CN103074243B - 一株伯克霍尔德氏菌qz7及其产生生物表面活性剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)QZ7及其产生生物表面活性剂的应用。经16sRNA鉴定，该菌株属于伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)，菌株保藏编号为CGMCC No：6269。该菌产生的表面活性剂为阴离子型，脂肪醇类。其最佳发酵条件为花生油10g/L，NaNO₃ 1.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，温度为35℃，pH为7.0，接种量为10％。发酵培养24h表面活性剂产量达到最大值0.85g/L，表面张力为30.74mN/m，临界胶束浓度为300mg/L。与传统化学表面活性剂相比，该菌株产生的脂肪醇类生物表面活性剂具有更好的表面/界面性能。

Description

一株伯克霍尔德氏菌QZ7及其产生生物表面活性剂的应用

技术领域

本发明涉及一株伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)QZ7及其产生生物表面活性剂的应用 

背景技术

表面活性剂，具有典型的两亲结构，并能显著改变溶液表面张力，或具有乳化性能的物质。它的一端为极性的亲水基团，另一端为非极性的疏水基团。由于表面活性剂的结构特性，它具有助悬、乳化、去垢、分散、增溶、发泡、洗涤、抗硬水性等作用，并在工业、农业、医药、日用化工等众多领域得到广泛应用。 

表面活性剂属于生物难降解物质，在我国环境标准中将其归属为第二类污染物质。表面活性剂废弃物来源广泛，成分复杂。它的广泛使用，对地表水、地下水、土壤造成了污染，也对农业生产、水生生物，甚至人类健康产生不良影响。据统计2009年我国表面活性剂的表观消费量已达到145.45万吨，表面活性剂带来的环境问题已不容忽视。人们希望能够得到活性高、性能优良、环境友好型的表面活性剂。而微生物产生的生物表面活性剂正具备上述优点，符合人们需求。 

生物表面活性剂是微生物的次级代谢产物，是微生物在特殊条件下产生的。生物表面活性剂同化学表面活性剂相比，同样具有典型的两亲结构，但表面/界面性能更优秀，并且具有独特的性能。例如：无毒或低毒性，高生物降解性、极端温度、pH和盐度条件下仍然保有界面活性、在自然环境中易被生物降解、环境兼容性强等优点。近年来由于生物表面活性剂在工农业、医药卫生、环境保护等多个领域取得的重要进展，成为国内外研究的热点。 

能够产生表面活性剂的微生物有细菌、真菌、酵母菌，其中细菌占绝大多数，且大多数为假单胞菌、杆菌，其它菌属较为少见。大多数已知的生物表面活性剂属于糖脂、脂肽类，其它种类如磷脂类、脂肪酸、中性脂类、聚合表面活性剂类等较为少见。微生物产表面活性剂产量普遍较低，且微生物的种类和培养条件对表面活性剂的产量有很大影响。因此筛选表面活性剂高产菌株，优化培养条件有重要意义。 

申请人从中国矿业大学(北京)中心餐厅周边长期被植物油污染的环境中筛选得到了一株表面活性剂的高产菌株，经16S rRNA鉴定为Burkholderia sp.。该菌株产生的表面活性剂类型为脂肪醇类。该菌属及其产生的脂肪醇类表面活性剂较为少见，且表面性能优秀，具有很好的潜力。 

发明内容

本发明涉及一株用于生产生物表面活性剂的革兰氏阴性伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)，命名为QZ7，该菌株可产生脂肪醇类生物表面活性剂。该菌株于2012年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：6269。 

经优化培养条件，菌株QZ7产生表面活性剂的最佳碳源为大豆油，最佳氮源为NaNO₃与(NH₄)₂SO₄结合使用。QZ7最佳发酵条件为：大豆油10g/L，NaNO₃ 1.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，温度为35℃，pH为7.0，接种量为10％。 

QZ7所产的表面活性剂为阴离子型，脂肪醇类物质。纯化之后的表面活性剂可在室温下将纯水的表面张力由71.19mN/m降至30.74mN/m，临界胶束浓度为0.3g/L，其表面性能远远超过普通化学表面活性剂。发酵优化后的最大产量为1.67g/L，培养24h便可达到最大值。 

附图说明

图1为菌株QZ7培养液表面活性与OD₆₀₀变化图 

图2为菌株QZ7离子型鉴定图 

图3为菌株QZ7表面活性剂红外光谱图 

图4为菌株QZ7产生物表面活性剂最佳碳源筛选结果 

图5为菌株QZ7产生物表面活性剂最佳氮源筛选结果 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

实施例1菌株筛选 

1、菌株的采样与富集 

从中国矿业大学(北京)中心餐厅下水道污水(命名为XZ)、井盖周边长期被油污染的土壤(命名为XZ)、后厨墙壁上的油垢(命名为QZ)3个地点采样。将样品经预处理后得到的上清液按5％的接种量接种到富集培养基中，150r/min、30℃振荡培养5天。同样条件下连续传代3次。 

富集培养基成分(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 10，KCl 1.1，KH₂PO₄ 3.4，K₂HPO₄ 5.0，MgSO₄ 0.5，酵母浸膏0.5，花生油4，加蒸馏水定容至1L，自然pH，121℃灭菌20min。 

2、菌株的初筛 

3次传代培养后，得到的土样、油样和水样的混合菌液，按10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的稀释倍数，分别将菌液稀释涂布于蓝凝胶平板和血平板中。置于30℃恒温箱中培养3～5d后， 用接种环挑选涂布平板上有蓝色晕圈或溶血圈的单个菌落，划线牛肉膏蛋白胨平板培养基上，于温度30℃下培养2d，之后再进行平板划线分离，重复2次之后，得到单一菌株。 

蓝色凝胶平板成分(g/L)：牛肉膏1，葡萄糖20，蛋白胨5，酵母膏0.2，琼脂18～20，CTAB0.2，亚甲基蓝0.005，加蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min，自然pH。 

哥伦比亚血平板购自友康基业生物科技有限公司，成分如下(g/L)：酪蛋白胰酶消化物10，心胰酶消化物3，肉胃酶消化物5，酵母浸出粉5.0，玉米淀粉1.0，NaCl 5，琼脂12，无菌脱纤维血70mL，pH7.3±0.2。 

菌株母液的制备：将纯化好的菌株接于发酵培养基中，于温度30℃，150r/min的振荡培养箱中培养。以蒸馏水为空白测定吸光度，待其OD₆₀₀值为0.6～0.8时，保存备用。 

发酵培养基成分(g/L)：NaNO₃ 1.0，NaCl 0.5，K₂HPO₄ 0.5，KH₂PO₄ 0.5，(NH₄)₂SO₄ 0.5，MgSO₄ 0.5，花生油6.4，加蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min，自然pH。 

3、菌株的复筛 

采用排油圈法进一步筛选表面活性剂高产菌株。将初筛得到的菌株按3％接种量接于发酵培养基中，每隔24h测其排油活性，保留排油圈大于4cm的菌株。 

排油圈法： 

①橄榄油的预处理：在橄榄油中加入一定量的亚甲基红，待其染色完毕后，离心，过滤掉沉淀备用。 

②在洁净干燥的培养皿中倒人一定量的蒸馏水，然后在培养皿中心滴加5～7滴预热至45℃的橄榄油，待其均匀分散于水表面形成稳定油膜后备用。 

③将菌株发酵液于8000r/min离心20min得到菌株上清液，取上清液1滴加在油膜中心，可看到油膜中心形成空洞，并逐渐向四周扩大(即排油圈)，待排油圈稳定后测其最大直径，重复3次，取平均值。 

经过复筛，得到若干株排油活性大于4cm的菌株，其中菌株QZ7排油活性大于7cm，将其作为下一步研究对象。 

实施例2菌株的鉴定 

菌株基因组的鉴定采用16SrDNA序列分析的方法。使用Solarbio细菌基因组DNA提取试剂盒，提取菌株的基因组DNA，以此为模板，利用16SrDNA基因通用引物，进行PCR扩增。扩增16SrDNA的引物设计： 

F-primerF27：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’ 

R-primerR1492：5’-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’ 

PCR反应体系及条件： 

PCR反应条件具体设置为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸90s，40个循环，72℃最终延伸5min，4℃保存。取2μL的PCR反应产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳实验。 

得到的16S rDNA序列产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，共测得1412个碱基，如SEQ NO：1所示。测得的序列登陆NCBI网站，通过Blast程序与Genbank中核酸数据进行比对分析。使用Clustalx、MEGA3软件绘制菌株进化发育树。经鉴定该菌株为Burkholderia sp.。 

实施例3QZ7培养液中表面张力变化 

将QZ7按3％的接种量，转接于细菌发酵培养基，于温度30℃，150r/min的条件下培养。分别在6h、12h、24h、36h、48h、3d、4d检测上清液的排油活性和OD₆₀₀，并观察发酵液的变化。试验结果参见图1。 

在初始培养条件下，OD₆₀₀值较低，此时菌株为适应生长环境，虽然代谢活跃，但繁殖缓慢。观察发酵液：可见大片厚重的油膜漂浮在液体表面，发酵液未见浑浊，比较透明，排油活性较差，可知表面活性剂的产量非常低。 

12h左右，细菌进入对数期，呈几何级数快速增长繁殖，发酵液明显浑浊，测其OD₆₀₀值明显增大。观察发酵液：可见原先的大片油膜分散成非常细小且均匀整齐的小油滴飘浮在液体表面，颜色略有浑浊，比较透明，排油活性比稳定期略好，可知细菌开始产生表面活性剂，利用植物油进行生长代谢。推断这一时期细菌为了自身的快速繁殖，必须产生表面活性剂来加快对植物油的分解利用。 

在24h时，细菌对数期将要结束，将要进入稳定期，此时排油活性达到最大。由此可知，此时表面活性剂的产量积累到了顶峰，对表面活性剂分离提纯应该在这一时期。 

36h左右，细菌进入稳定期，OD₆₀₀明显增大。由于培养基中植物油的消耗，毒性代谢产物积聚，生长环境pH值的变化，细菌的繁殖速度渐趋减慢，死亡数逐步上升。此时，细菌 繁殖数与死亡数大致相等，细菌数量保持稳定，达到最大。在此期细菌细菌产生并积累代谢产物。观察发酵液：看不到油滴存在，发酵液表面有非常明显的白色的乳化层，颜色非常浑浊。排油活性基本保持在最大值，说明表面活性剂在发酵液中仍大量存在。 

48h之后，细菌进入衰亡期，OD₆₀₀值开始逐渐下降，细菌繁殖速度减慢或停止，死菌数迅速超过活菌数，细菌生理代谢活动趋于停滞。观察发酵液：看不到油滴存在，发酵液表面有仍然有乳化层，颜色非常浑浊。但排油活性明显下降，由生物表面活性剂的可降解性推测：后期由于营养物质的缺乏，细菌通过分解利用稳定期产生的表面活性剂来维持自身的新陈代谢，导致排油活性的降低。 

因此在培养24h后，即可到达生产表面活性剂的顶峰。 

实施例4QZ7表面活性剂的纯化与鉴定 

1、QZ7生物表面活性剂带电性质检测 

测定方法： 

①阴离子表面活性剂测定方法：亚甲基蓝-氯仿测定方法 

在试管中加入5mL上清液，再加入10mL亚甲基蓝溶液(浓度为0.03g/L的亚甲基蓝水溶液)和5mL氯仿，用力振荡后静置。如果表面活性剂为阴离子型，则氯仿层由无色变为蓝色。 

②阳离子表面活性剂测定方法：溴酚蓝测定方法 

在试管中加入5mL上清液，并将其pH值调节至7.0，，接着加2滴溴酚蓝溶液(浓度为0.04％，溶剂为含有20％乙醇的水溶液)。如果表面活性剂为阳离子型，溶液变成深蓝色。 

对照组：CTAB(阴离子型表面活性剂)和SDS(阳离子型表面活性剂)溶液。 

检测时，分别将QZ7上清液、CTAB和SDS溶液分别加入亚甲基蓝-氯仿的混合液、溴酚蓝溶液中，震荡摇匀后观察颜色变化。发现在阴离子检测中发现QZ7和SDS的氯仿层均变成蓝色，而CTAB氯仿层为无色。在阳离子检测中，透光可见：CTAB溶液为深蓝色，而QZ7和SDS溶液为暗红色。结果参见图2，因此QZ7所产表面活性剂为阴离子型。 

2、QZ7表面活性剂的纯化 

取发酵液的上清液1L，连续两次用等体积的乙酸乙酯萃取，合并有机相，将萃取液经旋转蒸发去除有机溶剂后，得到表面活性剂的浓缩液，在40℃烘箱中烘干后得到黄色粉末，即为表面活性剂产品。 

3、QZ7表面活性剂的结构分析 

红外光谱鉴定：将旋转蒸发后得到的表面活性剂浓缩液涂于BaF₂晶片，进行红外光谱扫描，通过官能团的分析来判断表面活性剂的类型。 

如图3所示，观察QZ7红外光谱扫描结果，查阅有机化合物基团振动频率表，结合官能团分析，可得QZ7所产的生物表面活性剂为脂肪醇类化合物。 

红外光谱打描条件：红外透射光谱，BaF₂晶片法，测试范围：4500～800cm^-1；扫描次数：32次；分辨率：4；数据间隔：1.929cm^-1；最终格式：吸光度、透过率；大气背景自动扣除。实施例5QZ7表面活性剂的发酵条件优化 

1、最佳C源筛选 

以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、石蜡、橄榄油、花生油6.4g/L分别作为唯一碳源，加入菌株发酵培养基中，30℃，150r/min的条件下培养24h后，测其排油活性和OD₆₀₀值。结果如图4所示，在其它培养条件一样时，不同的碳源对菌株QZ7的生长及产表面活性剂的能力有很大影响。葡萄糖为唯一碳源，有利于QZ7生长繁殖，但却不利于表面活性剂的产生；QZ7对可溶性淀粉、蔗糖的生物可利用性较低，对应的产表面活性剂能力也较低；虽然QZ7对石蜡的生物可利用性较低，但是产表面活性能力略有提高；橄榄油和植物油作为唯一碳源，不仅有利于菌株生长繁殖，而且有利于菌株产生表面活性剂。橄榄油价格昂贵，考虑经济因素，选择植物油为QZ7最佳碳源。 

2、最佳N源筛选 

在发酵培养基中，以花生油(6.4g/L)为唯一碳源，分别以尿素、蛋白胨、NaNO₃、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl 3g/L，NaNO₃与(NH₄)₂SO₄结合使用(NaNO₃ 1.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L)为氮源，30℃，150r/min的条件下培养24h后，测其排油活性和OD₆₀₀。结果如图5所示，在其它培养条件一样时，不同的氮源对菌株QZ7的生长及产表面活性剂的能力有很大影响。尿素、蛋白胨为唯一氮源，QZ7生长繁殖较差，且表面活性剂的产量较低；NaNO₃、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl为唯一氮源，与NaNO₃+(NH₄)₂SO₄作为唯一氮源相比，虽然对菌株生长繁殖的影响相差不大，但是NaNO₃+(NH₄)₂SO₄结合使用，作为为唯一氮源时，QZ7产生表面活性剂的能力更强。因为QZ7最佳氮源为NaNO₃ 1.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L。 

3、多因素正交实验分析 

将C源、N源、P源、可溶性C源的添加、温度、pH值、接种量作为优化因素。采用4因素、3水平正交实验L₉(3⁴)，分2次对上述因素进行优化，测每组实验排油活性，重复3次。并对结果进行方差分析。 

表1 第一次正交实验因素表 

表2 第二次正交实验因素表 

通过正交实验得出QZ7最佳发酵条件为：花生油10g/L，NaNO₃ 1.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，温度为35℃，pH为7.0，接种量为10％。C源、N源、p源、温度、pH值、溶液中是否添加可溶性C源、接种量都是影响菌株产表面活性剂的显著因素。 

实施例6QZ7表面活性剂的性能研究 

根据正交实验得出来QZ7生物表面活性剂的最佳发酵条件进行培养，在最大值时将发酵液经离心去菌体，用乙酸乙酯萃取，旋转蒸发去除有机溶剂后，在40℃烘箱干燥后称重。得出表面活性剂产出量为0.85g/L。 

将干燥的表面活性剂纯品溶于水，配制浓度为1.0g/L的溶液，测其表面张力及临界胶束浓度值(CMC)大小。测得表面张力为30.74mN/m，临界胶束浓度为300mg/L。对比化学表面活性剂，显示出更优秀的表面/界面性能。 

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 

Claims (4)

1.一株用于生产生物表面活性剂的革兰氏阴性菌，命名为QZ7，经鉴定为伯克氏菌属Burkholderia sp.，已于2012年06月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC NO.6269。

2.权利要求1所述菌株用于生产生物表面活性剂的应用，其特征在于用于该菌株生产产表面活性剂的最佳发酵条件：大豆油10g／L，NaNO₃1.0g／L，(NH₄)₂SO₄0.5g／L，K₂HPO₄1.5g／L，KH₂PO₄1.5g／L，温度为35℃，pH为7.0，接种量为10％。

3.如权利要求2所述生产生物表面活性剂的应用，其特征在于生产的表面活性剂为阴离子型、脂肪醇类化合物。

4.如权利要求2所述生产生物表面活性剂的应用，其特征在于纯化之后QZ7生产的表面活性剂，室温下表面张力最小值为30.74mN／m，临界胶束浓度为0.3g／L；发酵优化后的最大产量为1.67g／L，培养24h便可达到最大值。

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