CN106755031B - 鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用 - Google Patents

鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用，对已知的鼠李糖基转移酶基因rhlA、rhlB、rhlC根据大肠杆菌密码子的偏爱性进行优化和人工合成，分别命名为SyrhlA、SyrhlB、SyrhlC；合成大肠杆菌核糖体结合位点(RBS)连接至SyrhlB上游，并在RBS上游连接SyrhlA，构建为基因簇SyrhlA‑RBS‑SyrhlB；将SyrhlA‑RBS‑SyrhlB和SyrhlC构建在含有双启动子的质粒pACYCDuet‑1中，并导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达，实现了大肠杆菌利用葡萄糖为碳源合成鼠李糖脂，大大提高大肠杆菌合成鼠李糖脂的产量。

Description

鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用。
背景技术
鼠李糖脂是生物表面活性剂的重要品种，能显著降低表面张力，具有优良的去垢、乳化和絮凝能力，并且具有无毒和生物降解的特性，在化工、医药、农业和环境修复等领域具有广阔的应用前景。
鼠李糖脂最早于1949年由Jarvis和Johnson在铜绿假单胞菌中发现获得。铜绿假单胞菌能合成多种结构的鼠李糖脂，主要有双糖双脂结构、单糖双脂结构、双糖单脂结构和单糖单脂结构四种结构类型。其中脂肪链的长度及饱和程度不同，且各亚种菌株合成不同结构鼠李糖脂的比例不同，造成不同菌株合成的表面活性产物的性能各异。虽然铜绿假单胞菌是合成鼠李糖脂最主要的菌种，但由于其具有条件致病性，它合成鼠李糖脂的行为也与其致病性相关，因此限制了该菌种在鼠李糖脂生产上的应用。
铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂的代谢途径受到群体感应系统(QS)的调控，其产物生成与细胞生长状态间存在复杂的耦合关系。如RhlI/R系统直接调控鼠李糖脂合成途径的转录表达，而LasI/R系统通过调控RhlI/R系统的转录来间接控制鼠李糖脂合成；再加上QS信号分子的淬灭系统对两套QS系统的负调控，构成对鼠李糖脂合成途径的转录调控网络。在这些调控元件综合作用下，细胞合成鼠李糖脂的产量和产率受到细胞密度等多种因素的复合控制。此外，假单胞菌合成的表面活物质主要为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂，分别由rhlAB和rhlC编码的鼠李糖基转移酶I和II催化合成，而rhlAB与rhlC位于基因组中不同位置，并受不同启动子调控转录。合成鼠李糖脂前体的代谢途径，如鼠李糖合成、脂肪酸合成途径中涉及的rmlBDAC、rhlYZ等基因也受不同QS系统调控转录。因此，不同生长状态下，鼠李糖脂合成的完整途径中，各反应步骤受调控表达的水平不同，造成产物单、双鼠李糖脂及代谢中间产物的比例不同，产物的表面活性、乳化性等亦有区别，影响发酵产品性能的稳定性。在发酵过程方面，铜绿假单胞菌以油脂为原料合成鼠李糖脂，造成鼠李糖脂产物成分复杂，增加了产物分离纯化的成本。
采用大肠杆菌工程菌利用葡萄糖合成单鼠李糖脂，较为安全，遗传背景清晰，产物具有表面活性，产物的生物合成过程不受细胞群体感应的影响，可进行外源诱导物的人工调控合成，增强了生产过程的可控性，具有很好的应用前景。
然而，现阶段所使用的大肠杆菌工程菌都是通过克隆铜绿假单胞菌基因组中rhlAB、rhlC等基因，导入大肠杆菌宿主细胞中。如Wang等构建的E.coli TnERAB，单鼠李糖脂产量为175mg/L(Qinhong Wang,Xiangdong Fang,Baojun Bai,et al.Biotechnologyand Bioengineering,2007,98(4):842-853)。Han等人扩增铜绿假单胞中rhlAB和rhlC基因，形成rhlAB-rhlC串联形式置于载体pET-30a(+)的T7启动子下游，鼠李糖脂产物中含有单鼠李糖脂和双鼠李糖脂，产量为120mg/L(L Han,P Liu,Y Peng,et al.Journal ofApplied Microbiology,2014,117(1):139-150)。Cabrera-Valladares等将铜绿假单胞菌中rhlAB基因和鼠李糖合成基因簇rmlBDAC同时在大肠杆菌中表达，单鼠李糖脂产量为120mg/L(Natividad Cabrera-Valladares,Anne-Pascale Richardson,Clarita Olvera,et al.Applied Microbiology and Biotechnology,2006,73(1):187-194)。这些工作均未对鼠李糖脂合成基因进行针对大肠杆菌宿主的密码子优化和基因簇结构的优化，鼠李糖脂产量较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供鼠李糖脂生产质粒。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述鼠李糖脂生产质粒的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述大肠杆菌工程菌的应用。
本发明的技术方案如下：
一种鼠李糖脂生产质粒，质粒DJ202，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述鼠李糖脂生产质粒(质粒DJ202)的构建方法，具体步骤如下：
(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列如SEQ IDNO.3所示；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；
(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；
(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202。
由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌，是由上述质粒DJ202导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL202。
一种鼠李糖脂生产质粒，质粒DJ208，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述鼠李糖脂生产质粒(质粒DJ208)的构建方法，具体步骤如下：
(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列如SEQ IDNO.3所示；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；
(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；
(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202；
(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC，其基因序列如SEQ IDNO.6所示；将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游，获得质粒DJ205；
(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游，获得质粒DJ208。
由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌，是由上述质粒DJ208导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208。
由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌，BL208/402，是由下述方法构建得到的：
(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列如SEQ IDNO.3所示；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；
(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；
(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202；
(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC，其基因序列如SEQ IDNO.6所示；将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游，获得质粒DJ205；
(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游，获得质粒DJ208；
(6)通过PCR方式扩增大肠杆菌dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶基因rfbD，通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达载体pRSFDuet-1的T7启动子下游，获得质粒DJ402；
(7)将所述质粒DJ208和DJ402共同导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208/402。
由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌，BL208/301，是由下述方法构建得到的：
(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列如SEQ IDNO.3所示；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；
(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；
(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202；
(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC，其基因序列如SEQ IDNO.6所示；将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游，获得质粒DJ205；
(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游，获得质粒DJ208；
(6)通过PCR方式扩增大肠杆菌ACP转酰基酶基因fabD，通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达载体pTrcHisA的trc启动子下游，获得质粒DJ301；
(7)将所述质粒DJ208和DJ301共同导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208/301。
上述大肠杆菌工程菌在大肠杆菌合成鼠李糖脂中的应用。
优选的，上述大肠杆菌工程菌的应用，具体步骤为：将工程菌株活化后以1-5％的接种量转接到发酵培养基中，30-37℃160-200r/min培养1-3h，添加0.1-1mM IPTG诱导基因表达，添加氨苄青霉素、氯霉素和硫酸卡那霉素/或和氨苄青霉素，30-37℃160-200r/min培养42-48h；其中，发酵培养基：葡萄糖3-5g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母粉3-6g/L，NaCl8-12g/L，pH6.8-7.2。
本发明的有益效果：
本发明对已知的鼠李糖基转移酶基因rhlA、rhlB、rhlC根据大肠杆菌密码子的偏爱性进行优化和人工合成，并合成连接大肠杆菌核糖体结合位点RBS，构建为含基因簇SyrhlA-RBS-SyrhlB形式的质粒DJ202；利用双启动子载体，构建为含T7启动子-SyrhlA-RBS-SyrhlB-T7启动子-SyrhlC形式的质粒DJ208；构建的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)后，获得了产鼠李糖脂的大肠杆菌工程菌；进一步通过过表达大肠杆菌鼠李糖合成途径或脂肪酸合成途径中的内源基因rfbD或fabD，与质粒DJ208共转化入大肠杆菌BL21(DE3)后，获得含双质粒的大肠杆菌工程菌株，提高了工程菌株鼠李糖脂产量。所述大肠杆菌工程菌株，避免了铜绿假单胞菌的致病性，培养过程更为安全；避免了铜绿假单胞菌中鼠李糖脂合成受细胞群体感应调控的特点，能够通过添加化学诱导物诱导产物生成，便于发酵过程的调控；能够利用葡萄糖为碳源合成鼠李糖脂，避免使用成分复杂的油脂作为碳源，降低了发酵产物提取的难度和成本。
附图说明
图1为大肠杆菌中构建产鼠李糖脂工程菌株代谢相关途径。
图2为本发明构建质粒的遗传图谱。
A：质粒DJ202图谱。
B：质粒DJ208图谱。
C：质粒DJ402图谱。
D：质粒DJ301图谱。
图3为本发明大肠杆菌工程菌株BL202、BL208发酵产物LC-MS分析图谱。
A：工程菌BL202的液相色谱图。
B：工程菌BL208的液相色谱图。
C：发酵产物中单鼠李糖脂Rha-C8-C10的质谱图。
D：发酵产物中单鼠李糖脂Rha-C10-C10的质谱图。
E：发酵产物中双鼠李糖脂Rha-Rha-C8-C10的质谱图。
F：发酵产物中双鼠李糖脂Rha-Rha-C10-C10的质谱图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1产鼠李糖脂工程菌株的构建
1.鼠李糖脂合成基因载体构建
(1)SyrhlA基因、SyrhlB基因和SyrhlC基因的密码子优化及合成
本实施例中鼠李糖基转移酶基因rhlA、rhlB、rhlC的原始序列均来源于铜绿假单胞(Pseudomonas aeruginosaPAO1)，参照大肠杆菌偏爱性密码子表对rhlA(原始基因序列见GenBank GI:9949623)中的密码子进行优化，并适当规避常用的限制性酶切位点。优化后的基因命名为SyrhlA(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，在两端分别添加NdeI和BamHI限制性酶切位点，由苏州金唯智生物科技有限公司合成并连接至pET21-21a(+)载体的NdeI与BamHI位点间，获得质粒DJ201。同样的方法对rhlB(原始序列为GenBankGI:9949622)进行密码子优化，优化后的基因命名为SyrhlB(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，在其上游引入大肠杆菌核糖体结合位点RBS(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，形成RBS-SyrhlB的结构，在RBS-SyrhlB两端分别添加EcoRI和HindIII限制性酶切位点，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
同样的方法对rhlC(原始序列为GenBank GI:9947050)进行密码子优化，优化后的基因命名为SyrhlC(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，在两端分别添加NdeI和KpnI限制性酶切位点，由苏州金唯智生物科技有限公司合成并连接至pACYCDuet-1载体的NdeI与KpnI位点间，获得质粒DJ205。
(2)质粒DJ202的构建
将RBS-SyrhlB片段与质粒DJ201用EcoRI和HindIII内切酶进行酶切、连接，形成T7启动子-SyrhlA-RBS-SyrhlB的形式，得到质粒DJ202，DJ202的质粒图谱为图2-A。
(3)质粒DJ208的构建
以质粒DJ202为扩增模板，以rhlAB-6f(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)为上引，以rhlAB-6r(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)为下引，PCR扩增得到SyrhlA-RBS-SyrhlB片段并用试剂盒纯化回收。PCR反应体系为模板1μL，上下引物各0.5μL，Fastpfu酶2.5μL，5×反应缓冲液10μL，dNTP5μL，超纯水30.5μL。PCR反应程序95℃30s，95℃30s，55℃30s，72℃1min30s，72℃5min，其中第2步到第5步循环30次。用限制性内切酶NcoI和SacI分别对PCR扩增获得的SyrhlA-RBS-SyrhlB片段和质粒DJ205进行双酶切，纯化后用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。Fastpfu酶购自北京全式金公司，dNTP、限制性内切酶和T4DNA连接酶购自TAKARA公司，感受态细胞购自北京博迈德生物技术有限公司。菌落PCR筛选阳性克隆提质粒送至北京金唯智生物科技有限公司测序，测序正确后命名该质粒为DJ208，DJ208的质粒图谱为图2-B。
2.鼠李糖合成途径中rfbD基因过表达载体的构建
根据大肠杆菌BL21(DE3)基因组GenBank GI:313848522中的dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶基因rfbD序列(GenBankGI:242377692)设计引物：上引rfbD-1f(核苷酸序列如SEQID NO.9所示)，下引rfbD-1r(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)，引物两端添加了NdeI和KpnI酶切位点序列。该基因是大肠杆菌内源途径中鼠李糖前体合成的关键基因，如图1所示。用试剂盒提取大肠杆菌BL21(DE3)菌株的基因组作为PCR扩增模板，以rfbD-1f/rfbD-1r为引物PCR扩增rfbD基因。PCR反应体系为模板1μL，上下引物各0.5μL，Fastpfu酶2.5μL，5×反应缓冲液10μL，dNTP5μL，超纯水30.5μL。PCR反应程序95℃30s，95℃30s，55℃30s，72℃1min，72℃5min，其中第2步到第5步循环30次。用限制性内切酶NdeI和KpnI分别对PCR扩增获得的片段和质粒pRSFDuet-1进行双酶切，纯化后用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。Fastpfu酶购自北京全式金公司，dNTP、限制性内切酶和T4DNA连接酶购自TAKARA公司，感受态细胞购自北京博迈德生物技术有限公司。菌落PCR筛选阳性克隆提质粒送至北京金唯智生物科技有限公司测序，测序正确后命名该质粒为DJ402，DJ402的质粒图谱为图2-C。
3.脂肪酸合成途径中fabD基因过表达载体的构建
根据大肠杆菌BL21(DE3)基因组GenBank GI:313848522中的ACP转酰基酶基因fabD序列(GenBankGI:242376895)设计引物：上引fabD-1f(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)，下引fabD-1r(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)，引物两端添加了NcoI和BamHI酶切位点序列。该基因是大肠杆菌内源途径中脂肪酸前体合成的关键基因，如图1所示。以fabD-1f/fabD-1r为引物，用与rfbD基因扩增相同的PCR体系和反应程序进行PCR扩增。用限制性内切酶NcoI和BamHI分别对PCR扩增获得的片段和质粒pTrcHisA进行双酶切，纯化后用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。菌落PCR筛选阳性克隆测序正确后命名该质粒为DJ301，DJ301的质粒图谱为图2-D。试剂和方法与构建质粒DJ402相同。
4.产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌株的构建
将质粒DJ202转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌株，命名为菌株BL202。将质粒DJ208转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌株，命名为菌株BL208。将质粒DJ208和质粒DJ402转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌株，命名为菌株BL208/402。将质粒DJ208和质粒DJ301转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌株，命名为菌株BL208/301。大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自北京博迈德生物技术有限公司。
实施例2产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌摇瓶发酵验证
1.发酵过程
挑取大肠杆菌工程菌BL202单菌落于5mL含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB试管中，37℃，180r/min振荡培养过夜后，按1％的接种量接种于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中，37℃，180r/min振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入1mM的IPTG诱导基因的表达，培养46h，得到发酵液。
用相同的培养方法对工程菌BL208，BL208/402，BL208/301进行发酵，其中BL208的培养基中添加50μg/mL氯霉素，BL208/402的培养基中添加50μg/mL氯霉素和50μg/mL硫酸卡那霉素，BL208/301的培养基中添加50μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素。
2.发酵液中鼠李糖脂的提取
将上述步骤中收集的发酵液于4℃、8000r/min离心15min，取上清液，用6mol/L的HCl溶液调节上清液pH至2.0，静置于4℃过夜；4℃、10000r/min离心20min，取沉淀，并用pH2.0的HCl溶液洗涤沉淀3次，用3mL氯仿：乙醇(2:1，v/v)萃取3次，合并收集有机相，干燥后得到粉末为发酵产物的粗提物，用于液质联用(LC-MS)测定。
取吸取1mL发酵液离心后的上清液用3mL氯仿：乙醇(2:1，v/v)萃取3次，合并收集有机相，蒸干后加水复溶得到样品，用于鼠李糖脂浓度测定。
3.发酵产物的液质联用(LC-MS)测定
色谱柱为AngilentSB-CB(2.1mm×100mm,1.8μm)；流动相由A相(甲酸：水＝0.1:100)和B相(甲酸：乙腈＝0.1:100)组成，流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：5μL。梯度洗脱程序：0min，10％B；3min，10％B；33min，90％B；65min，90％B。HPLC/Q-TOF-MS系统使用ESI离子源，在负离子模式下采集数据。离子采集范围：200-1000m/z。产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌株BL202中测到了单鼠李糖脂(液相色谱图为图3-A)，菌株BL208中测到了单鼠李糖脂和双鼠李糖脂(液相色谱图为图3-B)，其中单鼠李糖脂质谱图为图3-C、图3-D，双鼠李糖脂质谱图为图3-E、图3-F。结果表明，本发明中含优化合成基因SyrhlA、SyrhlB、SyrhlC的重组质粒DJ202和DJ208能够实现大肠杆菌产鼠李糖脂。
4.鼠李糖脂浓度测定
采用硫酸-蒽酮法测定鼠李糖脂的含量：取1mL适当稀释后的样品，加5mL蒽酮-硫酸试剂(蒽酮-硫酸试剂：取0.2g蒽酮溶于100mL体积分数75％H2SO4溶液，现配现用)，沸水浴10min，冷却至室温后测定OD620，根据已测得的鼠李糖标准曲线计算得到样品中鼠李糖含量，乘以系数3和稀释倍数得到发酵液中鼠李糖脂含量。产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌BL202、BL208、BL208/402和BL208/301发酵液中鼠李糖脂含量分别为：707mg/L、575mg/L、672mg/L和617mg/L。
之前有关产鼠李糖脂大肠杆菌工程菌的报道均是通过扩增铜绿假单胞中rhlAB基因簇并构建重组质粒在大肠杆菌中表达并合成单鼠李糖脂，未进行密码子优化和基因簇结构的优化，鼠李糖脂产量较低。如Wang等构建的E.coli TnERAB，单鼠李糖脂产量为175mg/L(Qinhong Wang,Xiangdong Fang,Baojun Bai,et al.Biotechnology andBioengineering,2007,98(4):842-853)。本发明中优化设计并人工合成的SyrhlA-RBS-SyrhlB基因簇，利用载体pET-21a(+)中的T7启动子构建为质粒DJ202，使大肠杆菌合成单鼠李糖脂，产量提高至707mg/L。Han等人扩增铜绿假单胞中rhlAB和rhlC基因，形成rhlAB-rhlC串联形式置于载体pET-30a(+)的T7启动子下游，鼠李糖脂产物中含有单鼠李糖脂和双鼠李糖脂，产量为(120mg/L)(L Han,P Liu,Y Peng,et al.Journal of AppliedMicrobiology,2014,117(1):139-150)。本发明中优化合成的SyrhlA-RBS-SyrhlB和SyrhlC分别置于载体pACYCDuet-1两个T7启动子下游，使大肠杆菌合成单鼠李糖脂和双鼠李糖脂，产量提高至575mg/L。Cabrera-Valladares等将铜绿假单胞菌中rhlAB基因和鼠李糖合成基因簇rmlBDAC同时在大肠杆菌中表达，单鼠李糖脂产量为120mg/L(Natividad Cabrera-Valladares,Anne-Pascale Richardson,Clarita Olvera,et al.Applied Microbiologyand Biotechnology,2006,73(1):187-194)。本发明还通过构建强化表达大肠杆菌内源的dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶基因rfbD或ACP转酰基酶基因fabD的质粒，并与质粒DJ208共转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，进一步将含双鼠李糖脂产物的产量提高至672mg/L和617mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<221> 质粒DJ202
<222> (1)..(7578)
<400> 1
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140
tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520
cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640
gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700
catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760
tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820
ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880
tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940
ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000
aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060
gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120
tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180
acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240
cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300
cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg 3360
gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc 3420
cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg 3480
gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 3540
tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600
atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720
gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 3780
tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 3840
cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 3900
tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 3960
atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020
atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 4080
tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 4140
cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200
aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 4260
ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 4320
tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 4380
tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 4440
gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500
gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 4560
gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 4620
ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 4680
taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 4740
ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 4800
atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 4860
tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc 4920
gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat 4980
gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc 5040
aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat 5100
ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc 5160
cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgcgc cgcgaaagcc 5220
tgctggtgag cgtgtgcaag ggcctgcgtg tgcatgttga acgcgttggt caagatcctg 5280
gtcgtagtac cgtgatgctg gtgaatggtg ctatggctac aaccgccagc tttgcccgta 5340
cctgcaaatg cctggccgaa cacttcaacg tggtgctgtt tgatctgccg tttgccggtc 5400
agagccgtca gcacaatccg cagcgcggcc tgatcaccaa ggacgacgag gttgaaatcc 5460
tgctggcact gatcgaacgc ttcgaagtga atcacctggt tagcgcaagc tggggtggta 5520
tcagcaccct gctggcactg agccgtaatc cgcgcggtat tcgcagtagc gtggtgatgg 5580
cctttgcccc gggcctgaac caggccatgc tggattatgt tggccgcgca caagccctga 5640
tcgagctgga tgacaaaagc gccattggcc atctgctgaa tgagaccgtg ggcaaatacc 5700
tgccgcagcg tctgaaggca agcaaccatc agcacatggc cagcctggca accggcgaat 5760
atgagcaggc acgctttcac attgatcagg tgctggcact gaatgatcgc ggctatctgg 5820
cctgcctgga gcgcatccag agccacgtgc acttcatcaa tggcagctgg gacgaataca 5880
ccaccgcaga agacgcccgc cagtttcgcg actatctgcc gcactgtagc tttagccgtg 5940
ttgaaggcac cggccacttt ctggacctgg aaagtaaact ggcagccgtt cgtgtgcacc 6000
gcgccttact ggaacacctg ctgaaacaac cggaaccgca gcgtgcagaa cgtgcagccg 6060
gctttcatga gatggccatc ggttatgcat aaggatccga attcaaagga ggccatccta 6120
tgcatgcaat cctgattgcc attggtagtg ccggtgacgt gtttccgttt atcggcctgg 6180
cccgtaccct gaaactgcgt ggccaccgtg tgagcctgtg taccattccg gtgtttcgcg 6240
acgccgtgga acaacatggt attgcctttg tgccgctgag cgacgaactg acatatcgtc 6300
gtactatggg tgatccgcgc ctgtgggacc ctaaaaccag ctttggcgtg ctgtggcagg 6360
caatcgccgg catgatcgag ccggtgtacg aatatgtgag tgcccagcgt catgacgata 6420
tcgtggttgt gggcagcctg tgggccttag gcgcacgtat tgcccacgaa aagtacggca 6480
tcccgtatct gagcgcccag gttagtccga gcaccctgct gagcgcacat ctgccgccgg 6540
tgcatccgaa gttcaacgtg ccggaacaga tgccgctggc catgcgcaaa ctgctgtggc 6600
gctgcattga acgtttcaag ctggaccgca catgcgcccc ggagatcaac gcagtgcgcc 6660
gtaaagtggg cctggaaacc ccggtgaaac gtatctttac ccagtggatg cacagcccgc 6720
agggcgttgt gtgtctgttt ccggcatggt ttgccccgcc gcagcaggat tggccgcagc 6780
cgctgcacat gaccggcttt ccgctgttcg atggtagcat tcctggcacc ccgttagacg 6840
atgaactgca gcgcttcctg gaccagggta gccgtccgct ggtgtttaca cagggcagca 6900
ccgagcatct gcagggcgat ttttacgcta tggctctgcg cgccctggaa cgtttaggtg 6960
cacgtggcat cttcctgacc ggtgccggtc aggaacctct gcgtggcctg cctaaccatg 7020
tgctgcagcg cgcttatgct ccgttaggtg ccctgctgcc gagctgtgcc ggtctggttc 7080
atccgggtgg cattggtgca atgagtctgg ccctggcagc aggtgttccg caggtgctgc 7140
tgccgtgcgc ccacgatcag tttgataatg ccgaacgcct ggtgcgtctg ggttgcggta 7200
tgcgcttagg tgtgcctctg cgcgagcagg agttacgcgg tgcactgtgg cgtctgctgg 7260
aagatccggc aatggccgca gcctgtcgtc gctttatgga gctgagccag ccgcatagca 7320
ttgcctgcgg taaagcagcc caggtggtgg aacgctgtca ccgcgaaggt gatgcccgct 7380
ggctgaaagc cgccagttaa aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccact 7440
gagatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc 7500
aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag 7560
gaggaactat atccggat 7578
<210> 2
<211> 7090
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 质粒DJ208
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<400> 2
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atggcgcgcc gcgaaagcct gctggtgagc gtgtgcaagg gcctgcgtgt 120
gcatgttgaa cgcgttggtc aagatcctgg tcgtagtacc gtgatgctgg tgaatggtgc 180
tatggctaca accgccagct ttgcccgtac ctgcaaatgc ctggccgaac acttcaacgt 240
ggtgctgttt gatctgccgt ttgccggtca gagccgtcag cacaatccgc agcgcggcct 300
gatcaccaag gacgacgagg ttgaaatcct gctggcactg atcgaacgct tcgaagtgaa 360
tcacctggtt agcgcaagct ggggtggtat cagcaccctg ctggcactga gccgtaatcc 420
gcgcggtatt cgcagtagcg tggtgatggc ctttgccccg ggcctgaacc aggccatgct 480
ggattatgtt ggccgcgcac aagccctgat cgagctggat gacaaaagcg ccattggcca 540
tctgctgaat gagaccgtgg gcaaatacct gccgcagcgt ctgaaggcaa gcaaccatca 600
gcacatggcc agcctggcaa ccggcgaata tgagcaggca cgctttcaca ttgatcaggt 660
gctggcactg aatgatcgcg gctatctggc ctgcctggag cgcatccaga gccacgtgca 720
cttcatcaat ggcagctggg acgaatacac caccgcagaa gacgcccgcc agtttcgcga 780
ctatctgccg cactgtagct ttagccgtgt tgaaggcacc ggccactttc tggacctgga 840
aagtaaactg gcagccgttc gtgtgcaccg cgccttactg gaacacctgc tgaaacaacc 900
ggaaccgcag cgtgcagaac gtgcagccgg ctttcatgag atggccatcg gttatgcata 960
aggatccgaa ttcaaaggag gccatcctat gcatgcaatc ctgattgcca ttggtagtgc 1020
cggtgacgtg tttccgttta tcggcctggc ccgtaccctg aaactgcgtg gccaccgtgt 1080
gagcctgtgt accattccgg tgtttcgcga cgccgtggaa caacatggta ttgcctttgt 1140
gccgctgagc gacgaactga catatcgtcg tactatgggt gatccgcgcc tgtgggaccc 1200
taaaaccagc tttggcgtgc tgtggcaggc aatcgccggc atgatcgagc cggtgtacga 1260
atatgtgagt gcccagcgtc atgacgatat cgtggttgtg ggcagcctgt gggccttagg 1320
cgcacgtatt gcccacgaaa agtacggcat cccgtatctg agcgcccagg ttagtccgag 1380
caccctgctg agcgcacatc tgccgccggt gcatccgaag ttcaacgtgc cggaacagat 1440
gccgctggcc atgcgcaaac tgctgtggcg ctgcattgaa cgtttcaagc tggaccgcac 1500
atgcgccccg gagatcaacg cagtgcgccg taaagtgggc ctggaaaccc cggtgaaacg 1560
tatctttacc cagtggatgc acagcccgca gggcgttgtg tgtctgtttc cggcatggtt 1620
tgccccgccg cagcaggatt ggccgcagcc gctgcacatg accggctttc cgctgttcga 1680
tggtagcatt cctggcaccc cgttagacga tgaactgcag cgcttcctgg accagggtag 1740
ccgtccgctg gtgtttacac agggcagcac cgagcatctg cagggcgatt tttacgctat 1800
ggctctgcgc gccctggaac gtttaggtgc acgtggcatc ttcctgaccg gtgccggtca 1860
ggaacctctg cgtggcctgc ctaaccatgt gctgcagcgc gcttatgctc cgttaggtgc 1920
cctgctgccg agctgtgccg gtctggttca tccgggtggc attggtgcaa tgagtctggc 1980
cctggcagca ggtgttccgc aggtgctgct gccgtgcgcc cacgatcagt ttgataatgc 2040
cgaacgcctg gtgcgtctgg gttgcggtat gcgcttaggt gtgcctctgc gcgagcagga 2100
gttacgcggt gcactgtggc gtctgctgga agatccggca atggccgcag cctgtcgtcg 2160
ctttatggag ctgagccagc cgcatagcat tgcctgcggt aaagcagccc aggtggtgga 2220
acgctgtcac cgcgaaggtg atgcccgctg gctgaaagcc gccagttaag agctcggcgc 2280
gcctgcaggt cgacaagctt gcggccgcat aatgcttaag tcgaacagaa agtaatcgta 2340
ttgtacacgg ccgcataatc gaaattaata cgactcacta taggggaatt gtgagcggat 2400
aacaattccc catcttagta tattagttaa gtataagaag gagatataca tatggatcgc 2460
attgatatgg gcgtgctggt ggttctgttc aatccgggcg acgatgatct ggaacacctg 2520
ggtgagctgg cagccgcctt tccgcagctg cgttttctgg ccgttgacaa tagcccgcat 2580
agcgatccgc agcgtaatgc ccgtctgcgt ggccaaggta ttgccgtttt acaccacggc 2640
aaccgccagg gtattgccgg tgcctttaat cagggcctgg atgcactgtt ccgccgtggt 2700
gttcagggcg ttctgctgct ggaccaggat agccgtccgg gtggtgcctt tctggcagcc 2760
cagtggcgca atctgcaggc ccgtaatggc caggcatgtc tgctgggtcc gcgtatcttt 2820
gatcgcggcg atcgccgctt tctgccggcc attcatttag atggtctgac cctgcgccag 2880
ctgagtctgg atggcttaac caccccgcag cgtaccagct ttctgattag cagtggctgc 2940
ctgctgaccc gtgaagcata tcagcgcctg ggccattttg acgaagagct gtttattgat 3000
catgtggata ccgagtatag cctgcgtgcc caggcactgg acgttccgct gtatgttgat 3060
ccgcgcctgg tgctggaaca tcgcattggc actcgcaaaa cccgtcgtct gggcggtctg 3120
agtctgagcg ccatgaatca tgccccgctg cgccgttatt atctggcacg caacggtctg 3180
ctggttctgc gccgttacgc ccgtagcagt ccgctggccc tgttagccaa tctgccgacc 3240
ctgacacagg gtctggccgt gctgctgctg gaacgcgata aactgctgaa gctgcgttgt 3300
ctgggctggg gcttatggga tggtctgcgt ggtcgtggtg gcgccctgga aacaaatcgc 3360
cctcgcttac tgaaacgcct ggcaggcccg gcagttgcaa gcgttgccag cggtaaagca 3420
aaagcataag gtaccctcga gtctggtaaa gaaaccgctg ctgcgaaatt tgaacgccag 3480
cacatggact cgtctactag cgcagcttaa ttaacctagg ctgctgccac cgctgagcaa 3540
taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaacct 3600
caggcatttg agaagcacac ggtcacactg cttccggtag tcaataaacc ggtaaaccag 3660
caatagacat aagcggctat ttaacgaccc tgccctgaac cgacgaccgg gtcgaatttg 3720
ctttcgaatt tctgccattc atccgcttat tatcacttat tcaggcgtag caccaggcgt 3780
ttaagggcac caataactgc cttaaaaaaa ttacgccccg ccctgccact catcgcagta 3840
ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac atggaagcca tcacagacgg catgatgaac 3900
ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta taatatttgc ccatagtgaa 3960
aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac 4020
ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac cctttaggga aataggccag 4080
gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc 4140
gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca 4200
agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc attgccatac ggaactccgg 4260
atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt 4320
tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga acggtctggt tataggtaca 4380
ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga tgccattggg atatatcaac 4440
ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga 4500
taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct 4560
tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac 4620
agggacacca ggatttattt attctgcgaa gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc 4680
gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag 4740
gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg 4800
tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc agcgctagcg gagtgtatac tggcttacta 4860
tgttggcact gatgagggtg tcagtgaagt gcttcatgtg gcaggagaaa aaaggctgca 4920
ccggtgcgtc agcagaatat gtgatacagg atatattccg cttcctcgct cactgactcg 4980
ctacgctcgg tcgttcgact gcggcgagcg gaaatggctt acgaacgggg cggagatttc 5040
ctggaagatg ccaggaagat acttaacagg gaagtgagag ggccgcggca aagccgtttt 5100
tccataggct ccgcccccct gacaagcatc acgaaatctg acgctcaaat cagtggtggc 5160
gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttcccct ggcggctccc tcgtgcgctc 5220
tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc gtttgtctca 5280
ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac tgtatgcacg 5340
aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 5400
cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt agaggagtta 5460
gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg tgactgcgct 5520
cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt cgaaaaaccg 5580
ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc aaaacgatct 5640
caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga tttcagtgca atttatctct 5700
tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata cgatataagt tgtaattctc atgttagtca 5760
tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 5820
atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 5880
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 5940
gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 6000
tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 6060
cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 6120
tcggtatcgt cgtatcccac taccgagatg tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 6180
atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 6240
atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 6300
tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 6360
cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 6420
aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 6480
ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 6540
tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 6600
tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 6660
gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 6720
gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 6780
gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 6840
ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 6900
taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 6960
ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 7020
atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga aattaatacg 7080
actcactata 7090
<210> 3
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 鼠李糖基转移酶基因SyrhlA
<222> (1)..(888)
<400> 3
atgcgccgcg aaagcctgct ggtgagcgtg tgcaagggcc tgcgtgtgca tgttgaacgc 60
gttggtcaag atcctggtcg tagtaccgtg atgctggtga atggtgctat ggctacaacc 120
gccagctttg cccgtacctg caaatgcctg gccgaacact tcaacgtggt gctgtttgat 180
ctgccgtttg ccggtcagag ccgtcagcac aatccgcagc gcggcctgat caccaaggac 240
gacgaggttg aaatcctgct ggcactgatc gaacgcttcg aagtgaatca cctggttagc 300
gcaagctggg gtggtatcag caccctgctg gcactgagcc gtaatccgcg cggtattcgc 360
agtagcgtgg tgatggcctt tgccccgggc ctgaaccagg ccatgctgga ttatgttggc 420
cgcgcacaag ccctgatcga gctggatgac aaaagcgcca ttggccatct gctgaatgag 480
accgtgggca aatacctgcc gcagcgtctg aaggcaagca accatcagca catggccagc 540
ctggcaaccg gcgaatatga gcaggcacgc tttcacattg atcaggtgct ggcactgaat 600
gatcgcggct atctggcctg cctggagcgc atccagagcc acgtgcactt catcaatggc 660
agctgggacg aatacaccac cgcagaagac gcccgccagt ttcgcgacta tctgccgcac 720
tgtagcttta gccgtgttga aggcaccggc cactttctgg acctggaaag taaactggca 780
gccgttcgtg tgcaccgcgc cttactggaa cacctgctga aacaaccgga accgcagcgt 840
gcagaacgtg cagccggctt tcatgagatg gccatcggtt atgcataa 888
<210> 4
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 鼠李糖基转移酶基因SyrhlB
<222> (1)..(1281)
<400> 4
atgcatgcaa tcctgattgc cattggtagt gccggtgacg tgtttccgtt tatcggcctg 60
gcccgtaccc tgaaactgcg tggccaccgt gtgagcctgt gtaccattcc ggtgtttcgc 120
gacgccgtgg aacaacatgg tattgccttt gtgccgctga gcgacgaact gacatatcgt 180
cgtactatgg gtgatccgcg cctgtgggac cctaaaacca gctttggcgt gctgtggcag 240
gcaatcgccg gcatgatcga gccggtgtac gaatatgtga gtgcccagcg tcatgacgat 300
atcgtggttg tgggcagcct gtgggcctta ggcgcacgta ttgcccacga aaagtacggc 360
atcccgtatc tgagcgccca ggttagtccg agcaccctgc tgagcgcaca tctgccgccg 420
gtgcatccga agttcaacgt gccggaacag atgccgctgg ccatgcgcaa actgctgtgg 480
cgctgcattg aacgtttcaa gctggaccgc acatgcgccc cggagatcaa cgcagtgcgc 540
cgtaaagtgg gcctggaaac cccggtgaaa cgtatcttta cccagtggat gcacagcccg 600
cagggcgttg tgtgtctgtt tccggcatgg tttgccccgc cgcagcagga ttggccgcag 660
ccgctgcaca tgaccggctt tccgctgttc gatggtagca ttcctggcac cccgttagac 720
gatgaactgc agcgcttcct ggaccagggt agccgtccgc tggtgtttac acagggcagc 780
accgagcatc tgcagggcga tttttacgct atggctctgc gcgccctgga acgtttaggt 840
gcacgtggca tcttcctgac cggtgccggt caggaacctc tgcgtggcct gcctaaccat 900
gtgctgcagc gcgcttatgc tccgttaggt gccctgctgc cgagctgtgc cggtctggtt 960
catccgggtg gcattggtgc aatgagtctg gccctggcag caggtgttcc gcaggtgctg 1020
ctgccgtgcg cccacgatca gtttgataat gccgaacgcc tggtgcgtct gggttgcggt 1080
atgcgcttag gtgtgcctct gcgcgagcag gagttacgcg gtgcactgtg gcgtctgctg 1140
gaagatccgg caatggccgc agcctgtcgt cgctttatgg agctgagcca gccgcatagc 1200
attgcctgcg gtaaagcagc ccaggtggtg gaacgctgtc accgcgaagg tgatgcccgc 1260
tggctgaaag ccgccagtta a 1281
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 大肠杆菌核糖体结合位点RBS
<222> (1)..(15)
<400> 5
aaaggaggcc atcct 15
<210> 6
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 鼠李糖基转移酶基因SyrhlC
<222> (1)..(978)
<400> 6
atggatcgca ttgatatggg cgtgctggtg gttctgttca atccgggcga cgatgatctg 60
gaacacctgg gtgagctggc agccgccttt ccgcagctgc gttttctggc cgttgacaat 120
agcccgcata gcgatccgca gcgtaatgcc cgtctgcgtg gccaaggtat tgccgtttta 180
caccacggca accgccaggg tattgccggt gcctttaatc agggcctgga tgcactgttc 240
cgccgtggtg ttcagggcgt tctgctgctg gaccaggata gccgtccggg tggtgccttt 300
ctggcagccc agtggcgcaa tctgcaggcc cgtaatggcc aggcatgtct gctgggtccg 360
cgtatctttg atcgcggcga tcgccgcttt ctgccggcca ttcatttaga tggtctgacc 420
ctgcgccagc tgagtctgga tggcttaacc accccgcagc gtaccagctt tctgattagc 480
agtggctgcc tgctgacccg tgaagcatat cagcgcctgg gccattttga cgaagagctg 540
tttattgatc atgtggatac cgagtatagc ctgcgtgccc aggcactgga cgttccgctg 600
tatgttgatc cgcgcctggt gctggaacat cgcattggca ctcgcaaaac ccgtcgtctg 660
ggcggtctga gtctgagcgc catgaatcat gccccgctgc gccgttatta tctggcacgc 720
aacggtctgc tggttctgcg ccgttacgcc cgtagcagtc cgctggccct gttagccaat 780
ctgccgaccc tgacacaggg tctggccgtg ctgctgctgg aacgcgataa actgctgaag 840
ctgcgttgtc tgggctgggg cttatgggat ggtctgcgtg gtcgtggtgg cgccctggaa 900
acaaatcgcc ctcgcttact gaaacgcctg gcaggcccgg cagttgcaag cgttgccagc 960
ggtaaagcaa aagcataa 978
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> rhlAB-6f
<222> (1)..(32)
<400> 7
gggtccatgg cgcgccgcga aagcctgctg gt 32
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> rhlAB-6r
<222> (1)..(29)
<400> 8
cccgagctct taactggcgg ctttcagcc 29
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> rfbD-1f
<222> (1)..(28)
<400> 9
cggatcatat gaatatcctc ctattcgg 28
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> rfbD-1r
<222> (1)..(29)
<400> 10
cgcggtacct taaattgccg tagtcgtaa 29
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> fabD-1f
<222> (1)..(32)
<400> 11
cgttccatgg cgacgcaatt tgcatttgtg tt 32
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> fabD-1r
<222> (1)..(34)
<400> 12
aaggatcctt aaagctcgag cgccgctgcc atcg 34

Claims (10)

1.一种鼠李糖脂生产质粒，其特征在于：为质粒DJ202，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述鼠李糖脂生产质粒DJ202的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；
(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；
(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202。
3.由权利要求1所述鼠李糖脂生产质粒DJ202获得的大肠杆菌工程菌，其特征在于：是由上述质粒DJ202导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL202。
4.一种鼠李糖脂生产质粒，其特征在于：为质粒DJ208，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.权利要求4所述鼠李糖脂生产质粒DJ208的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；
(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；
(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202；
(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC，其基因序列如SEQ ID NO.6所示；将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游，获得质粒DJ205；
(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游，获得质粒DJ208。
6.由权利要求4所述鼠李糖脂生产质粒DJ208获得的大肠杆菌工程菌，其特征在于：是由上述质粒DJ208导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208。
7.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于：为BL208/402，是由下述方法构建得到的：
(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；
(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；
(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202；
(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC，其基因序列如SEQ ID NO.6所示；将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游，获得质粒DJ205；
(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游，获得质粒DJ208；
(6)通过PCR方式扩增大肠杆菌dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶基因rfbD，通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达载体pRSFDuet-1的T7启动子下游，获得质粒DJ402；
(7)将所述质粒DJ208和DJ402共同导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208/402。
8.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于：为BL208/301，是由下述方法构建得到的：
(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；
(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；
(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202；
(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC，其基因序列如SEQ ID NO.6所示；将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游，获得质粒DJ205；
(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游，获得质粒DJ208；
(6)通过PCR方式扩增大肠杆菌ACP转酰基酶基因fabD，通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达载体pTrcHisA的trc启动子下游，获得质粒DJ301；
(7)将所述质粒DJ208和DJ301共同导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208/301。
9.权利要求7或8所述大肠杆菌工程菌在大肠杆菌合成鼠李糖脂中的应用。
10.根据权利要求9所述的大肠杆菌工程菌的应用，其特征在于：具体步骤为：将工程菌株活化后以1-5％的接种量转接到发酵培养基中，30-37℃160-200r/min培养1-3h，添加0.1-1mM IPTG诱导基因表达，添加氨苄青霉素、氯霉素和硫酸卡那霉素/或和氨苄青霉素，30-37℃160-200r/min培养42-48h；其中，发酵培养基：葡萄糖3-5g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母粉3-6g/L，NaCl 8-12g/L，pH 6.8-7.2。
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