CN104830889B - 一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法 - Google Patents

Abstract

一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，包括以下步骤：根据鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，设计扩增RhlAB基因的引物，以野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的染色体为模板，进行PCR反应扩增RhlAB基因，并应用纯化试剂盒对目的基因切胶回收纯化，将纯化得到的RhlAB基因酶切转入大肠杆菌‑铜绿假单胞菌穿梭表达载体pAK1900中，获得新的质粒pAK1900‑AB，将构建好的表达载体pAK1900‑AB，采用热激法转化的方法导入受体菌铜绿假单胞菌感受态细胞中，涂布羧苄抗性平板，PCR验证所构建工程菌；摇瓶发酵，采用硫酸‑蒽酮法测定鼠李糖脂的产量，极大降低了鼠李糖脂的生产成本，为鼠李糖脂的工业化应用奠定了基础，具有促使鼠李糖脂高产的优点。

Description

一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法。

背景技术

鼠李糖脂是一种糖脂类的阴离子表面活性剂，它具有良好的生物相容性和高效的乳化、增溶以及降低表面张力等能力，在石油开采，生物医药、环境污染物的去除以及食品加工等领域具有广泛的应用前景。

目前，鼠李糖脂的生产菌株主要是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其生产性能的提高一般是通过各种理化诱变技术来提高菌株生产鼠李糖脂的能力，而理化诱变极易回复突变，造成菌株生产性能的不稳定，1994年研究发现参与鼠李糖脂合成的基因rhlA和rhlB，认为它们是合成鼠李糖脂所必需的糖基转移酶基因，2003年进一步研究确定了RhlA是酰基转移酶，是合成HAA（烷基酰酸）所必需的，而HAA（β-羟基癸酰-β-羟基癸酸）和TDP-鼠李糖是合成鼠李糖脂的前体物质，同时HAA也是一种胞外生物表面活性物质，RhlB是催化TDP-鼠李糖与HAA反应生成含有一个鼠李糖基的鼠李糖脂的关键基因，在铜绿假单胞菌中rhlAB是以操纵子的形式存在的，在这一操纵子下，一共可以编码三个蛋白，RhlA、RhlB和RhlR，这三个基因都有自己的终止密码子，但是由于在其起动子前存在核糖体结合位点，从而使得下一个基因得到表达，我们可以利用这一特点直接将其中的RhlAB基因扩增并在其它的细菌种类中进行表达。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，通过扩增鼠李糖脂合成酶基因RhlAB，将其转入大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭质粒pAK1900中，获得新质粒pAK1900-AB；将构建好的表达载体pAK1900-AB导入铜绿假单胞菌中，具有促使鼠李糖脂的高产的特点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，设计用于扩增RhlAB基因(含鼠李糖基转移酶自身启动子和结构基因RhlA，RhlB)的引物，为WA：3’-gaatcgaattcatgcggccgaaagtctgt-5’，

WB：：3’- cggtaagctttcaggacgcagccttcagcc-5’；

2)以野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的染色体为模板，进行PCR反应扩增RhlAB基因，反应结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测其大小和纯度，并应用纯化试剂盒对目的基因切胶回收纯化；

3) 将纯化得到的RhlAB基因酶切转入大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体pAK1900中，获得新的质粒pAK1900-AB；

4）将构建好的表达载体pAK1900-AB，采用热激法转化的方法导入受体菌铜绿假单胞菌感受态细胞中，涂布羧苄抗性平板，PCR验证所构建工程菌；

5) 摇瓶发酵，取 200 μL 铜绿假单胞菌工程菌接入种子培养基(20mL/200mL 锥形瓶) ，于37℃、180 r/min 条件下摇瓶培养12h，然后以 10% 接种量 (v/v)接入发酵培养基 (200mL/500mL 锥形瓶) ，温度为37℃、转速180 r/min，发酵时间为7d；

6)采用硫酸-蒽酮法测定鼠李糖脂的产量。

所述的染色体模板采用野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌（保藏编号：CCTCC NO：M2011287）。

所述的PCR反应扩增RhlAB基因的反应条件为：94 ℃预变性5 min，30 个循环（94℃，0.5 min；50 ℃，0.5 min；68 ℃，1 min），最后在68 ℃条件下延伸10 min。

所述的受体采用菌铜绿假单胞菌（保藏编号：CCTCC NO：M2011287），将铜绿假单胞菌贮存菌液在无抗的LB平板划线，37℃培养，从37°C（16-20h）培养平皿内挑取单菌落，接种于5毫升LB的30毫升灭菌试管中，于37°C下振荡培养，按1%（v/v）接入新鲜的LB液体培养基，取2ml接种于200mlLB培养基中，37°C下200rpm振荡培养2-2.5小时OD600为0.3-0.5左右，将菌液加入事先预冷的无菌离心管中，冰上放置10min后，4℃，4000rpm，离心10min收集对数期细胞，弃上清，再将菌体悬浮于1/10体积（20ml）的无菌、预冷的终浓度为20mmol/L的CaCl2和80mmol/L的MgCl2溶液中，4℃，3,500rpm，离心10min；弃上清，再将菌体悬浮于2ml的预冷的0.1mol/L的无菌CaCl2溶液中，为感受态细胞，分装于1.5ml的Eppendorf管中，200μl/支，加入无菌甘油，使甘油最终含量达到15-20%，于-80℃冰箱中冻存。

所述的热激法转化采用每100µL感受态细胞中加入5-10 µL连接液，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴1min，加入600-800µL LB培养基，于37 ℃摇床培养lh，以使细菌复苏，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。

所述的硫酸-蒽酮法测定通过分别吸取稀释500倍的菌株发酵液1.0 mL于干净试管中，冰水浴中加入4 mL 0.2％的硫酸-蒽酮溶液，混匀后置于沸水浴（100℃）中15 min，取出后自然冷却，以蒸馏水做空白对照，用酶标仪测定620nm的吸光值，根据已测得的鼠李糖标准曲线，计算野生型铜绿假单胞菌和其工程菌株发酵液中鼠李糖脂含量，计算公式如下：

单位mg/L。

本发明的有益效果是：

本发明的技术方案通过该菌株的使用，极大降低了鼠李糖脂的生产成本，为鼠李糖脂的工业化应用奠定了基础，具有促使鼠李糖脂高产的优点。

附图说明

图1为本发明的pAK1900质粒图谱。

图2为本发明的RhlAB基因序列。

图3为本发明的载体pAK1900-AB导入铜绿假单胞菌的PCR验证电泳图。

图4为本发明的鼠李糖数值的标准曲线图。

铜绿假单胞菌保藏信息如下：

拉丁文名称：Pseudomonas aeruginosa，

保藏单位：中国典型培养物保藏中心，

保藏地址：中国武汉武汉大学，

保藏日期：2011年8月15日，

保藏编号：CCTCC NO：M2011287。

具体实施方式

以下结合具体实施对本发明进一步叙述。

产鼠李糖脂的铜绿假单胞工程菌的构建

1) RhlAB基因PCR扩增的引物设计

根据文献报道并在NCBI上查找鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列进行引物设计，用于扩增RhlAB基因(含鼠李糖基转移酶自身启动子和结构基因RhlA，RhlB)。

WA：sense: gaatcgaattcatgcggccgaaagtctgt EcoRI 30nt

WB：anti-sense: cggtaagctttcaggacgcagccttcagcc HindIII 30nt

2)PCR扩增目的基因

以野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌（保藏编号：CCTCC NO：M2011287）的染色体为模板，进行PCR反应，反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，应用试剂盒对目的基因切胶回收纯化，电泳检测其大小和纯度。

3)感受态细胞的制备

CaCl₂法制备感受态细胞：将铜绿假单胞菌贮存菌液在无抗的LB平板划线，37℃过夜培养；从37°C过夜（16-20h）培养平皿内挑取单菌落，把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB的30毫升灭菌试管中，于37°C下振荡培养过夜。按1%（v/v）接入新鲜的LB液体培养基。取2ml接种于200mlLB培养基中，37°C下200rpm振荡培养2-2.5小时OD600为0.3-0.5左右（此时细菌处于对数生长期）。

将菌液加入事先预冷的无菌离心管中，冰上放置10min后，4℃，4000rpm，离心10min收集对数期细胞，弃上清，再将菌体悬浮于1/10体积（20ml）的无菌、预冷的终浓度为20mmol/L的CaCl2和80mmol/L的MgCl2溶液中，4℃，3,500rpm，离心10min；弃上清，再将菌体悬浮于2ml的预冷的0.1mol/L的无菌CaCl2溶液中，即为感受态细胞；分装于1.5ml的Eppendorf管中，200μl/支，加入无菌甘油，使甘油最终含量达到15-20%，于-80℃冰箱中冻存，备用。

4)热激法转化

每100µL感受态细胞中加入5-10 µL连接液，冰浴30min，42 ℃热激45s，冰浴1min，加入600-800µL LB培养基，于37 ℃摇床培养lh，以使细菌复苏，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。转移适量体积（如果使用90毫米平板，一半涂布量不应超过100微升）的经转化处理的感受态细胞涂布于含有羧苄青霉素的LB-琼脂平板上，室温放置平板直到其上液体被吸收，于37°C倒置平板培养，转化克隆应该于12-16h间出现。

5)阳性克隆鉴定

随机挑取10个单克隆，经过PCR和酶切双鉴定，有8个克隆与要求相符，所以阳性克隆形成为80%。

鼠李糖脂含量测定

在分析测试鼠李糖脂时,没有直接的分析测试方法,主要是因为鼠李糖脂有四种分子结构,各种分子结构在鼠李糖脂中所占的比例不同,但鼠李糖是水解鼠李糖脂的脂肪酸链后所得到的结构，其结构比较简单,其分析比较准确、简单,所以在测试鼠李糖脂浓度时,就用鼠李糖的浓度来间接表示，而鼠李糖脂与鼠李糖的换算比例为3:1,即鼠李糖脂浓度是所得到的鼠李糖浓度的三倍。

采用硫酸-蒽酮法测定鼠李糖脂的含量：分别吸取稀释500倍稀释的菌株发酵液1.0 mL于干净试管中，冰水浴中加入4 mL 0.2％的硫酸-蒽酮溶液，混匀后置于沸水浴（100℃）中15 min，取出后自然冷却。以蒸馏水做空白对照，用酶标仪测定620nm的吸光值。

根据已测得的鼠李糖标准曲线，计算野生型铜绿假单胞菌和其工程菌株发酵液中鼠李糖脂含量，表1为菌株代谢产物鼠李糖脂的含量。

计算公式如下：

从表1中可以看出，铜绿假单胞菌野生型发酵液中代谢产物鼠李糖脂的含量为7.08g/L，经基因工程改造后，铜绿工程菌株代谢产物中的鼠李糖脂含量达67.5 g/L，比野生型菌株高出了近10倍，与德国专利报道中的鼠李糖脂含量70 g/L接近。

铜绿假单胞基因工程菌产鼠李糖脂驱油效果的室内评价

1）菌株发酵液降低界面张力能力的测定

采用界面张力仪对长庆油田地层水、培养基、发酵液的油水界面张力进行测定，菌株发酵液与地层水和培养基比较，将油水界面张力分别从 27.88mN/m 和 23.53mN/m 降低到 4.57mN/m，即使稀释 10 倍，仍可以达到 12.16mN/m，说明发酵液具有较强的降低油水界面张力的能力。

2）菌种发酵液表面张力的测定

采用表面张力仪对铜绿假单胞菌工程菌发酵液的表面张力进行测定，结果见表2，从表中可以看到菌株发酵液具有较强的降低表面张力的能力，可将表面张力从68.32mN/m 降低到 27.51mN/m。

3）驱油菌株发酵液对原油的乳化作用

取去离子水、培养基、混合菌株发酵液各 10ml 分别和等体积煤油于 30ml 乳化管中用 Ployron 均质机 10000r/min 均质混合 1min，35℃放置，最初 2h 观察一次，放置7天观察乳化液分离效果。

在最初的 10h 内，菌株发酵液与原油形成的乳化液体积变化比较快，35h 以后，体积基本稳定在 11ml 左右，继续观察没有明显变化，从乳化管的外观看，加入菌株发酵液的原油对瓶壁的脱附能力及溶解性增强，油水能够形成均匀的乳化液，粘度下降，说明菌株发酵液具有良好的乳化效果，在采收原油中具有重要的利用价值。

铜绿假单胞基因工程菌发酵菌液室内驱油模拟实验

为了铜绿假单胞基因工程菌的驱油效果，采用三叠系长6油藏王窑区块原油，在原油饱和的王窑区块地层岩心中注入菌液来模拟地层条件，计算原油采收率，作为矿场试验的实施参考。

利用人工岩芯W1、W2和长6岩芯样品进行微生物驱油模拟试验，试验温度40℃，实验步骤：岩芯模型饱和水→岩芯模型饱和油→水驱实验→微生物驱实验→后续水驱，微生物溶液岩芯模型中的驱油效果见表3。

驱油试验结果表明，长6岩芯随着注入量的增加，采收率可达到30%以上；微生物驱后，注入压力逐渐增大，加后续水驱累计增加采收率9.6 %~13.9%，说明注入微生物扩大了水驱波及体积，通过调驱、洗油作用提高采收率。

发明名称：一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法

申请人：西安海格生物技术研究所有限公司

RhlA

MRRESLLVSVCKGLRVHVERVGQDPGRSTVMLVNGAMATTASFARTCKCLA

EHFNVVLFDLPFAGQSRQHNPQRGLlTKDDEVEILLALIERFEVNIILVSASWG

GISTLLALSRNPRGIRSSVVMAFAPGLNQAMLDYVGRAQALIELDDKSAIGH

LLNETVGKYLPPRLKASNHQHMASLATGEYEQARFHIDQVLALNDRGYLAC

LERIQSHVHFINGSWDEYTTAEDARQFRDYLPHCSFSRVEGTGHFLDLESKLA

AVRVHRALLEHLLKQPEPQRAERAAGFHEMAIGYA

RhlB

MHAILIAIGSAGDVFPFIGLARTLKLRGHRVSLCTIPVFRDAVEQHGIAFVPLS

DELTYRRTMGDPRLWDPKTSFGVLWQTlAGMlEPVYEYVSAQRHDDIVVVGS

LWALGARIAHEKYGIPYLSAQVSPSTLLSAHLPPVHPKFNVPEQMPLAMRKL

LWRCIERFKLDRTCAPDINAVRRKVGLETPVKRIFTQWMHSPQGVVCLFPAW

FAPPQQDWPQPLHMTGFPLFDGSIPGTPLDDELQRFLDQGSRPLVFTQGSTEH

LQGDFYAMALRALERLGARGIFLTGAGQEPLRGLPNHVLQRAYAPLGALLPS

CAGLVHPGGIGAMSLALAAGVPQVLLPCAHDQFDNAERLVRLGCGMRLGVP

LREQELRGALWRLLEDPAMAAACRRFMELSQPHSIACGKAAQVVERCHREG

OARWLKAAS

Claims (6)

1.一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据鼠李糖脂合成酶RhlAB基因序列，设计用于扩增RhlAB基因的引物，为WA：3’-gaatcgaattcatgcggccgaaagtctgt-5’，

WB：3’-cggtaagctttcaggacgcagccttcagcc-5’；

其中，所述RhlAB基因含鼠李糖基转移酶自身启动子和结构基因RhlA与RhlB；

2)以野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的染色体为模板，进行PCR反应扩增RhlAB基因，反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测其大小和纯度，并应用纯化试剂盒对目的基因切胶回收纯化；

3)将纯化得到的RhlAB基因酶切转入大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体pAK1900中，获得新的质粒pAK1900-AB；

4)将构建好的表达载体pAK1900-AB，采用热激法转化的方法导入受体菌铜绿假单胞菌感受态细胞中，涂布羧苄抗性平板，PCR验证所构建工程菌；

5)摇瓶发酵，取200μL铜绿假单胞菌工程菌接入处于200mL锥形瓶中的20mL种子培养基，于37℃、180r/min条件下摇瓶培养12h，然后以10％接种量(v/v)接入处于500mL锥形瓶中的200mL发酵培养基，温度为37℃、转速180r/min，发酵时间为7d；

6)采用硫酸-蒽酮法测定鼠李糖脂的产量。

2.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，所述的染色体模板采用野生型产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌，所述铜绿假单胞菌的保藏编号为CCTCC NO：M2011287。

3.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，所述的PCR反应扩增RhlAB基因的反应条件为：94℃预变性5min；

30个循环：94℃，0.5min；50℃，0.5min；68℃，1min；

最后在68℃条件下延伸10min。

4.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，所述的受体菌采用保藏编号为CCTCC NO：M2011287的铜绿假单胞菌，将铜绿假单胞菌贮存菌液在无抗的LB平板划线，37℃培养，从37℃培养16-20h的平皿内挑取单菌落，接种于5毫升LB的30毫升灭菌试管中，于37℃下振荡培养，按1％(v/v)接入新鲜的LB液体培养基，取2mL接种于200mL LB培养基中，37℃下200rpm振荡培养2-2.5小时OD₆₀₀为0.3-0.5，将菌液加入事先预冷的无菌离心管中，冰上放置10min后，4℃，4000rpm，离心10min收集对数期细胞，弃上清，再将菌体悬浮于1/10体积，即20mL，的无菌、预冷的终浓度为20mmol/L的CaCl₂和80mmol/L的MgCl₂溶液中，4℃，3,500rpm，离心10min；弃上清，再将菌体悬浮于2mL的预冷的0.1mol/L的无菌CaCl₂溶液中，为感受态细胞，分装于1.5mL的Eppendorf管中，200μL/支，加入无菌甘油，使甘油最终含量达到15-20％，于-80℃冰箱中冻存。

5.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，所述的热激法转化采用每100μL感受态细胞中加入5-10μL连接液，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴1min，加入600-800μL LB培养基，于37℃摇床培养lh，以使细菌复苏，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。

6.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法，其特征在于，所述的硫酸-蒽酮法测定通过分别吸取稀释500倍的菌株发酵液1.0mL于干净试管中，冰水浴中加入4mL0.2％的硫酸-蒽酮溶液，混匀后置于100℃的沸水浴中15min，取出后自然冷却，以蒸馏水做空白对照，用酶标仪测定620nm的吸光值A，根据已测得的鼠李糖标准曲线，计算野生型铜绿假单胞菌和其工程菌株发酵液中鼠李糖脂含量，计算公式如下，其中，n＝发酵液稀释倍数：

单位mg/L。