CN110684801A - 转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用昆虫杆状病毒转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法，该方法通过构建含有gRNA、cas9、筛选标记的基因片段、哺乳动物细胞可识别的启动子、转录终止子序列的重组Bacmind质粒，并将其转染sf9细胞，包装获得重组杆状病毒，用其对哺乳动物细胞进行cas9的转导。利用杆状病毒可将大DNA导入哺乳动物细胞，降低cas9/筛选标记基因导入哺乳动物细胞的难度，本发明方法对于cas9的转导效率优异；本发明接近单细胞转导方法，无需反复大量稀释筛选即可找到成功编辑的克隆；所用携带有gRNA/cas9基因的杆状病毒，滴度高，易于保存、复制，可高效重复利用，便于开展相关工作。

Description

转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法

技术领域

本发明属于基因技术领域，具体涉及一种利用昆虫杆状病毒转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法。

背景技术

Cas9基因编辑方法具有使用方便，构建简单的特点，可以覆盖大多数区域的基因编辑需求。然而，该技术目前仍面临如下问题：当质粒较大时，转染的难度相对较大；具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围，而且会导致不同基因位点编辑效率不同；往往需要进行大量的筛选工作。因此，该技术的适用范围受到了一定的制约。

Cas9基因长度为4101bp，且cas9蛋白需要进入细胞核才能发挥作用，因此需要增加核定位信号。通常质粒上还有带有原核及真核的筛选标记基因，加上gRNA表达框等原件，质粒总长度通常在9000bp以上。

现有的cas9传导方法中，通过脂质体、聚合物等常规化学试剂转染难度相对较大，虽然电转能在一定程度上解决转染困难的问题，但是对设备投入较大，不同的细胞电转条件不一样，优化摸索工作量较大。不论何种转染方式，通常对于细胞总数量和细胞密度都有一定的要求，转染完成后，要进行大量的细胞筛选，才能得到编辑的单克隆细胞。因为cas9蛋白非常大，慢病毒包装效率也非常困难，且由于慢病毒的整合特性，可能会造成cas9的恒定表达，增加脱靶的风险。无论是瞬时转染，电转，慢病毒包装，都存在较大的困难，效率极低，往往需要借助流式进行大量的筛选或者利用抗性基因进行筛选。

综上所述，现有技术亟需克服上述现有技术中Cas9基因编辑技术中存在的缺点。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种适于大质粒转导的、通用于多种动物细胞的和操作简单的将cas9基因转导到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法。

为了实现上述目的，本申请提供了一种利用昆虫杆状病毒转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)向Bacmid质粒中插入gRNA、cas9、筛选标记的基因片段、哺乳动物细胞可识别的启动子、转录终止子序列，构建得到重组Bacmid质粒；

(2)将所得重组Bacmid质粒转染sf9细胞，包装获得重组杆状病毒，收集含有病毒粒子的sf9细胞上清；

(3)将哺乳动物细胞以每孔不超过10个置于细胞培养板中，然后加入上述重组杆状病毒毒液，进行培养；

(4)将发生了转导的细胞进行稀释，挑取单克隆，确认基因编辑效果，获得编辑成功的单克隆细胞株。

申请号为201680010946.3的中国专利申请公布了一种向哺乳动物的受精卵导入编码Cas9蛋白的mRNA(Cas9 mRNA)的方法。该专利之前，利用电穿孔对于大鼠受精卵进行cas9导入时，所得的基因编辑效率小于9％。该专利较好的实现了将cas9导入哺乳动物细胞的效果。不过，由于电穿孔对于设备的要求较高，并且在转染之后还需进行大量的筛选工作，总体的工作难度和效率仍然并不理想。

为了解决病毒载体的有限包装能力和递送效率低的问题，本领域人员还研究了双载体用于cas9的递送和表达。如韩国的基础科学研究院在其专利PCT/KR2015/012503中公布了使用由两个载体表达的Cas9蛋白质调节基因表达的方法，该专利通过了载体包装Cas9蛋白质的限制，并且通过构建单独表达Cas9蛋白质的两个经切割的结构域的重组载体以及递送待在细胞中表达的所构建重组载体而增加了Cas9蛋白质的细胞内递送的效率。不过该方法在构建载体时，较为复杂，且大多数哺乳动物细胞即使是转染小质粒，转染效率也不高，该方法虽然可以在一定程度上克服cas9转染困难的问题，但是程度有限。

Bacmid质粒为杆状病毒质粒，英文全称为Baculovirus plasmid，其是带有杆状病毒基因组的质粒，可在细菌和昆虫细胞之间穿梭。昆虫杆状病毒是一类双链环状超螺旋DNA病毒(DNA分子长度为82～180kbp)，是一种公认的适用于表达大基因片段的工具。本发明发现，将带有gRNA、cas9、筛选标记的基因片段及哺乳动物细胞可识别的启动子(如CMV)和转录终止子序列，插入到杆状病毒bacmid质粒，构建重组bacmid质粒并转染入sf9细胞进行包装获得重组bacmid质粒之后，将重组质粒导入哺乳动物细胞，可以显著的提高转导效率。同时，本发明由于采用的是一种接近单细胞转导的方法，无需反复大量稀释筛选即可找到成功编辑的克隆，这相对于如中国专利201680010946.3等现有技术的方法而言，具有极大的便利性。

对于本领域技术人员而言，不难理解的是，被昆虫杆状病毒转导到哺乳细胞内的bacmid质粒DNA含有完整的能在哺乳动物细胞内表达gRNA、cas9蛋白的原件。由于昆虫杆状病毒对于哺乳动物细胞完全没有毒性，因此可以将细胞稀释到极低密度(数个/孔)后进行转导操作，不仅转导效率高而且操作简单、成本低，并且后期无需进行大量的筛选。

如本发明的一个实施例所示，本发明在向哺乳动物细胞(293T细胞、Hela细胞、Hepg2细胞和MCF-7细胞)传导cas9时，效率高达80％以上，显示出优异的传导效率。同时，本发明适于多种哺乳动物细胞，显著的降低了cas9基因编辑的操作难度，扩大了其应用的范围。

另外，本领域技术人员容易理解的是，由于本发明采用的是杆状病毒，其易于保存、复制，可高效的进行重复利用，便于相关工作的开展。

作为本发明的一个优先的实施方案，步骤(1)中，还向Bacmid质粒中插入昆虫细胞能识别的启动子和带有有跨膜肽的vsv-g蛋白基因。vsv-g是源于水泡性口炎病毒的融合性外壳G糖蛋白，vsv-g蛋白基因的插入，使得vsv-g蛋白能表达到杆状病毒表面，提高杆状病毒转导效率也更广泛的应用于不同的细胞。

作为本发明一个可选的实施方案，所述哺乳动物细胞可识别的启动子包括actin启动子或者cmv启动子；和/或，所述昆虫细胞能识别的启动子包括polyhedrin启动子或p10启动子。

在本发明中，所用的启动子不限于u6启动子、cmv启动子和actin启动子。只要能在哺乳动物细胞内能发挥作用的以及属于IRES(Internal ribosome entry site)的均可。

在本发明中，作为可选的技术方案，所述哺乳动物细胞可选自293T细胞、Hela细胞、Hepg2细胞或MCF-7细胞。但适于本发明的哺乳动物细胞不限于上述几种，适用的细胞还包括但不限于下述网址记载的细胞：

https：//www.sigmaaldrich.com/china-mainland/zh/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/learning-center/lentivirus-cell-line.html

作为本发明的一个可选的技术方案，所述重组Bacmid质粒的制备方法优选但不限于BAC to BAC，方法如下：

向pFastbac1载体pH启动子后面插入带有跨膜肽的vsv-g蛋白基因；在pFastbac1载体的庆大霉素(英文名：gentamicin)序列片段与polyherdri启动子原件之间插入u6启动子，gRNA scaffold、pol III终止子，CMV-cas9、筛选标记片段(EGFP)和bGH poly(a)原件；在u6启动子与gRNA scaffold序列之间插入gRNA靶序列，构建穿梭质粒；然后将穿梭质粒转化至大肠杆菌中，筛选获得重组Bacmid。

作为本发明可选的技术方案，在制备重组Bacmid质粒时，所述所述筛选标记片段包括EGFP、mCherry、zeocin、潮霉素或者新霉素基因序列片段，优选EGFP、mCherry等可视化标签；所述大肠杆菌为DH10bac菌株。

作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中，加入所述重组杆状病毒毒液之后，先培养48-72h，然后换新鲜培养基

作为本发明优选的技术方案，所述方法在步骤(4)之后还包括步骤：感染48到72h后，稀释成单克隆，继续培养细胞增殖到足够量以便于基因编辑效果分析；将发生了转导的孔的细胞稀释，挑取单克隆，进一步确认基因编辑效果。具体的，在进行上述步骤时，通过观察EGP或者mCherry荧光，确定转导效率，可将发生了转导的孔的细胞稀释至96孔板(0.5细胞/孔)，标记成功转导的单克隆，继续培养，待细胞增殖到足量，进一步确认基因编辑效果并挑选最佳的编辑成功的单克隆细胞株。

本发明的有益效果：

本发明的方法对于cas9的传导效率优异，可将大DNA导入哺乳动物细胞，降低大的DNA导入哺乳动物细胞的难度；本发明接近单细胞转导的方法，无需反复大量稀释筛选即可找到成功编辑的克隆；本发明所用杆状病毒，易于保存、复制，可高效重复利用，便于相关工作的开展。

附图说明

图1和图2为本发明一个实施例采用的质粒的基本元件的示意图；

图3为pFastbac1载体的示意图；

图4为本发明实施例1构建的完整质粒载体图谱；

图5为tp53对照样本sanger测序图；

图6为tp53基因敲除样本sanger测序阳性图(插入单碱基T)；

图7为tp53基因敲除WB实验结果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1.1原料

pFastbac1载体(如图3所示)、vsv-g基因、u6启动子、cas9蛋白基因、庆大霉素基因、poly(a)、gRNA靶序列、大肠杆菌DH10bac、质粒抽提试剂盒、293T细胞、Hela细胞、Hepg2细胞和MCF-7细胞、sf9细胞、细胞培养基、96孔板。

上述单元的基因序列见序列表信息，其中SEQ ID No.1是所构建的完整的载体序列信息；SEQ ID No.2是cas9-egfp序列信息；SEQ ID No.3是u6启动子+mcs+gRNA scanfold+pol III终止子序列信息；SEQ ID No.4是CMV enhancer+cmv启动子序列信息；SEQ IDNo.5是bGH poly(A)序列信息；SEQ ID No.6是vsv-g序列信息。

1.2构建方法

(1)在pFastbac1载体的pH启动子后面插入带有跨膜肽的vsv-g基因；

(2)在庆大霉素(gentamicin)与polyherdrin启动子原件之间插入u6启动子、cas9蛋白基因、EGFP和poly(a)原件。在U6启动子与gRNA scaffold序列之间带有多克隆位点，用于插入gRNA靶序列；

(3)向上述改造好的载体上插入gRNA靶序列，构建好穿梭质粒；

(4)将穿梭质粒转化大肠杆菌DH10bac，筛选获得重组bacmid质粒；

(5)提取bacmid质粒并转染sf9细胞，包装获得重组杆状病毒，收集含有病毒粒子的sf9细胞上清；

(6)将状态良好的293T细胞、Hela细胞、Hepg2细胞和MCF-7细胞分别稀释到96孔板，每孔1～10个细胞；24h后，往每孔细胞中加入杆状杆状病毒毒液，培养48-72h后换新鲜培养基。

(7)观察荧光细胞比例，以及亮度，发出荧光的细胞即为bacmid成功转导的细胞，选择转导效率最高的孔的细胞稀释至96孔板(0.5细胞/孔)，继续培养到足量细胞，进一步确认基因编辑效果，获得编辑成功的单克隆细胞株。通过测试，转导效率均达到80％以上。

1.3检测方法

A.基因组DNA提取→PCR→sanger测序

B.WB，IHC等检测方法

1.4基因敲除实例

tp53基因敲除

目的外显子序列-外显子3：

TCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTG靶点序列：GGATGATTTGATGCTGTCCC NGG

穿梭质粒构建引物：

TP53-KO-23-F：5 CACCG GGATGATTTGATGCTGTCCC

TP53-KO-23-R：5 AAAC GGGACAGCATCAAATCATCC C

基因组PCR扩增引物：

TP53-F：5 TCCATGGGACTGACTTTCTGC

TP53-R：5 AGAAATGCAGGGGGATACGG

基因组DNA PCR产物序列：

TCCATGGGACTGACTTTCTGCTCTTGTCTTTCAGACTTCCTGAAAACAACGTTCTGGTAAGGACAAGGGTTGGGCTGGGGACCTGGAGGGCTGGGGACCTGGAGGGCTGGGGGGCTGGGGGGCTGAGGACCTGGTCCTCTGACTGCTCTTTTCACCCATCTACAGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGGTCAGTTGCCCTGAGGGGCTGGCTTCCATGAGACTTCAATGCCTGGCCGTATCCCCCTGCATTTCT

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 武汉华美生物工程有限公司

<120> 转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12489

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 60

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 120

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 180

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 240

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 300

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 360

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 420

aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat 480

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 540

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 600

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 660

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 720

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 780

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 840

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 900

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 960

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 1020

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1080

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 1140

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 1200

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1260

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 1320

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 1380

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 1440

cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 1500

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1560

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 1620

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 1680

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 1740

agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 1800

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 1860

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 1920

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 1980

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2040

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2100

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2160

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2220

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2280

ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2340

cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg 2400

cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct 2460

ggcaaaatcg gttacggttg agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga 2520

caataaagtc ttaaactgaa caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag 2580

acagaatagt tgtaaactga aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt 2640

tgttatggct aaagcaaact cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga 2700

ggggcgtggc caagggcatg gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac 2760

aactccgcgg ccgggaagcc gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg 2820

tcgatatcaa agtgcatcac ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg 2880

ggatcgtcac cgtaatctgc ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca 2940

tgcttgagga gattgatgag cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact 3000

gcgagatcat agatatagat ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc 3060

gcgagagcgc caacaaccgc ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta 3120

cggagcaagt tcccgaggta atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct 3180

ccgaactcac gaccgaaaag atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg 3240

agcctacatg tgcgaatgat gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg 3300

ccctgctgcg taacatcgtt gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca 3360

tcgacccacg gcgtaacgcg cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa 3420

acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa 3480

ggttctggac cagttgcgtg agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca 3540

ggcttatgtc aactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac 3600

cttgggcagc agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc 3660

ggtctccacg catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg 3720

cacggatctg ccctggcttc aggagatcgg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt 3780

tgcatatacg atacaaggct gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa 3840

agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt 3900

taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt 3960

tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac gaaacaccgg gtcttcgaga agacctgttt 4020

tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca 4080

ccgagtcggt gcttttttgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg 4140

tttttagcgc gtgcgccaat tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg ttacataact 4200

tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt 4260

aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 4320

cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 4380

taaatggccc gcctggcatt gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 4440

gtacatctac gtattagtca tcgctattac catgggtgat gcggttttgg cagtacatca 4500

atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 4560

atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 4620

ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 4680

tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata 4740

gggagaccca agctggctag ccaccatgga ctataaggac cacgacggag actacaagga 4800

tcatgatatt gattacaaag acgatgacga taagatggcc ccaaagaaga agcggaaggt 4860

cggtatccac ggagtcccag cagccgacaa gaagtacagc atcggcctgg acatcggcac 4920

caactctgtg ggctgggccg tgatcaccga cgagtacaag gtgcccagca agaaattcaa 4980

ggtgctgggc aacaccgacc ggcacagcat caagaagaac ctgatcggag ccctgctgtt 5040

cgacagcggc gaaacagccg aggccacccg gctgaagaga accgccagaa gaagatacac 5100

cagacggaag aaccggatct gctatctgca agagatcttc agcaacgaga tggccaaggt 5160

ggacgacagc ttcttccaca gactggaaga gtccttcctg gtggaagagg ataagaagca 5220

cgagcggcac cccatcttcg gcaacatcgt ggacgaggtg gcctaccacg agaagtaccc 5280

caccatctac cacctgagaa agaaactggt ggacagcacc gacaaggccg acctgcggct 5340

gatctatctg gccctggccc acatgatcaa gttccggggc cacttcctga tcgagggcga 5400

cctgaacccc gacaacagcg acgtggacaa gctgttcatc cagctggtgc agacctacaa 5460

ccagctgttc gaggaaaacc ccatcaacgc cagcggcgtg gacgccaagg ccatcctgtc 5520

tgccagactg agcaagagca gacggctgga aaatctgatc gcccagctgc ccggcgagaa 5580

gaagaatggc ctgttcggaa acctgattgc cctgagcctg ggcctgaccc ccaacttcaa 5640

gagcaacttc gacctggccg aggatgccaa actgcagctg agcaaggaca cctacgacga 5700

cgacctggac aacctgctgg cccagatcgg cgaccagtac gccgacctgt ttctggccgc 5760

caagaacctg tccgacgcca tcctgctgag cgacatcctg agagtgaaca ccgagatcac 5820

caaggccccc ctgagcgcct ctatgatcaa gagatacgac gagcaccacc aggacctgac 5880

cctgctgaaa gctctcgtgc ggcagcagct gcctgagaag tacaaagaga ttttcttcga 5940

ccagagcaag aacggctacg ccggctacat tgacggcgga gccagccagg aagagttcta 6000

caagttcatc aagcccatcc tggaaaagat ggacggcacc gaggaactgc tcgtgaagct 6060

gaacagagag gacctgctgc ggaagcagcg gaccttcgac aacggcagca tcccccacca 6120

gatccacctg ggagagctgc acgccattct gcggcggcag gaagattttt acccattcct 6180

gaaggacaac cgggaaaaga tcgagaagat cctgaccttc cgcatcccct actacgtggg 6240

ccctctggcc aggggaaaca gcagattcgc ctggatgacc agaaagagcg aggaaaccat 6300

caccccctgg aacttcgagg aagtggtgga caagggcgct tccgcccaga gcttcatcga 6360

gcggatgacc aacttcgata agaacctgcc caacgagaag gtgctgccca agcacagcct 6420

gctgtacgag tacttcaccg tgtataacga gctgaccaaa gtgaaatacg tgaccgaggg 6480

aatgagaaag cccgccttcc tgagcggcga gcagaaaaag gccatcgtgg acctgctgtt 6540

caagaccaac cggaaagtga ccgtgaagca gctgaaagag gactacttca agaaaatcga 6600

gtgcttcgac tccgtggaaa tctccggcgt ggaagatcgg ttcaacgcct ccctgggcac 6660

ataccacgat ctgctgaaaa ttatcaagga caaggacttc ctggacaatg aggaaaacga 6720

ggacattctg gaagatatcg tgctgaccct gacactgttt gaggacagag agatgatcga 6780

ggaacggctg aaaacctatg cccacctgtt cgacgacaaa gtgatgaagc agctgaagcg 6840

gcggagatac accggctggg gcaggctgag ccggaagctg atcaacggca tccgggacaa 6900

gcagtccggc aagacaatcc tggatttcct gaagtccgac ggcttcgcca acagaaactt 6960

catgcagctg atccacgacg acagcctgac ctttaaagag gacatccaga aagcccaggt 7020

gtccggccag ggcgatagcc tgcacgagca cattgccaat ctggccggca gccccgccat 7080

taagaagggc atcctgcaga cagtgaaggt ggtggacgag ctcgtgaaag tgatgggccg 7140

gcacaagccc gagaacatcg tgatcgaaat ggccagagag aaccagacca cccagaaggg 7200

acagaagaac agccgcgaga gaatgaagcg gatcgaagag ggcatcaaag agctgggcag 7260

ccagatcctg aaagaacacc ccgtggaaaa cacccagctg cagaacgaga agctgtacct 7320

gtactacctg cagaatgggc gggatatgta cgtggaccag gaactggaca tcaaccggct 7380

gtccgactac gatgtggacc atatcgtgcc tcagagcttt ctgaaggacg actccatcga 7440

caacaaggtg ctgaccagaa gcgacaagaa ccggggcaag agcgacaacg tgccctccga 7500

agaggtcgtg aagaagatga agaactactg gcggcagctg ctgaacgcca agctgattac 7560

ccagagaaag ttcgacaatc tgaccaaggc cgagagaggc ggcctgagcg aactggataa 7620

ggccggcttc atcaagagac agctggtgga aacccggcag atcacaaagc acgtggcaca 7680

gatcctggac tcccggatga acactaagta cgacgagaat gacaagctga tccgggaagt 7740

gaaagtgatc accctgaagt ccaagctggt gtccgatttc cggaaggatt tccagtttta 7800

caaagtgcgc gagatcaaca actaccacca cgcccacgac gcctacctga acgccgtcgt 7860

gggaaccgcc ctgatcaaaa agtaccctaa gctggaaagc gagttcgtgt acggcgacta 7920

caaggtgtac gacgtgcgga agatgatcgc caagagcgag caggaaatcg gcaaggctac 7980

cgccaagtac ttcttctaca gcaacatcat gaactttttc aagaccgaga ttaccctggc 8040

caacggcgag atccggaagc ggcctctgat cgagacaaac ggcgaaaccg gggagatcgt 8100

gtgggataag ggccgggatt ttgccaccgt gcggaaagtg ctgagcatgc cccaagtgaa 8160

tatcgtgaaa aagaccgagg tgcagacagg cggcttcagc aaagagtcta tcctgcccaa 8220

gaggaacagc gataagctga tcgccagaaa gaaggactgg gaccctaaga agtacggcgg 8280

cttcgacagc cccaccgtgg cctattctgt gctggtggtg gccaaagtgg aaaagggcaa 8340

gtccaagaaa ctgaagagtg tgaaagagct gctggggatc accatcatgg aaagaagcag 8400

cttcgagaag aatcccatcg actttctgga agccaagggc tacaaagaag tgaaaaagga 8460

cctgatcatc aagctgccta agtactccct gttcgagctg gaaaacggcc ggaagagaat 8520

gctggcctct gccggcgaac tgcagaaggg aaacgaactg gccctgccct ccaaatatgt 8580

gaacttcctg tacctggcca gccactatga gaagctgaag ggctcccccg aggataatga 8640

gcagaaacag ctgtttgtgg aacagcacaa gcactacctg gacgagatca tcgagcagat 8700

cagcgagttc tccaagagag tgatcctggc cgacgctaat ctggacaaag tgctgtccgc 8760

ctacaacaag caccgggata agcccatcag agagcaggcc gagaatatca tccacctgtt 8820

taccctgacc aatctgggag cccctgccgc cttcaagtac tttgacacca ccatcgaccg 8880

gaagaggtac accagcacca aagaggtgct ggacgccacc ctgatccacc agagcatcac 8940

cggcctgtac gagacacgga tcgacctgtc tcagctggga ggcgacaaaa ggccggcggc 9000

cacgaaaaag gccggccagg caaaaaagaa aaaggaattc ggcagtggag agggcagagg 9060

aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc ccagtgagca agggcgagga 9120

gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa 9180

gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt 9240

catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 9300

cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc 9360

cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta 9420

caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa 9480

gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa 9540

cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa 9600

gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac 9660

ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc 9720

cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc 9780

cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaggaa ttctaactag agctcgctga 9840

tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 9900

tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 9960

tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 10020

ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagt atactccgga atattaatag 10080

atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc 10140

gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca 10200

tcgggcgcgg atccatgaag tgcctgctgt acctggcctt cctgttcatc ggcgtgaact 10260

gcaagttcac aatcgtgttc cctcacaacc agaaaggcaa ctggaagaac gtgcccagca 10320

actaccacta ctgtcctagc tcctccgatc tgaactggca caacgacctg atcggcaccg 10380

ccctgcaggt caagatgcct aagagtcaca aggccatcca ggccgatggc tggatgtgcc 10440

acgccagcaa gtgggtcaca acctgcgact tccggtggta cggccctaag tacattacac 10500

acagcatccg gagctttacc cctagcgtgg aacagtgcaa agaatccatc gagcaaacaa 10560

agcagggcac ctggcttaac cccggcttcc ccccccagag ctgcggctac gccaccgtga 10620

cagacgccga ggccgtgatc gtgcaggtga cccctcacca cgtgctggtg gacgagtaca 10680

ccggcgagtg ggtggatagc cagttcatca acggcaagtg cagcaactac atctgcccta 10740

cagtgcacaa tagcaccacc tggcattctg attacaaggt gaagggcctc tgtgattcta 10800

atctgataag catggacatc acattcttta gcgaggatgg agaactgtct agcctgggca 10860

aagagggaac aggattcaga agcaattact tcgcctacga gacaggcgga aaagcttgta 10920

aaatgcagta ctgcaagcac tggggcgtta gactgccatc tggcgtgtgg ttcgagatgg 10980

ccgacaagga cctgttcgcc gctgctagat tccctgagtg ccccgagggc agcagcatct 11040

ccgcccctag ccagacctca gtggacgtgt ccctgatcca agatgtggaa agaatcctgg 11100

actacagcct ttgccaggag acctggtcca aaatcagagc cggcctgcct atcagccctg 11160

tggacctgtc atatctggcc cctaagaacc ctggaaccgg ccccgctttt accatcatta 11220

acggcacact gaaatacttt gaaaccagat acatcagggt ggacatcgcc gcccctattc 11280

tgagtagaat ggtgggaatg ataagcggca ccacaaccga gcgggaactg tgggacgact 11340

gggccccata cgaggacgtt gaaatcggcc ctaacggcgt gctgagaacc agctctggtt 11400

ataagttccc tctgtacatg atcggacacg gcatgctgga cagcgatctg cacctgagct 11460

ccaaggccca ggtgttcgag cacccccaca tccaggacgc tgccagccaa ctgcccgacg 11520

atgagagcct gttcttcggc gacaccgggc tgagcaagaa tcctatcgag ctggtggaag 11580

gctggttttc tagctggaag agcagcatcg cctctttctt cttcatcatc ggcctgatca 11640

tcggtctgtt tctggtcctg cgggtgggca tccacctgtg tatcaagctg aagcacacca 11700

agaaaagaca gatctacaca gatatcgaga tgaacagact gggaaagtga cggtccgaag 11760

cgcgcggaat tcaaaggcct acgtcgacga gctcactagt cgcggccgct ttcgaatcta 11820

gagcctgcag tctcgaggca tgcggtacca agcttgtcga gaagtactag aggatcataa 11880

tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 11940

tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 12000

atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 12060

attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atctgatcac 12120

tgcttgagcc taggagatcc gaaccagata agtgaaatct agttccaaac tattttgtca 12180

tttttaattt tcgtattagc ttacgacgct acacccagtt cccatctatt ttgtcactct 12240

tccctaaata atccttaaaa actccatttc cacccctccc agttcccaac tattttgtcc 12300

gcccacagcg gggcattttt cttcctgtta tgtttttaat caaacatcct gccaactcca 12360

tgtgacaaac cgtcatcttc ggctactttt tctctgtcac agaatgaaaa tttttctgtc 12420

atctcttcgt tattaatgtt tgtaattgac tgaatatcaa cgcttatttg cagcctgaat 12480

ggcgaatgg 12489

<210> 2

<211> 5061

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat 60

gacgataaga tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc 120

gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 180

accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 240

agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 300

acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 360

ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 420

gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 480

atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 540

ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 600

atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 660

gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 720

aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 780

ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 840

attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 900

gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 960

atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 1020

ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 1080

atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1140

cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1200

tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1260

aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1320

cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1380

attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1440

aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1500

ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1560

gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1620

ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1680

aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1740

ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1800

aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1860

ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1920

aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1980

accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 2040

ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 2100

ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2160

ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2220

ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2280

gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2340

aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2400

gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2460

aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2520

gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2580

atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2640

gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2700

aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2760

tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2820

aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2880

gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2940

aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 3000

ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 3060

caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3120

cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3180

atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3240

atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3300

ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3360

accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3420

acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3480

agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3540

tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3600

gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3660

ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3720

tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3780

aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3840

tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3900

cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3960

ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 4020

atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 4080

gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4140

gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4200

ctgtctcagc tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 4260

aagaaaaagg aattcggcag tggagagggc agaggaagtc tgctaacatg cggtgacgtc 4320

gaggagaatc ctggcccagt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 4380

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 4440

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 4500

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 4560

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 4620

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 4680

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 4740

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 4800

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 4860

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 4920

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 4980

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 5040

gagctgtaca aggaattcta a 5061

<210> 3

<211> 349

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgctttttt 349

<210> 4

<211> 584

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 420

ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480

ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 540

tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agct 584

<210> 5

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggctgtg ccttctagtt 240

gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 300

ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 360

ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 420

ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg 450

<210> 6

<211> 1536

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaagtgcc tgctgtacct ggccttcctg ttcatcggcg tgaactgcaa gttcacaatc 60

gtgttccctc acaaccagaa aggcaactgg aagaacgtgc ccagcaacta ccactactgt 120

cctagctcct ccgatctgaa ctggcacaac gacctgatcg gcaccgccct gcaggtcaag 180

atgcctaaga gtcacaaggc catccaggcc gatggctgga tgtgccacgc cagcaagtgg 240

gtcacaacct gcgacttccg gtggtacggc cctaagtaca ttacacacag catccggagc 300

tttaccccta gcgtggaaca gtgcaaagaa tccatcgagc aaacaaagca gggcacctgg 360

cttaaccccg gcttcccccc ccagagctgc ggctacgcca ccgtgacaga cgccgaggcc 420

gtgatcgtgc aggtgacccc tcaccacgtg ctggtggacg agtacaccgg cgagtgggtg 480

gatagccagt tcatcaacgg caagtgcagc aactacatct gccctacagt gcacaatagc 540

accacctggc attctgatta caaggtgaag ggcctctgtg attctaatct gataagcatg 600

gacatcacat tctttagcga ggatggagaa ctgtctagcc tgggcaaaga gggaacagga 660

ttcagaagca attacttcgc ctacgagaca ggcggaaaag cttgtaaaat gcagtactgc 720

aagcactggg gcgttagact gccatctggc gtgtggttcg agatggccga caaggacctg 780

ttcgccgctg ctagattccc tgagtgcccc gagggcagca gcatctccgc ccctagccag 840

acctcagtgg acgtgtccct gatccaagat gtggaaagaa tcctggacta cagcctttgc 900

caggagacct ggtccaaaat cagagccggc ctgcctatca gccctgtgga cctgtcatat 960

ctggccccta agaaccctgg aaccggcccc gcttttacca tcattaacgg cacactgaaa 1020

tactttgaaa ccagatacat cagggtggac atcgccgccc ctattctgag tagaatggtg 1080

ggaatgataa gcggcaccac aaccgagcgg gaactgtggg acgactgggc cccatacgag 1140

gacgttgaaa tcggccctaa cggcgtgctg agaaccagct ctggttataa gttccctctg 1200

tacatgatcg gacacggcat gctggacagc gatctgcacc tgagctccaa ggcccaggtg 1260

ttcgagcacc cccacatcca ggacgctgcc agccaactgc ccgacgatga gagcctgttc 1320

ttcggcgaca ccgggctgag caagaatcct atcgagctgg tggaaggctg gttttctagc 1380

tggaagagca gcatcgcctc tttcttcttc atcatcggcc tgatcatcgg tctgtttctg 1440

gtcctgcggg tgggcatcca cctgtgtatc aagctgaagc acaccaagaa aagacagatc 1500

tacacagata tcgagatgaa cagactggga aagtga 1536

Claims (8)

1.一种利用昆虫杆状病毒转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)向Bacmid质粒中插入gRNA、cas9、筛选标记的基因片段、哺乳动物细胞可识别的启动子、转录终止子序列，构建得到重组Bacmid质粒；

(2)将所得重组Bacmid质粒转染sf9细胞，包装获得重组杆状病毒，收集含有病毒粒子的sf9细胞上清；

(3)将哺乳动物细胞以每孔不超过10个置于细胞培养板中，然后加入上述重组杆状病毒毒液，进行培养；

(4)将发生了转导的细胞进行稀释，挑取单克隆，确认基因编辑效果，获得编辑成功的单克隆细胞株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，还向Bacmid质粒中插入昆虫细胞能识别的启动子和带有跨膜肽的vsv-g蛋白基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞可识别的启动子包括actin启动子或者cmv启动子；和/或，所述昆虫细胞能识别的启动子包括polyhedrin启动子或p10启动子。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括293T细胞、Hela细胞、Hepg2细胞或MCF-7细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组Bacmid质粒的制备方法为：

向pFastbac1载体pH启动子后面插入带有跨膜肽的vsv-g蛋白基因；在pFastbac1载体的庆大霉素序列片段与polyherdrin启动子原件之间插入u6启动子、多克隆位点、gRNAscaffold、CMV启动子、cas9、筛选标记基因和poly(a)原件；在u6启动子与gRNA scaffold序列之间利用多克隆位点插入gRNA靶序列，构建穿梭质粒；然后将穿梭质粒转化至大肠杆菌中，筛选获得重组Bacmid。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在制备重组Bacmid质粒时，所述筛选标记片段包括EGFP、mCherry、zeocin、潮霉素或者新霉素基因序列片段；所述大肠杆菌为DH10bac菌株。

7.根据权利要求1、2、3、5或6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，加入所述重组杆状病毒毒液之后，先培养48-72h，然后换新鲜培养基。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(4)之后还包括步骤：感染48到72h后，稀释成单克隆，继续培养细胞增殖到足够量以便于基因编辑效果分析；将发生了转导的孔的细胞稀释，挑取单克隆，进一步确认基因编辑效果。

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