CN109402109B - 一种改进的重叠延伸pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改进的重叠延伸PCR方法，本发明通过添加引物，在重叠延伸PCR过程中能利用引物进行指数扩增，有效提高克隆效率和插入片段的长度，如实施例1所示，传统方法无法获得目的克隆，而本发明方法克隆数提高约10倍的同时阳性率为50％；能在载体同一位置同时插入多个片段；能在载体不同位置同时插入、删除及置换多个片段。

Description

一种改进的重叠延伸PCR方法

(一)技术领域

本发明涉及一种单位点及多位点插入、删除及置换的突变及大片段克隆方法。

(二)背景技术

经典的目的基因克隆方法依赖于限制性内切酶酶切以及连接酶连接，该方法需要载体和目的片段具有相应的酶切位点，因此目的基因的克隆位点受到酶切位点的限制。利用重叠延伸PCR能够将目的基因克隆到载体的任意位点，但该方法只能进行线性扩增，克隆效率随着克隆片段的增大而急剧下降，最大只能克隆6.7kb左右的片段到载体上。

传统的重叠延伸克隆方法如图1中A所示：该方法首先设计一对嵌合引物，引物的3’端与目的基因配对，引物的5’则与载体的克隆位点配对，用这对引物扩增目的基因片段后，目的基因片段上就有了能和载体配对的区域；接着把目的基因片段与载体混合后，经过变性、退火和延伸，此时目的基因片段与载体配对区域结合后能作为引物延伸，从而获得载体与目的基因片段融合的大片段，经过多轮循环；最后两条互补的融合大片段能够形成带有切刻的环状双链DNA，用DpnI限制性内切酶去除原始质粒后，转化可得含有目的基因的质粒。该方法的扩增是线性的，不是指数扩增，因此扩增效率不高，最大克隆片段大约是6.7kb。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种单位点及多位点插入、删除及置换的突变及大片段克隆方法，通过设计额外的引物，在重叠延伸PCR过程中加入引物，能够使载体和目的基因的延伸产物被指数扩增，再利用T4 DNA聚合酶等具有外切核酸酶活性的酶处理，可以有效提高大片段的克隆效率。本发明方法不仅可以进行单位点的DNA片段插入，删除和置换，也可以同时进行多片段在多位点的插入，删除和置换。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种改进的重叠延伸PCR方法，所述方法为下列之一：(1)当克隆单个目的基因片段至载体时：以待克隆目的基因为模板，设计两端分别与目的基因和载体有14bp及以上重叠的引物进行第一轮PCR扩增，以第一轮PCR产物和载体为模板，以一端与目的基因有14bp及以上重叠、另一端与载体有14bp及以上重叠的引物进行第二轮PCR扩增，获得目的基因和载体的融合产物；(2)当克隆两个及以上目的基因片段到载体的一个位点时，分别根据各个目的基因设计引物，第一个目的基因和最后一个目的基因的各自一条引物两端分别与载体和目的基因有14bp及以上重叠，相邻两个目的基因的一条引物间有14bp及以上重叠；(3)当克隆两个及以上目的基因片段到载体的不同位点时，每个目的基因片段引物的两端均与载体有14bp及以上重叠区域。

更进一步，本发明所述方法为下列之一：(1)当克隆单个目的基因片段至载体时：以含待克隆目的基因的DNA为模板，以引物P1、引物P2进行第一轮PCR扩增，获得第一轮PCR扩增产物；再以第一轮PCR扩增产物和载体为模板，以引物P1和引物P3进行第二轮PCR扩增，获得目的基因和载体的融合产物；所述引物P1和引物P2的3′端均与待克隆基因有14bp及以上长度相匹配，5′端均与载体有14bp及以上长度相匹配；所述引物P3的3′端与载体有15bp及以上长度相匹配，其5’端与引物P1有14bp及以上长度相匹配；(2)当克隆两个及以上目的基因片段到载体的一个位点时，分别以引物P1+引物P2，引物P3+引物P4，P5+P6……和引物PN-1+PN进行第一轮PCR扩增，分别获得多个第一轮PCR扩增产物，再以这些第一轮PCR扩增产物和载体为模板，以引物P2+引物P3，或引物P4+引物P5……，或引物PN-2+引物PN-1进行第二轮PCR扩增，获得多个目的基因同时和载体融合的产物；所述引物P1及PN的3′端均与待克隆目的基因或待突变位点附近有14bp及以上长度相匹配，5′端均与载体有14bp及以上长度相匹配；引物P2和PN-1的3′端均与待克隆目的基因或待突变位点附近有14bp及以上长度相匹配，它们的5′端分别与P3和PN-2有14bp及以上长度相匹配，以此类推，中间的片段的一条引物分别与相邻的片段引物有14bp及以上的长度相匹配；(3)当克隆两个及以上片段到载体的不同位点时，分别以引物P1+引物P2，引物P3+引物P4……，和PN-1+PN进行第一轮PCR扩增，获得两个第一轮PCR扩增产物，再以第一轮PCR扩增产物和载体为模板，以引物P1+P3′，引物P3+P5′……和PN-1+P1′进行第二轮PCR扩增，获得多个目的基因同时融合到载体的不同位点的产物；所述引物P1、P2，P3、P4……PN-1、PN的3′端均与待克隆基因或待突变位点附近有14bp及以上长度相匹配，5′端均与载体有14bp及以上长度相匹配；引物P1′、P3′……和PN-1′的3′端均与载体或待突变位点附近有14bp及以上长度相匹配，5′端与分别与引物P1、P3……和PN-1有14bp及以上长度相匹配。

进一步，所述载体为本领域公知的任意载体。

进一步，所述克隆单个目的基因片段到载体时，改进的重叠延伸PCR方法以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒(System Biosciences,LLC)为模板，用引物P1(此处为Cas9-cGFPf)和引物P2(cGFP-WPREr)进行第一轮PCR扩增，获得大小为1336bp的copGFP-WPRE片段(SEQ ID NO.2)；再以copGFP-WPRE片段与慢病毒载体LCas9载体(SEQ ID NO.1)作为模板，利用引物P1和引物P3(LCas9R-cGFP)进行第二轮PCR扩增，获得Cas9-copGFP融合产物；所述引物P1的3’与copGFP-WPRE片段有19bp的匹配序列，5’与载体均有19bp的匹配序列，P2的3’与基因有14bp的匹配序列，5’与载体有21bp的匹配序列；P3共25bp，全部与载体相互匹配，其中包括3’与P1有19bp相匹配。

引物P1：GAGAAAGGTGGAGGCCAGCatggagagcgacgagagcg；

引物P2：gtaccggtaccgcggccgcggaagaggccgcagag；

引物P3：GCTGGCCTCCACCTTTCTCTTCTTC。

进一步，所述克隆两个目的基因片段到载体的同一位点时，改进的重叠延伸PCR方法为：以pKOD-Sso7d质粒(SEQ ID NO.3)为模板，以引物P1(S7dF)和引物P2(S7dR)进行第一轮PCR扩增，获得大小为255bp的Sso7d DNA片段；以Rosetta(DE3)菌的基因组DNA(T7 RNA聚合酶的序列见SEQ ID NO.5)为模板，以引物P3(T7cF)和引物P4(T7cDrdR)进行第一轮PCR扩增，获得大小为1007bp的T7C565-883DNA片段；扩增获得的Sso7d DNA片段与pLysS(Novagen，SEQ ID NO.4)载体有18bp重叠，与扩增获得的T7C565-883 DNA片段有23bp重叠，T7C565-883 DNA片段与载体有18bp的重叠区域；将Sso7d DNA片段和T7C565-883 DNA片段与pLysS载体共同作为模板，利用S7dR(P2)和T7cF(P3)进行第二轮PCR扩增，获得Sso7d DNA片段和T7C565-883 DNA片段及载体pLysS的融合产物，其中pLysS载体上的部分片段同时被删除。

进一步，所述克隆两个目的基因片段到载体的不同位点时，改进的重叠延伸PCR方法为：以pCR2.1质粒(Invitrogen)为模板，以引物P1(KanRR)和引物P2(KanRF)进行第一轮PCR扩增，获得大小为866bp的Neo DNA片段；以Rosetta(DE3)菌的基因组DNA(为模板，P3(ProInS)加上T7NF和引物P4(T7NR)进行第一轮PCR扩增，获得大小为1783bp的T7N1-564DNA片段；以Neo DNA片段和T7N1-564 DNA片段与pKOD-Sso7d载体共同作为模板，利用两对引物KanRR(P1)和T7PP(P3’)、ProInS(P3)和KKF(P1’)再进行第二轮PCR扩增，获得Neo DNA片段和T7N1-564DNA片段融合到pKOD-Sso7d载体的不同位点。

我们的“一种单位点及多位点插入、删除及置换的突变及大片段克隆方法”的示意图见图1中B。首先我们利用与传统的重叠延伸克隆方法(图1中A)相同的引物P1和P2扩增目的基因片段。接着我们将获得的目的基因片段、载体、以及P1和P3两条引物混合在一起，经过变性及退火，由于目的基因片段上有能和载体配对的区域，在DNA聚合酶的作用下，目的基因片段能与载体配对区域结合并作为引物延伸出两条融合了载体与目的基因片段的DNA(图1中B中a和c)。同时由于引物P1以目的基因片段中一条为模板进行延伸，引物P3能够以载体为模板进行延伸(图1中B中b)，即引物P1和P3通过分别与(图1中B中c)反应中的目的基因片段和载体结合而抑制图1中B中c反应发生。其中图1中B中a的产物为d，b的产物为e，e进一步反应后能生成d产物，在下一步反应中引物P1和P3能以d为模板在DNA聚合酶的作用下进行指数扩增获得融合了目的基因片段的线性双链DNA片段f，再经过外切核酸酶处理得到具有缺口的环状双链DNA(图1中B中g)。转化入细菌后，就能完成目的基因到目的载体的克隆。利用这种方法通过额外多设计引物也可以同时将多个目的片段插入不同位置。

本发明与现有技术相比所具有的优点及效果：

与其它方法相比本发明具有：(a)通过添加引物，在重叠延伸PCR过程中能利用引物进行指数扩增，有效提高克隆效率和插入片段的长度，如实施例1所示，传统方法无法获得目的克隆，而本发明方法克隆数提高约10倍的同时阳性率为50％；(b)能在载体同一位置同时插入多个片段；(c)能在载体不同位置同时插入、删除及置换多个片段。

(四)附图说明

图1为重叠延伸PCR方法的原理及流程，A为传统方法，B为本发明方法。

图2为本发明单位点及多位点插入、删除及置换的突变及大片段克隆方法与传统重叠延伸方法的比较；OEP：传统重叠延伸PCR。IOEP：改进的重叠延伸PCR；A为OEP和IOEP的PCR扩增产物电泳比较；B为转化效率比较；C为菌落鉴定电泳图。

图3实施例2在载体的一个位置同时插入两个不同片段的示意图。

图4实施例2插入片段电泳图；泳道1-8为8个随机挑选的菌落用PCR检测插入片段；其中泳道1-8所代表的细菌克隆经测序鉴定为含目的DNA片段的克隆；M，10kb marker。

图5在载体的两个不同位置插入两个不同片段的示意图。

图6四条引物混在一起，插入片段检测。泳道1-8为8个随机挑选的菌落用PCR检测插入片段。其中泳道1、3、5、8所代表的细菌克隆经测序鉴定为含目的DNA片段的克隆。M，10kb marker。

图7四条引物分成两组，插入片段检测。泳道1-8为8个随机挑选的菌落用PCR检测插入片段。其中泳道1、2、3、5、6、7和8所代表的细菌克隆经测序鉴定为含目的DNA片段的克隆。M，10kb marker。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：改进的重叠延伸PCR

1、目的DNA片段的制备

以pcDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒(System Biosciences,LLC)为模板，用引物Cas9-cGFPf(P1，5’端跟载体有19bp重叠，3’端与目的基因有19bp重叠)和cGFP-WPREr(P2，5’端跟载体有21bp重叠，3’端与目的基因有14bp重叠)经过PCR扩增获得大小为1336bp的copGFP-WPRE片段(SEQ ID NO.2)。copGFP-WPRE片段的5’末端及3’末端与慢病毒载体LCas9(SEQ ID NO.1)分别有19bp和21bp的序列相匹配。

PCR的条件如下，在25μl体系中，以1ng的pcDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒为模板，以终浓度为0.4μM的Cas9-cGFPf和cGFP-WPREr为引物，用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TaKaRa)扩增。PCR程序为：98℃预变性30s；接着运行30个循环的98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸60s；最后再在68℃延伸5min。PCR产物最终经DNA Clean-up Kit(康为世纪)回收。

2、将目的DNA片段与载体融合并进行扩增

将上一轮PCR扩增得到的copGFP-WPRE片段与慢病毒载体LCas9载体作为模板，利用Cas9-cGFPf(P1)和LCas9R-cGFP(P3，跟载体有25bp重叠，与Cas9-cGFPf(P1)5’端有19bp重叠，与目的基因无重叠)这一对引物进行新一轮PCR扩增。PCR的条件如下，在25μl体系中，以10ng的copGFP-WPRE片段与1ng的LCas9质粒DNA混合后作为模板，引物Cas9-cGFPf和LCas9R-cGFP的终浓度为0.4μM，用高保真酶PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TAKARA)扩增。PCR程序为：98℃预变性30s；接着运行30个循环的98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸5min；最后再在68℃延伸10min。PCR产物最终经DNA Clean-up Kit(康为世纪)回收。

同时做了经典的重叠延伸PCR作为对比，该PCR的条件与上述PCR的差别是，反应体系中不添加引物，copGFP-WPRE片段与LCas9质粒DNA的用量分别增加到50ng的与100ng，其它条件不变。反应完成后，加入10U的DpnI限制性内切酶(NEB)除去原始的LCas9质粒后，取10ul产物进行转化。

扩增结果如图2中A所示，OEP(传统方法)无法扩增获得可检测到的条带，而IOEP(本发明改进方法)能扩增获得约12kb的目的融合片段，证明该方法能有效扩增大的目的融合片段。

引物序列

Cas9-cGFPf	GAGAAAGGTGGAGGCCAGCatggagagcgacgagagcg
		cGFP-WPREr	gtaccggtaccgcggccgcggaagaggccgcagag
LCas9R-cGFP	GCTGGCCTCCACCTTTCTCTTCTTC

3、无痕克隆

在反应体系中，分别加入1μl 10X T4 DNA Polymerase buffer(Fermentas)或CutSmart buffer(NEB)，50ng步骤2的扩增产物，1U T4 DNA polymerase，加水补足到10μl。

20℃反应2min使DNA末端形成单链区，接着加热到75℃温浴5min使酶失活，然后在50℃温浴10min形成互补配对。上述反应产物置于冰上后即可用于转化。转化入DH5a感受态细胞后，检测获得的克隆数，发现IOEP获得的克隆数约是OEP的十倍(图2中B)。我们随机挑8个菌落进行菌落PCR鉴定。用引物Cas9-cGFPf和cGFP-WPREr检测是否含目的基因，结果如图2中C所示，对照中8个随机挑选的白色菌落中没有一个含目的基因片度，而改进的重叠延伸PCR方法中有4个包含目的基因片段，表明该克隆方法能够有效克隆目的基因片段。

实施例2、改进的重叠延伸PCR方法的效率及利用其克隆目的基因片段

如图3所示，利用改进的重叠延伸PCR方法同时将两个片段插入到pLysS载体上并置换掉载体上的一个片段。

1、目的DNA片段的制备

以pKOD-Sso7d质粒(SEQ ID NO.3)为模板，以S7dF(P1，5’端跟载体有18bp重叠，3’端与目的基因有16bp重叠)、S7dR(P2，5’端与T7cF(P2’)有23bp重叠，3’端与目的基因有20bp重叠)为引物进行第一轮PCR扩增，获得大小为255bp的Sso7d DNA片段。

以Rosetta(DE3)菌的基因组DNA为模板，以T7cF(P3，5’端与S7dR(P2)有23bp重叠，3’端与目的基因有22bp重叠)、T7cDrdR(P4，5’端载体有20bp重叠，3’端与目的基因有21bp重叠)为引物，进行第一轮PCR扩增，获得大小为1007bp的T7C565-883 DNA片段。

Sso7d DNA片段的5’末端与pLysS载体(SEQ ID NO.4)，Sso7d DNA片段的3’末端与T7C565-883 DNA片段的5’末端，T7C565-883 DNA片段的3’末端与pLysS载体分别有18bp、23bp、18bp的序列相匹配。

PCR的条件如下，在25μl体系中，Sso7d是以1ng的pKOD-Sso7d质粒为模板，T7C是以20ng的Rosetta(DE3)菌的基因组DNA为模板，分别加两对引物(S7dF和S7dR、T7cF和T7cDrdR)，引物终浓度为0.4μM，用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TaKaRa)扩增。PCR程序为：98℃预变性30s；接着运行30个循环的98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸60s；最后再在68℃延伸5min。PCR产物最终经DNA Clean-up Kit(康为世纪)回收。

2、将目的DNA片段与载体融合并进行指数扩增

将上一轮PCR扩增得到的Sso7d和T7C565-883两组DNA片段与pLysS载体作为模板，利用S7dR(P2)和T7cF(P3)这一对引物进行新一轮扩增。PCR的条件如下，在25μl体系中，以10ng的Sso7d和T7C565-883两组DNA片段与1ng的pLysS质粒DNA混合后作为模板，引物S7dR和T7cF的终浓度为0.4μM，用高保真酶PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TaKaRa)扩增。PCR程序为：98℃预变性30s；接着运行30个循环的98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸5min；最后再在68℃延伸10min。PCR产物最终经DNA Clean-up Kit(康为世纪)回收。

引物序列

3、无痕克隆

在反应体系中，分别加入1μl 10X NEB2.1 buffer，80ng第二轮重组线性化DNA片段，1U T4 DNA polymerase，加水补足10μl。

20℃反应2min使DNA末端形成单链区，接着加热到75℃温浴5min使酶失活，然后在50℃温浴10min形成互补配对。上述反应产物置于冰上后即可用于转化。转化入DH5a感受态细胞后我们随机挑8个菌落进行菌落PCR鉴定。用引物S7dF和T7cDrdR检测是否含目的基因，结果如图4所示，8个随机挑选的白色菌落中全部包含目的基因片段，表明该克隆方法能够有效同时克隆两个DNA片段。

实施例3、在不同位置插入两个不同DNA片段

如图5所示，验证该克隆方法是否能够同时在两个不同位置分别插入两个不同DNA片段，其中一个片段置换了载体上的一个片段。

1、目的DNA片段的制备。

以pCR2.1质粒为模板，KanRR(P1，5’端跟载体有21bp重叠，3’端与目的基因有19bp重叠)，以KanRF(P2，5’端跟载体有21bp重叠，3’端与目的基因有19bp重叠)为引物，利用PCR扩增获得大小分别为866bp的Neo DNA片段。

以Rosetta(DE3)菌的基因组DNA为模板，以ProInS(P3)联合T7NF(其中ProInS的5’端跟载体没有重叠，但与T7PP(P3’)有20bp重叠，3’端与T7NF有20bp重叠，T7NF与目的基因有24bp重叠)，T7NR(P4，5’端跟载体有19bp重叠，3’端与目的基因有20bp重叠)为引物，利用PCR扩增获得大小为1783bp的T7N1-564 DNA片段。NeoDNA片段的5’末端和3’末端与pKOD-Sso7d载体分别有21bp、20bp序列相互配对，T7N1-564 DNA片段的5’末端和3’末端与pKOD-Sso7d载体分别有0bp、19bp序列相互配对。PCR的条件如下，在25μl体系中，Neo DNA片段是以1ng的pCR2.1质粒为模板，以终浓度为0.4μM的KanRF和KanRR为引物，T7N1-564是以20ng的Rosetta(DE3)菌的基因组DNA为模板，以终浓度为0.4μM的ProInS和T7NR以及0.1μM的T7NF为引物，用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TaKaRa)扩增。PCR程序为：98℃预变性30s；接着运行30个循环的98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸60s；最后再在68℃延伸2min。PCR产物最终经DNA Clean-up Kit(康为世纪)回收。

2、将目的DNA片段与载体重组成线性片段并进行指数扩增

将上一轮PCR扩增得到的10ng的Neo和T7N1-564两组DNA片段与1ng的pKOD-Sso7d载体作为模板，利用两对引物KanRR(P1)和T7PP(P3’)、ProInS(P3)和KKF(P1’，KKF引物3’端与载体重叠，5’端与引物KanRR有重叠)在进行新一轮扩增。该步骤我们做了两个平行试验进行对比，其中一组是将两对引物分开到两个管子里反应(即KanRR和T7PP一管、KKF和ProInS一管)，另一组直接将四条引物放在一个管子里反应(KanRR、T7PP、KKF和ProInS混合)，各引物终浓度均为0.4μM，用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TaKaRa)扩增，然后对比一下转化效率。PCR程序为：98℃预变性30s；接着运行30个循环的98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸5min；最后再在68℃延伸10min。PCR产物最终经DNA Clean-up Kit(康为)回收。

引物序列

3、无痕克隆

无痕克隆条件与步骤与实施例1步骤3中相同。我们每组随机挑8个菌落进行菌落PCR鉴定。用引物KanRR和T7NR检测是否含目的基因，混成一管的结果如图6所示，8个随机挑选的菌落1、3、5和8中含目的基因片段。四条引物分成两管的结果如图7所示，8个随机挑选的菌落中1、2、3、5、6、7和8中含目的基因片段，表明该克隆方法能够有效同时在不同位置克隆两个DNA片段，而且两组引物分开做还能够提高效率。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种改进的重叠延伸PCR方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4457

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atgtacccat acgatgttcc agattacgct tcgccgaaga aaaagcgcaa ggtcgaagcg 60

tccgacaaga agtacagcat cggcctggac atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 120

atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 180

cacagcatca agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag 240

gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 300

tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 360

ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 420

aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 480

aaactggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac 540

atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 600

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc 660

atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga 720

cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggcaac 780

ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 840

gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 900

cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 960

ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct 1020

atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1080

cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1140

ggctacattg acggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1200

gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 1260

aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 1320

gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1380

gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1440

agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1500

gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1560

aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1620

tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 1680

agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1740

gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 1800

tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 1860

atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1920

ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1980

cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 2040

aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2100

gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2160

agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 2220

cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2280

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catctcgtcc tgcctccaca gtaccgtctc gcttgatgat aaagtggtat cccacatcga 2340

gccaaccctg ctctttgtgc cactggcgaa tctcacggac accaacattc tgacttggct 2400

tggtagccga gcagtgaaca aagattgcgt cagtagattc acgttgttta aactgtacac 2460

gagccattat ttctttcctc ctttcctttt taatctatca aaggggaccc ggatcctcta 2520

cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat 2580

cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt 2640

cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca 2700

tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct 2760

aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt 2820

cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt 2880

tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc agcgctctgg gtcattttcg gcgaggaccg 2940

ctttcgctgg agcgcgacga tgatcggcct gtcgcttgcg gtattcggaa tcttgcacgc 3000

cctcgctcaa gccttcgtca ctggtcccgc caccaaacgt ttcggcgaga agcaggccat 3060

tatcgccggc atggcggccg acgcgctggg ctacgtcttg ctggcgttcg cgacgcgagg 3120

ctggatggcc ttccccatta tgattcttct cgcttccggc ggcatcggga tgcccgcgtt 3180

gcaggccatg ctgtccaggc aggtagatga cgaccatcag ggacagcttc aaggatcgct 3240

cgcggctctt accagcctaa cttcgatcac tggaccgctg atcgtcacgg cgatttatgc 3300

cgcctcggcg agcacatgga acgggttggc atggattgta ggcgccgccc tataccttgt 3360

ctgcctcccc gcgttgcgtc gcggtgcatg gagccgggcc acctcgacct gaatggaagc 3420

cggcggcacc tcgctaacgg attcaccact ccaagaattg gagccaatca attcttgcgg 3480

agaactgtga atgcgcaaac caacccttgg cagaacatat ccatcgcgtc cgccatctcc 3540

agcagccgca cgcggcgcat ctcgggcagc gttgggtcct ggccacgggt gcgcatgatc 3600

gtgctcctgt cgttgaggac ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg ttagcagaat 3660

gaatcaccga tacgcgagcg aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc tgcgacctga 3720

gcaacaacat gaatggtctt cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac gcggaagtcc 3780

cctacgtgct gctgaagttg cccgcaacag agagtggaac caaccggtga taccacgata 3840

ctatgactga gagtcaacgc catgagcggc ctcatttctt attctgagtt acaacagtcc 3900

gcaccgctgt ccggtagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt 3960

atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgcc caacagtccc 4020

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgccctgcac cattatgttc 4080

cggatctgca tcgcaggatg ctgctggcta ccctgtggaa cacctacatc tgtattaacg 4140

aagcgctaac cgtttttatc aggctctggg aggcagaata aatgatcata tcgtcaatta 4200

ttacctccac ggggagagcc tgagcaaact ggcctcaggc atttgagaag cacacggtca 4260

cactgcttcc ggtagtcaat aaaccggtaa accagcaata gacataagcg gctatttaac 4320

gaccctgccc tgaaccgacg accgggtcga atttgctttc gaatttctgc cattcatccg 4380

cttattatca cttattcagg cgtagcacca ggcgtttaag ggcaccaata actgccttaa 4440

aaaaattacg ccccgccctg ccactcatcg cagtactgtt gtaattcatt aagcattctg 4500

ccgacatgga agccatcaca gacggcatga tgaacctgaa tcgccagcgg catcagcacc 4560

ttgtcgcctt gcgtataata tttgcccatg gtgaaaacgg gggcgaagaa gttgtccata 4620

ttggccacgt ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg gattggctga gacgaaaaac 4680

atattctcaa taaacccttt agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct 4740

tgcgaatata tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt attcactcca gagcgatgaa 4800

aacgtttcag tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt gaacactatc ccatatcacc 4860

agctcaccgt ctttcattgc catacg 4886

<210> 5

<211> 2652

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60

ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120

catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180

gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240

atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300

acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360

accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420

atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480

cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540

gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600

tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660

attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720

tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780

ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840

attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900

agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960

aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020

atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080

ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140

gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200

atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260

gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320

aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380

aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440

ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500

tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560

gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620

tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680

ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740

attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800

aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860

ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920

tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980

tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040

atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100

tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160

aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220

aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280

attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340

aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400

aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460

gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520

gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580

atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640

gcgttcgcgt aa 2652

Claims (3)

1.一种改进的重叠延伸PCR方法，其特征在于克隆单个目的基因片段到载体时，以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒为模板，用引物P1和引物P2进行第一轮PCR扩增，获得copGFP-WPRE片段，copGFP-WPRE片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；再以copGFP-WPRE片段与慢病毒载体LCas9载体作为模板，利用引物P1和引物P3进行第二轮PCR扩增，获得Cas9-copGFP融合产物，LCas9载体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物P1的3’端与copGFP-WPRE片段有19bp的匹配序列，5’端与载体有19bp的匹配序列，P2的3’ 端与目的基因有14bp的匹配序列，5’ 端与载体有21bp的匹配序列；P3共25bp，全部与载体相互匹配，其中3’ 端与P1的5’ 端有19bp相匹配；

引物P1：GAGAAAGGTGGAGGCCAGCATGGAGAGCGACGAGAGCG；

引物P2：GTACCGGTACCGCGGCCGCGGAAGAGGCCGCAGAG；

引物P3：GCTGGCCTCCACCTTTCTCTTCTTC。

2.一种改进的重叠延伸PCR方法，其特征在于克隆两个目的基因片段到载体的同一位点时，以pKOD-Sso7d质粒为模板，以引物P1和引物P2进行第一轮PCR扩增，获得Sso7d DNA片段，pKOD-Sso7d质粒核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；以Rosetta（DE3）菌的基因组DNA为模板，以引物P3和引物P4进行第一轮PCR扩增，获得T7C565-883 DNA片段；将Sso7d DNA片段和T7C565-883 DNA片段与pLysS载体共同作为模板，利用引物P2和引物P3进行第二轮PCR扩增，获得Sso7d DNA片段和T7C565-883 DNA片段及载体pLysS的融合产物，pLysS载体核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

引物P1：

GCTAACGCAGTCAGGCACCAAGGAGAGATCTATGGGCGGCCGCGCAACCGTAAAGTTCA；

引物P2：CCTCCAGATCCACCACCGGATCCCTTTTTCTGCTTCTCCAGCA；

引物P3：GGATCCGGTGGTGGATCTGGAGGTTCAGAAACCGTTCAGGACATCTACG；

引物P4：AATTCGACCCGGTCGTCGACTTACGCGAACGCGAAGTCCGA。

3.一种改进的重叠延伸PCR方法，其特征在于克隆两个目的基因片段到载体的不同位点时，以pCR2.1质粒为模板，以引物P1和引物P2进行第一轮PCR扩增，获得Neo DNA片段；以Rosetta（DE3）菌的基因组DNA为模板，P3加上T7NF和引物P4进行第一轮PCR扩增，获得T7N1-564 DNA片段；以Neo DNA片段和T7N1-564 DNA片段与pKOD-Sso7d载体共同作为模板，利用两对引物P1和P3’、 P3和P1’再进行第二轮PCR扩增，获得Neo DNA片段和T7N1-564 DNA片段融合到pKOD-Sso7d载体的不同位点；

引物P1：GTTAAACAAAATTATTTCTAGTCAGGTACCGAAGAACTCGTCAAGAAGG；

引物P2：

GATAACAATTCCCCTCTAGAAGAAGGAGATATACCATGGGATCGGCCATTGAAC；

引物P3：

GGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAACACCATGGGGTACTAGAGAAAG；

引物P4：

CAATGCCAGCGCTTCGTTAGTCGACGTATCCGCGGCCGCTTGAACCTCCAGATCCACCACTAGGAAGCAAGTTAAC；

引物P1’： CCTGACTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGATCC；

引物P3’：

GTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAG；

引物T7NF：

CCATGGGGTACTAGAGAAAGAGGAGAAAGATCTATGAACACGATTAACATCGCTAAG。

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