CN101948787A - 筛选鼠李糖脂产生菌的方法及所用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于筛选鼠李糖脂产生菌的培养基，该培养基中是以液体石蜡为碳源，并添加绿脓素作为抑制剂。本发明还提供了所述的培养基在用于筛选鼠李糖脂产生菌中的应用，以及利用所述培养基筛选鼠李糖脂产生菌的方法，并进一步提供了按照所述的方法筛选得到的鼠李糖脂产生菌。应用本发明的培养基筛选鼠李糖脂产生菌，筛选率高。
Description
技术领域
本发明属于能源生物技术和环境生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种用于筛选鼠李糖脂产生菌的培养基，以及利用该培养基筛选鼠李糖脂产生菌的方法，能够筛选出可高产鼠李糖脂、显著提高微生物采油效率的菌株，提高筛选率。
背景技术
鼠李糖脂(RL)是目前研究较多的一种生物表面活性剂，具有乳化、增溶、降低界面张力等功能，低毒、易生物降解，在石油化工、石油开采、生物医药、食品及环境保护等领域有很大应用前景。目前世界范围内，研究最多的产鼠李糖脂最高的菌种为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，且多种铜绿假单胞菌可以利用不同碳源生成鼠李糖脂，其制备主要通过微生物发酵，再从发酵液中提取得到。在微生物采油中，鼠李糖脂是一种非常有效的驱油剂，铜绿假单胞菌被普遍认为是微生物采油的有效功能菌。国内经微生物发酵得到的鼠李糖脂产量较低，从发酵液中分离提取鼠李糖脂的工艺复杂、生产成本偏高，限制了其规模化生产及应用。如CN1891831A公开的RL最大产量仅为23g/L，时进钢等在专利中公开的发酵液中RL的质量浓度为30～40g/L。因此，提高发酵液中的鼠李糖脂产量，降低提取成本，对鼠李糖脂的推广应用很有意义，关键就在于高产鼠李糖脂的菌种和发酵工艺。
然而在自然界，筛选产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌具有随机性，尤其是在石油微生物开采领域，采用目前文献上提及的方法和已存在的筛选方法，从油藏地层水中筛选铜绿假单胞菌具有随机性，不能针对性地筛选出铜绿假单胞菌，选择性差，筛选率低。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于筛选鼠李糖脂产生菌的培养基，利用该培养基能有效地从含有鼠李糖脂产生菌的菌源中筛选出鼠李糖脂产生菌，提高筛选率。
本发明的另一目的在于提供所述的培养基在用于筛选鼠李糖脂产生菌中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种筛选鼠李糖脂产生菌的方法，该方法准确度高，所得菌种鼠李糖脂产量高。
本发明的另一目的在于提供按照所述的方法筛选得到的鼠李糖脂产生菌。
一方面，本发明提供了一种用于筛选鼠李糖脂产生菌的培养基，该培养基中是以液体石蜡为碳源，并添加绿脓素作为抑制剂。
与现有技术相比，本发明的方法独有之处在于：①在筛选过程中，所用的富集培养基以液体石蜡为唯一碳源，保证了所得到的菌株能够以烃类为碳源，而以烃类为碳源能够促进生物表面活性剂的合成；②在筛选过程中，富集培养基中加入了绿脓素，这是一种铜绿假单胞菌在生长过程中合成的特有色素，对其他细菌具有抑制生长的作用，从而保证筛选的准确性和选择性。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于筛选鼠李糖脂产生菌的培养基为液体培养基，其中，液体石蜡的含量为5～15g/L，绿脓素的含量为5～15g/L。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于筛选鼠李糖脂产生菌的培养基中包括：NaNO3 2～4g/L，Na2HPO4 1～2g/L，MgSO4·7H2O 0～1g/L，NaCl 0～5g/L，酵母粉0～1g/L，液体石蜡5～15g/L，绿脓素5～15g/L，pH 7.2～7.5。
另一方面，本发明还提供了所述的培养基在用于筛选鼠李糖脂产生菌中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种筛选鼠李糖脂产生菌的方法，其中应用本发明所述的培养基作为富集培养基。
根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选鼠李糖脂产生菌的方法包括步骤：
a.以油田油藏地层水作为菌种筛选源，接种于本发明所述的以液体石蜡为碳源并添加绿脓素作为抑制剂的培养基中，30～38℃培养100～200h，得到菌种培养液；
b.将步骤a中得到的菌种培养液涂布于(可根据培养基的浓度和实际培养情况对培养液进行适当稀释后再涂布，一般要求稀释在108，为了节约时间和减少培养基的浪费可选择104、105、106梯度稀释)溶血琼脂平板培养基或LB琼脂平板培养基上，34～37℃培养24～48h，根据菌落形态挑选菌种。
根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选鼠李糖脂产生菌的方法中，所述步骤a中油田油藏地层水与所述培养基的接种比例可以为1∶4～10(v/v)，具体可根据油水样是否新鲜以及地层水中菌体数量适当调整。
根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选鼠李糖脂产生菌的方法中，是挑选具有以下菌落形态的菌种：
同形态菌落数居多或者溶血圈大；菌落灰褐色，偏平，边缘不整齐，且常呈相互融合状态；菌落周围有水溶性色素，使培养基被染成蓝绿色或黄绿色；菌落有金属光泽或者有生姜气味。
根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选鼠李糖脂产生菌的方法还包括步骤：
c.将步骤b中挑选的菌种接入发酵培养基中进行发酵培养，采用排油圈法、表面张力SF测量及EL24测量，选择表面活性高的菌种；和/或进行16SrDNA分析鉴定菌种的种属；具体的分析检测方法可以按照本领域的常规操作进行；
所述发酵培养基可以为本发明的以液体石蜡为碳源并添加绿脓素作为抑制剂的培养基，也可以是现有技术中常用的铜绿假单胞菌发酵培养基例如以以植物油、石油烃等为碳源的培养基；培养条件通常是30～38℃培养80h～200h，可先进行种子培养，然后再扩大培养。
本发明中，经筛选得到的鼠李糖脂产量高的菌种可在零下80℃甘油保存。
另一方面，本发明还提供了按照所述的方法筛选得到的鼠李糖脂产生菌。
在本发明的一具体实施方案中，按照本发明所述的方法，筛选得到了高产鼠李糖脂的菌株，其中一株铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa本发明中命名为SLQT-6以植物油、石油烃等为碳源发酵可以高产鼠李糖脂，特别是以废弃油为碳源发酵产鼠李糖脂，最高产量达到60.86g/L，大大提高了鼠李糖脂的产量，取得了预料不到的技术效果。所述铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6菌株已于2010年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.4002。
本发明具有如下显著优点：(1)在菌种初筛过程中选用了液体石蜡为碳源，以绿脓素为抑制剂的液体培养基富集培养，使生物表面活性剂产生菌在富集过程中成为优势的菌种，同时在绿脓素存在下，使得产鼠李糖脂的假单胞菌成为优势菌。然后稀释涂布于溶血琼脂培养基平板进行筛选，产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌在该培养基上生长具有以下特征：菌落成灰褐色或者褐色，偏平，四周边扩散，表面润湿，菌落周围培养基被水溶性色素染色，菌落散发着一种特殊的气味。整个平板上，几乎没有观察到其他性状的菌落，因此与目前存在的筛选方法相比，本发明中筛选方法选择性极强。(2)分离初次筛选平板上的菌落，分别LB扩大培养后，进行16S rDNA分析，得出66％以上的菌落均所属于假单胞菌，能够产生鼠李糖脂。(3)筛选得到的假单胞菌中，以鼠李糖脂产量为标准，通过显色反应，蒽酮硫酸法测鼠李糖脂含量，鼠李糖脂产量均较高。可见本发明的筛选鼠李糖脂产生菌的方法具有很强的使用性，以及具有工业化生产的好前景。(4)本发明过程简易，操作性强，重复性高，通过室内的大量实验发现，该法在蒙古林油藏地层水、新疆六中区油藏地层水、大庆九厂油藏地层水等都能有效地筛选得到铜绿假单胞菌，筛选准确性66％以上。同时，通过实验也验证了绿脓素对其他菌体生长的抑制作用，尤其是对其他烃降解菌的抑制作用。本发明的方法是筛选高产鼠李糖脂菌种的好方法，具有很高的应用价值。
附图说明
图1为本发明鼠李糖脂产生菌的筛选方法的流程示意图。
图2为实施例1中硫酸-蒽酮法测鼠李糖脂含量的标准曲线图。图中横坐标为：μg/ml。
图3为实施例2中maker和12个水样中菌株16S rDNA V9区段PCR产物电泳图谱。图中除了两个maker外出现了13个条带，其中第13个条带实为第7个样品的平行样。
图4为实施例2中12个水样中菌株16S rDNA V9区段PCR产物的DGGE分析图谱。
图5为应用本发明筛选出的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6以不同碳源发酵生产表面活性剂中的鼠李糖脂含量对比分析图表。
图6为应用本发明筛选出的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6以不同菌体接种量对废水进行处理的铅去除率比较分析图表。
图7为应用本发明筛选出的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6处理不同浓度铅含量的废水时的去除率效果分析图表。
用于专利程序的微生物保存：
保藏日期：2010年07月13日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏编号：CGMCC No.4002；
分类命名：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的培养基及筛选方法以及所筛选得到的菌株的特点和所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。
实施例1
本实施例的用于筛选鼠李糖脂产生菌的富集培养基的组成(g/L)：
NaNO3 3.5，Na2HPO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1.5，酵母粉0.3，液体石蜡10，绿脓素10，pH 7.2～7.5，水余量；
该培养基的制作方法：按照以上配方混合，1×105Pa灭菌30min，备用。
本实施例中所用菌种来源：于2009年11月3日采集于华北蒙古林的腾格尔组腾一段下部第3小层的2、3细层的油田油藏地层水，去除肉眼可见机械杂质。
本实施例的应用上述培养基筛选鼠李糖脂产生菌的方法请结合参见图1所示。本实施例中，以油田油藏地层水为菌种来源，取地层水10ml，接入90ml富集培养基，250m三角瓶，置于37℃摇床培养，转速200r/min。培养7d后取出富集培养液，梯度稀释，分别取稀释倍数为104、105的菌液均匀涂布于LB琼脂平板培养基和溶血琼脂平板培养基，置于35℃培养箱培养36h，观察菌落形态，挑选同形态菌落数居多或者溶血圈大的菌种，尤其选择具有以下特征的菌落：灰褐色，偏平，边缘不整齐，且常呈相互融合状态，菌落周围有水溶性色素，使培养基被染成蓝绿色或黄绿色，菌落有金属光泽或者有生姜气味。
接种环挑取目标菌落接种于发酵培养基中，250ml三角瓶，装液量100ml，34℃ 200r/min摇床培养。80h后取出发酵液，60℃水浴加热10min，10000*g离心20min，取上清液分别用排油方法、圈表面张力SF和乳化系数EI24测试表面活性，选择排油圈直径大于10cm、表面张力低于30mN/m，且EI24为90％以上的的菌种作为高产菌保存。将去细胞发酵液上清液毛细管点样于薄层层析TLC分析硅胶板上，展开剂为氯仿∶甲烷∶乙酸(V/VV)＝65∶15∶2于层析缸中，将点样的硅胶板放入层析缸，待展开剂距离硅胶板顶部1cm时取出，待展开剂挥发后用玻璃喷雾器向硅胶板均匀喷洒显色剂(显色剂：2g蒽酮溶解到80％H2SO4中，以80％H2SO4定容到1000ml)110℃下加热5min显色。鼠李糖脂产生菌发酵液经展开显色后会出现棕黄色斑点，Rf值为0.62。因此，选择硅胶板上斑点Rf值为0.62且颜色浓重的菌种保存。
本实施例中，所述溶血平板培养基(g/L)：蔗糖10、牛肉膏蛋白胨1、酵母膏2、琼脂20、羊血0.3pH 7.0～7.5。所述LB培养基(g/L)：蔗糖5、牛肉膏蛋白胨0.5、酵母膏0.2、NaCl0.2、pH 7.0～7.5。所述发酵培养基(g/L)：豆油60、NaNO36、酵母膏1.5；K2HPO40.3％、CaCl20.010％、MgSO40.024％、FeSO40.01％、Na2MO40.01％、pH7.0～7.5。
摇瓶发酵条件：250mL三角瓶装100mL种子培养基(LB培养基)，接种后置于旋转式摇床上培养36h(200r/min，37℃)得种子液。250mL三角瓶装90mL发酵培养基，灭菌后接入10mL种子液，置于旋转式摇床上200r/min，37℃培养100h。
本实施例中，所述排油圈方法如下：取直径为15cm的培养皿经洗涤剂清洗，去离子水冲洗3次后，加入50mL去离子水，缓慢滴加0.5mL正十六烷于水表面，形成一层薄薄的油膜，在油膜中心慢慢加入30μL的去细胞发酵上清液，中心油膜被挤向四周形成圆圈，圆圈直径与表面活性剂含量成正比。排油圈直径越大，说明表面活性剂产量越高。
本实施例中，所述表面张力SF测量：采用表面张力仪，表面张力越小说明表面活性越好。
本实施例中，所述乳化系数EI24测量：在带刻度的试管中，加入7mL测试烃(0#柴油)和3mL发酵液上清液，涡旋振荡器充分振荡2min，静置24h，以乳化指数(Emusification index，EI24)表示乳化剂的乳化活性。EI24为油水界面上层高度占总高度的百分数。EI24越大说明表面活性越好，稳定性越高。
本实施例中，所筛选的假单胞菌发酵液上清液中鼠李糖脂含量采用比色法检测：
显色剂：2g蒽酮溶解到80％H2SO4中，以80％H2SO4定容到1000ml。
a.制备标准曲线：如图2所示。
b.发酵液中鼠李糖脂含量检测：(1)发酵液加热到60℃，离心除去菌体；(2)加入HCl进行水解。在进行水解的时候温度应该在100～120℃之间，pH值应该在1.5左右，时间为3.5小时；(3)过滤取上清液，用乙酸乙酯抽提除去β-羟基癸酸，分层取清液；(4)在大试管中(试管内径16～20mm可使硫酸加入后快速散热，从而达到良好的混合)加0.2％的蒽酮-浓硫酸为显色剂4.0mL，沿试管壁滴加样品1.0mL，冷却后沸水浴加热20min，之后冷却于30min内在553nm处测定溶液的OD值；(5)根据标准曲线和稀释倍数计算发酵液中鼠李糖脂含量(标准曲线对应的含量*300/1000＝最后含量g/L)。
本实施例中，根据所述菌落特征共选出10个目标菌落，发酵培养液均具有较高的表面活性，TLC分析此法得到的10株发酵液具有表面活性的菌种中鼠李糖脂产生菌为9株，鼠李糖脂产生菌筛选率达66％以上。扩增所述9株鼠李糖脂产生菌16S rDNA，进行序列测定和系统进化分析，得出该9株菌均属于假单胞菌属，其中7株为铜绿假单胞菌，同源性在98％以上。所述菌株可于-80℃甘油管保存。
经鼠李糖脂含量测定，9株产鼠李糖脂的菌中产量最高的一株铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，命名为SLQT-6，该铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6菌株已于2010年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.4002。
发明人在实验过程中对相同来源的水样另进行了二组平行实验，根据所述菌落特征分别选出10个目标菌落，TLC分析此法得到的10株发酵液具有表面活性的菌种中鼠李糖脂产生菌为分别为10株、9株，鼠李糖脂产生菌筛选率高。
此外，发明人在研究过程中还采用以葵花籽油或原油等为碳源、不添加绿脓素的培养基作为富集培养基(培养基的其他组分同上述本发明的添加绿脓素的培养基)对相同来源的水样进行筛选，结果具有随机性(整个平板上甚至观察不到符合本发明所述菌落特征的纯菌落)。
实施例2
针对不同油藏的地层水，应用本发明实施例1中提及的筛选方法对蒙古林油藏地层水、新疆六中区油藏地层水、大庆九厂油藏地层水、胜利油田地层水进行目标菌种的筛选，共16个样品。培养后10000rpm离心收集菌体，用DNA提取盒提取12个样品菌体的基因组，PCR扩增后产物进行DGGE分析，割胶回收基因组后进行序列测定和系统进化分析。分析结果请参见下表1和表2，并请结合参见图3、图4。
表1 水样来源
表2 对水样进行筛选所用富集培养基及筛选结果
通过上述实验，12个水样中经过本发明筛选方法所富集的菌株大多均属于假单胞菌属，经过DGGE割胶DNA回收测序，约80％的菌株为铜绿假单胞菌，同源性在96％以上。可见此法在不同油藏地层水中筛选目标菌种具有较好的重复性。证明本发明的方法与常规筛选方法相比，具有较高的选择性(发明人在研究过程中还采用现有技术中的常规筛选方法对同样的水样进行了铜绿假单胞菌筛选实验，结果具有随机性，在上百次的对各水样的筛选实验中，得到铜绿假单胞菌的几率很少，仅约1％左右)
应用实例1
本实例中，以本发明筛选得到的菌株SLQT-6为例，采用不同碳源(分别为地沟油、煎炸废油、餐饮废油、葵籽油废料、石油、0#柴油、汽油)，分别进行发酵生产鼠李糖脂。具体方法如下：
将本发明筛选得到的菌株SLQT-6接种于LB培养基，100ml三角瓶，装液量30ml，34℃200r/min培养；10h后菌液接种于发酵一级培养基(酵母膏0.3％、硝酸钠0.6％、氯化钠0.5％，pH调到7.2-7.5)中，250ml三角瓶，装液量100ml，34℃200r/min摇床培养；10h后转入发酵二级培养基(酵母膏0.5％、硝酸钠1.0％、氯化钠0.5％、氯化钙0.01％、硫酸亚铁0.004％、钼酸钠0.05％。pH调到7.2-7.5)中，2L三角瓶，装液量500ml，34℃200r/min摇床培养；10h后转入发酵三级培养基(碳源80g/L、NaNO310g/L、酵母膏1.5g/L；K2HPO40.3％、CaCl20.010％、MgSO40.024％、FeSO40.01％、Na2MO40.01％、pH7.0～7.5)中，10L智能发酵罐，装液量5L，前10h为34℃300r/min，后期为37℃ 200r/min培养，90h后，取出发酵液60℃水浴加热10min，10000*g离心20min去掉菌体，取发酵液上清液，采用比色法检测得鼠李糖脂含量。
本实例中，分别以地沟油、煎炸废油、餐饮废油、葵籽油废料、石油、0#柴油、汽油为碳源发酵合成鼠李糖脂含量检测数据分别为54.88、45.25、60.86、49.57、13.48、10.05、9.68(g/L)(请结合参见图5)。
本实例的结果可表明，本发明的铜绿假单胞菌SLQT-6在以不同碳源的发酵生产中均可产生鼠李糖脂含量，特别是在以废弃油为碳源进行发酵生产生物表面活性剂方面产生了预料不到的技术效果，据此，应用本发明的菌种，可以以废弃油为碳源发酵生产鼠李糖脂，可以降低成本和变废为宝。
应用实例2 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6在处理废水中重金属方面的应用
本实例中，利用本发明筛选得到的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6发酵去除废水中的重金属铅。
1.实验材料
含铅废水：根据实际工业废水参数，本实验用铅酸二氢钾模拟含铅废水浓度在10～200mg/L之间。加入适当的营养剂，以供菌体代谢活动。含铅废水参数(g/L)：Pb(NO3)2 0.01～0.2、NaNO3 3.0、Na2HPO4 1.0、KH2PO4 1.0、MgSO4·7H2O 0.5、NaCl 1.5、FeCl2 0.5、酵母粉0.3、葡萄糖5，pH7.2～7.5。
微生物：铜绿假单胞菌SLQT-6，在LB(牛肉蛋白胨0.5％、酵母粉1％、氯化钠0.2％，pH7.0～7.2)培养基中，100ml三角瓶，装液量30ml，34℃200r/min培养10h，发酵菌液作为液态铜绿假单胞菌制剂备用。
2.铅的测定方法
采用国家标准GB 5009.12-2010分析方法。
3.生化处理方法
取一定体积含铅废水置于250mL锥形瓶中，加入菌液制剂，调节废水pH，置于振荡器上振荡，充分接触。培养5天后取适量培养液中测定铅的含量，计算其去除率。去除率可用生化去除效率来表示。
生化去除效率E可用下式计算：
E＝G/G0，其中：E-生化去除效率，％；G-生化去除量，mg；G0-初始质量，mg。
4.不同接种量对含铅废水的处理效果实验
在盛有100mL含铅浓度为100mg/L的废水的锥形瓶中，调节废水pH为中性，加入不同接种量的菌液，置于振荡器上振荡37℃ 200rpm摇床培养5天，计算其去除率。
本实施例中，不同菌体接种量对处理浓度为100mg/L含铅废水效果的影响请参见图6。结果表明：在浓度为100mg/L的实验室模拟含铅废水实验中，菌体接种量为0.5％时，去除率约53％；菌体接种量为2％时，铅去除率为58.06％；随着接种量的增加，含铅废水的去除率有所增加。
5.不同浓度废水的处理效果实验
在盛有100mL铅浓度分别为10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L的含铅废水的锥形瓶中，调节废水pH为中性，依次加入10％菌液，置于振荡器上振荡37℃ 200rpm摇床培养5天，计算其去除率。
本实施例中，废水中铅不同浓度对去除效果的影响请参见图7所示。结果表明，当含铅培养液的浓度由40mg/L增加到200mg/L时，去除率由62.64％逐渐缓慢减少到60.09％，当含铅废水的浓度由30mg/L降低到10mg/L时，去除率由62.64％急剧增大到82.16％。可见，SLQT-6对含铅培养液的处理有良好效果。在本实验中微生物对铅的去除率存在一个临界生化去除量(critical absorption)，做曲线的两条切线交于一点如图所示，此点对应的浓度为35.2mg/L，去除率为62.5％，临界生化去除量为35.2mg/L×62.5％＝22mg/L。
Claims (10)
1.一种用于筛选鼠李糖脂产生菌的培养基，该培养基中是以液体石蜡为碳源，并添加绿脓素作为抑制剂。
2.根据权利要求1所述的培养基，该培养基为液体培养基，其中，液体石蜡的含量为5～15g/L，绿脓素的含量为5～15g/L。
3.根据权利要求1所述的培养基，该培养基中包括：NaNO3 2～4g/L，Na2HPO4 1～2g/L，MgSO4·7H2O 0～1g/L，NaCl 0～5g/L，酵母粉0～1g/L，液体石蜡5～15g/L，绿脓素5～15g/L，pH 7.2～7.5。
4.权利要求1～3任一项所述的培养基在用于筛选鼠李糖脂产生菌中的应用。
5.一种筛选鼠李糖脂产生菌的方法，其中应用权利要求1～3任一项所述的培养基作为富集培养基。
6.根据权利要求5所述的筛选鼠李糖脂产生菌的方法，该方法包括步骤：
a.以油田油藏地层水作为菌种筛选源，接种于权利要求1～3任一项所述的培养基中，30～38℃培养100～200h，得到菌种培养液；
b.将步骤a中得到的菌种培养液涂布于溶血琼脂平板培养基或LB琼脂平板培养基上，34～37℃培养24～48h，根据菌落形态挑选菌种。
7.根据权利要求6所述的筛选鼠李糖脂产生菌的方法，其中，所述步骤a中油田油藏地层水与权利要求1～3任一项所述的培养基的接种比例为1∶4～10(v/v)。
8.根据权利要求6所述的筛选鼠李糖脂产生菌的方法，其中，挑选具有以下菌落形态的菌种：
同形态菌落数居多或者溶血圈大；菌落灰褐色，偏平，边缘不整齐，且常呈相互融合状态；菌落周围有水溶性色素，使培养基被染成蓝绿色或黄绿色；菌落有金属光泽或者有生姜气味。
9.根据权利要求6所述的筛选鼠李糖脂产生菌的方法，该方法还包括步骤：
c.将步骤b中挑选的菌种接入发酵培养基中进行发酵培养，采用排油圈法、表面张力SF测量及EL24测量，选择表面活性高的菌种；和/或进行16S rDNA分析鉴定菌种的种属；所述发酵培养基为权利要求1～3任一项所述的培养基，或是以植物油、石油烃或是废弃油为碳源的培养基。
10.按照权利要求5～9任一项所述的方法筛选得到的鼠李糖脂产生菌，优选地，该鼠李糖脂产生菌为保藏编号为CGMCC No.4002的铜绿假单胞菌。
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Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104830889A (zh) * | 2015-03-06 | 2015-08-12 | 西安海格生物技术研究所有限公司 | 一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法 |
| CN105670969A (zh) * | 2016-03-10 | 2016-06-15 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种人工湿地堵塞缓解细菌的筛选方法及应用 |
| CN106077075A (zh) * | 2016-06-16 | 2016-11-09 | 北京益博科环保科技有限公司 | 一种加油站污染土壤的生物强化修复方法 |
| US9884883B2 (en) | 2015-01-12 | 2018-02-06 | Logos Technologies, Llc | Production of rhamnolipid compositions |
| CN109423454A (zh) * | 2017-08-29 | 2019-03-05 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种利用ctab筛选产生物表面活性剂菌株的方法 |
| CN109852361A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-06-07 | 天津瑞达同方生物科技开发有限公司 | 一种耐温抗盐复合降粘剂及其制备方法与应用 |
| CN110997927A (zh) * | 2017-07-31 | 2020-04-10 | 罗格斯技术有限责任公司 | 使用至少两种碳源增强鼠李糖脂类的生产 |
| CN111057645A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-24 | 百沃星联(上海)环保科技有限公司 | 一种食物分解用微生物存储装置及其存储方法 |
| CN111608623A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-09-01 | 夏文杰 | 一种应用于油气资源开采的生物纳米制剂 |
| CN111607372A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-09-01 | 新疆新易通石油科技有限公司 | 一种用于稠油开采的生物纳米制剂及其制备方法和应用 |
| US10829507B2 (en) | 2017-02-06 | 2020-11-10 | Stepan Company | Decolorization of concentrated rhamnolipid composition |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030059844A (ko) * | 2001-12-28 | 2003-07-12 | 옥민 | 레지오넬라속 균주에 대해 항균활성을 가지는 슈도모나스에루지노사 및 이를 이용한 항균용 조성물 |
| CN101457214A (zh) * | 2009-01-09 | 2009-06-17 | 中国石油大学(北京) | 一种假单胞菌的筛选方法及其转化生产表面活性剂的方法 |
| CN101948786A (zh) * | 2010-09-03 | 2011-01-19 | 中国石油天然气股份有限公司 | 高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用 |
-
2010
- 2010-09-03 CN CN2010102731287A patent/CN101948787B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030059844A (ko) * | 2001-12-28 | 2003-07-12 | 옥민 | 레지오넬라속 균주에 대해 항균활성을 가지는 슈도모나스에루지노사 및 이를 이용한 항균용 조성물 |
| CN101457214A (zh) * | 2009-01-09 | 2009-06-17 | 中国石油大学(北京) | 一种假单胞菌的筛选方法及其转化生产表面活性剂的方法 |
| CN101948786A (zh) * | 2010-09-03 | 2011-01-19 | 中国石油天然气股份有限公司 | 高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《diagn microbiol infect dis》 19991231 A. Rene D. Massengale等 use of the paraffin wax baiting system for identification of pseudomonas aeruginosa clinical isolates 第35卷, 2 * |
| 《油田化学》 20091225 夏文杰等 烃降解菌WJ-1及其生物表面活性剂特性研究 第26卷, 第4期 2 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9884883B2 (en) | 2015-01-12 | 2018-02-06 | Logos Technologies, Llc | Production of rhamnolipid compositions |
| CN104830889B (zh) * | 2015-03-06 | 2019-01-25 | 西安海格生物技术研究所有限公司 | 一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法 |
| CN104830889A (zh) * | 2015-03-06 | 2015-08-12 | 西安海格生物技术研究所有限公司 | 一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法 |
| CN105670969A (zh) * | 2016-03-10 | 2016-06-15 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种人工湿地堵塞缓解细菌的筛选方法及应用 |
| CN106077075A (zh) * | 2016-06-16 | 2016-11-09 | 北京益博科环保科技有限公司 | 一种加油站污染土壤的生物强化修复方法 |
| US10829507B2 (en) | 2017-02-06 | 2020-11-10 | Stepan Company | Decolorization of concentrated rhamnolipid composition |
| CN110997927A (zh) * | 2017-07-31 | 2020-04-10 | 罗格斯技术有限责任公司 | 使用至少两种碳源增强鼠李糖脂类的生产 |
| CN109423454A (zh) * | 2017-08-29 | 2019-03-05 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种利用ctab筛选产生物表面活性剂菌株的方法 |
| CN109852361A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-06-07 | 天津瑞达同方生物科技开发有限公司 | 一种耐温抗盐复合降粘剂及其制备方法与应用 |
| CN109852361B (zh) * | 2019-03-20 | 2021-10-01 | 天津开发区天盈企业有限公司 | 一种耐温抗盐复合降粘剂及其制备方法与应用 |
| CN111057645A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-24 | 百沃星联(上海)环保科技有限公司 | 一种食物分解用微生物存储装置及其存储方法 |
| CN111608623A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-09-01 | 夏文杰 | 一种应用于油气资源开采的生物纳米制剂 |
| CN111607372A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-09-01 | 新疆新易通石油科技有限公司 | 一种用于稠油开采的生物纳米制剂及其制备方法和应用 |
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