGGGAGACC ACTCCAGATT CCAAGATGTA CAGTTTGCTT TGCTGGGCCT 350

TTTTCCCATG CCTGCCTTTA CTCTGCCAGA GTTATATTGC TGGGGTTTTG 400

AAGAAGATCC TATTAAATAA AAGAATAAGC AGTATTATTA AGTAGCCCTG 450

CATTTCAGGT TTCCTTGAGT GGCAGGCCAG GCCTGGCCGT GAACGTTCAC 500

TGAAATCATG GCCTCTTGGC CAAGATTGAT AGCTTGTGCC TGTCCCTGAG 550

TCCCAGTCCA TCACGAGCAG C TGGTTTCTA AGATGCTATT TCCCGTATAA 600

AGCATGAGAC CGTGACTTGC CAGCCCCACA GAGCCCCGCC CTTGTCCATC 650

ACTGGCATCT GGACTCCAGC CTGGGTTGGG GCAAAGAGGG AAATGAGATC 700

ATGTCCTAAC CCTGATCCTC TTGTCCCACA GGTCGACGGT AGGCGTGTAC 750

GGTGGGAGGT CTATATAAGC AGAGCTGGTT TAGTGAACCG TCAGATCACC 800

GGTCGCCACC ATGGTGAGCA AGGGCGAGGA GCTGTTCACC GGGGTGGTGC 850

CCATCCTGGT CGAGCTGGAC GGCGACGTAA ACGGCCACAA GTTCAGCGTG 900

TCCGGCGAGG GCGAGGGCGA TGCCACCTAC GGCAAGCTGA CCCTGAAGTT 950

CATCTGCACC ACCGGCAAGC TGCCCGTGCC CTGGCCCACC CTCGTGACCA 1000

CCCTGACCTA CGGCGTGCAG TGCTTCAGCC GCTACCCCGA CCACATGAAG 1050

CAGCACGACT TCTTCAAGTC CGCCATGCCC GAAGGCTACG TCCAGGAGCG 1100

CACCATCTTC TTCAAGGACG ACGGCAACTA CAAGACCCGC GCCGAGGTGA 1150

AGTTCGAGGG CGACACCCTG GTGAACCGCA TCGAGCTGAA GGGCATCGAC 1200

TTCAAGGAGG ACGGCAACAT CCTGGGGCAC AAGCTGGAGT ACAACTACAA 1250

CAGCCACAAC GTCTAT 1266

Claims (5)

1.一种用于制备可异体移植T细胞的体外的基因编辑方法，其特征在于，该方法包括在CRISPR/Cas9特异性敲除人TCR基因中用于特异性靶向TCR基因的sgRNA，所述sgRNA在TCR基因上的靶序列符合5′-G(21N)NNGRRT-3或者5′-ARRCNN(21N)C-3′的序列排列规则，所述靶向TCR基因的sgRNA以病毒为转染载体，所述方法还包括5′端和3′端带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因，使用时把靶向TCR基因的sgRNA、SaCas9基因、5′端和3′端都带有TCR基因同源臂的嵌合抗原受体基因，三者一起包装到病毒中，以病毒为载体转染细胞；

所述方法还包括以所述人TCR基因α链和β链恒定区作为靶标，筛选靶向TCR基因α链和β链的sgRNA，所述sgRNA在TCR基因上的靶序列满足的配对组合为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：17中的任意一组。

2.根据权利要求1所述的用于制备可异体移植T细胞的体外的基因编辑方法，其特征在于，所述靶向TCR基因的sgRNA以病毒为转染载体，所述病毒转染载体为腺相关病毒、慢病毒、腺病毒、杆状病毒、逆转录病毒中的一种。

3.根据权利要求1所述的用于制备可异体移植T细胞的体外的基因编辑方法，其特征在于，所述TCR基因包含α链和β链，基因改造具体方法为在TCR的α链和β链的一种或两种的CDS序列或恒定区域的相应编码基因的外显子区，利用CRISPR/Cas9进行定点切割，从而使TCR基因失活，达到T细胞表面无TCR受体的目的，编辑后的T细胞在有异体移植过程中避免移植物抗宿主反应。

4.根据权利要求1所述的用于制备可异体移植T细胞的体外的基因编辑方法，其特征在于，所述靶向TCR基因α链和β链的sgRNA筛选包括如下步骤：

步骤1)构建sgRNA的寡核苷酸双链：

S1：根据选择的sgRNA，通过化学合成法合成寡核苷酸链，格式如下：

正义链：5′-G(21N)NNGRRT-3′或者5′-ARRCNN(21N)C-3′，引物不含PAM，

反义链：与正义链互补，分别在正义链引物的5′端加上CACC，在反义链引物5′端加上AAAC，以形成BbsI酶切位点的粘性末端；其中，21N代表靶序列的21个碱基序列；

S2：把正义链引物和反义链引物经过退火，形成带有BbsI酶切位点的粘性末端的双链核苷酸小片段；

步骤2)CRISPR-Cas9载体构建；

步骤3)细胞系转染；

步骤4)突变效率检测。

5.一种基于权利要求1-4中任一项所述的用于制备可异体移植T细胞的体外的基因编辑方法的应用，其特征在于，用外周血或脐带血来源的T细胞，通过权利要求1-4中任一项所述的用于制备可异体移植T细胞的体外的基因编辑方法，制备成一种可异体移植的T细胞。

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