CN105039171A - 栓菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及栓菌及其应用，该菌种生长快速，营养基质利用范围广，培养基成分廉价、易得，易于培养。利用该菌种所生产的漆酶可以被应用与生物质能源、纺织、食品、生物修复、造纸等方面。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及栓菌及其应用。
背景技术
栓菌属微生物，属于担子菌门的白腐真菌(white-rotfungi)。白腐真菌靠降解木质素—纤维素材料的能力穿入木质，侵入木质细胞腔内，释放降解性酶，导致木质腐烂并呈白色，是降解芳香化合物能力最强的微生物。白腐真菌主要利用分泌出的过氧化物酶(LiPs、MnPs和漆酶)对木质素进行催化氧化反应，从而降解木质素分子。与其它两种木质素降解酶LiPs和MnPs相比，漆酶是目前唯一一个实现工业化生产和应用的木质素降解酶。
漆酶广泛存在于木腐真菌中，并在植物、真菌、细菌和昆虫等物种中也有发现。研究指出高等真菌，尤其是担子菌门的白腐真菌，是目前最主要的漆酶生产菌种。漆酶(EC1.10.3.2)，属于蓝多铜氧化酶(bluemulticopperoxidases,MCOs)家族的一种，能够在氧气作为电子受体的条件下氧化芳香族化合物，且底物作用特异性低。漆酶不仅可以氧化多酚类芳香族化合物，还可以利用在小分子介体的介导下形成的漆酶/介体体系(LMS)氧化非酚类物质或其它更为复杂的大分子。漆酶可选择性的去除木质纤维素中的木质素，有效地对偶氮染料进行脱色，还可以去除环境中酚类药物或其它类似毒性物质。因此，漆酶在生物质能源、纺织、造纸、废报纸脱墨、食品、生物修复和生物传感器等领域具有重要的研究和应用价值。
虽然漆酶已实现工业化生产和应用，但是目前研究或生产使用的漆酶产生菌株仍具有发酵产酶时间长和发酵活力较低等缺点，致使发酵成本过高，制约着漆酶的广泛应用。因此，为了更好地满足生产需求，获取具有发酵时间短、发酵活力高的漆酶产生菌株及其产酶培养基依然是漆酶生产和研究领域需要解决的难题。
发明内容
本发明的目的是提供栓菌及其应用，利用本发明栓菌生产的漆酶产量高，所生产的漆酶可以被应用与生物质能源、纺织、食品、生物修复、造纸等方面。
栓菌，保藏编号为：CCTCCNO：M2015191，拉丁文名称为Trametessp.LS-10C，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年04月03日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
所述栓菌是从安徽省芜湖市神山公园、赭山公园和清水苗圃园中收集的富含腐烂植物茎叶组织的土壤中经过筛选获得；
该菌株在PDA平板上生长速度快，其菌落呈白色，局部菌丝细密，但总体菌落较蓬松，气生菌丝发达，基内菌丝不明显，菌丝纤细，无明显孢子生成。
该菌种筛选方法为：
1平板初筛
使用无菌水对采集的27个自然样各取0.1g用无菌水稀释至1mL，打碎混匀，于室温放置2d后使用无菌水进行梯度稀释至10-1、10-2和10-3，分别取浓度为10-1、10-2和10-3的样本稀释液各0.4mL涂布于无菌的固体筛选培养基平板(每L培养基含有：土豆浸出汁20mL(取200g土豆去皮加入800mL水，煮沸0.5h，冷却后定容到1000mL)，葡萄糖20g，愈创木酚0.4mL，卡那霉素100mg，琼脂粉20g，pH6.0)。将涂布后的平板放置于30℃恒温培养箱中培养5d，挑取周围能够形成红褐色氧化圈的菌落进行划线分离，同时记录并比对各筛选菌株的菌落直径与氧化圈大小。使用超低温(-80℃)甘油冻结管保藏法分别保藏所得菌株。
2摇瓶复筛
将筛选获得的菌株分别划线接种PDA(每L培养基含有：土豆浸出汁20g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，pH6.0)平板并于30℃恒温培养箱中培养5d后，每个平板使用5mL无菌水进行洗涤，吸取2mL洗涤后获得的菌丝悬液接入48mL无菌种子培养基(每L培养基含有：酵母浸出物5g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，pH5.5)中，接种后种子培养基装液量为250mL三角瓶装50mL培养基。接种后置于恒温震荡培养摇床中培养，培养温度为30℃，摇床转速为220rpm，培养2d后，吸取5mL种子培养液接种于45mL液态发酵培养基(每L培养基含有：酵母浸出物5g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，pH5.5)，接种后发酵培养基装液量为250mL三角瓶装50mL培养基。接种后置于恒温震荡培养摇床中培养，培养温度为30℃，摇床转速为220rpm，培养12d，期间每24h从发酵液中吸取1mL液体并对其漆酶活力进行测定。
3菌种鉴定
经上述方法对自然样本进行反复筛选和比较，最终获得一株发酵周期较短、产漆酶活力较高菌株，经菌落形态学观察、显微形态观察(图1)和分子生物鉴定(图2)将该菌株鉴定为毛栓菌。
栓菌菌株分子生物学鉴定：
(1)栓菌染色体提取
使用CTAB抽提法，具体步骤如下：
①把分离到的菌种接种到PDA斜面培养基培养3-4d至长出孢子，转接到液体PDA种子液(每L培养基含有：土豆浸出汁20g，葡萄糖20g，pH6.0)中培养36h，离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体至洗液澄清，真空冷冻干燥；②取冷冻干燥的菌体，放于预冷的研钵中，快速充分研磨；③加入1mL65℃预热的CTAB和100μLSDS，充分混匀后在65℃水浴中保温40min，每8min轻柔混匀一次；④10000rpm，4℃，离心10min，收集上清液；⑤加入等体积的酚：氯仿，轻柔混匀1min，10000rpm，4℃离心5min，收集上清液；⑥往上清液中加入等体积的氯仿抽提，轻柔混匀，10000rpm，4℃离心5min，收集上清液；⑦往上清液中加入2.5倍体积的无水乙醇，室温沉淀20min后，10000rpm，4℃离心10min，收集核酸沉淀；⑧加入1mL75％乙醇洗涤沉淀，10000rpm，4℃离心5min；⑨吸去上清，将Ep管倒扣于干净的纸巾上，室温干燥DNA沉淀15min。加入20μL双蒸水，-20℃备用。
(2)栓菌5.8SrDNA-ITS基因PCR扩增和序列测定
以CTAB抽提法获得的染色体DNA为模板，以5.8SrDNA-ITS区域通用引物(ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')为扩增引物，使用PCR方法获得菌株5.8SrDNA-ITS基因片段。
PCR扩增体系(50μl)如下
将PCR产物连接载体pUCm-T，并转化EscherichiacoliDH5α感受态细胞，抽提重组质粒并委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成目的基因的序列测定，测定的5.8SrDNA-ITS基因序列为SEQUENCELISTING。
(3)系统进化树构建
将菌株的5.8SrDNA-ITS基因片段测序结果通过在线数据库Blast/blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)对测定序列进行比对，选取相近序列并使用BioEdit软件进行多重比对，比对结果通过软件MEGA5.1利用Neighbor-Joining(NJ)法构建系统发育树(图3)，结合形态学观察结果将该分离菌株鉴定为栓菌。
栓菌作为生产漆酶的应用；
一种漆酶的生产方法，步骤包括：
A、制备种子培养液，将栓菌在种子培养基中培养后进行接种；
具体为：将栓菌菌种在PDA培养基中培养3d后用无菌水洗下孢子，使用血球计数板计算孢子数并稀释至1×107个/mL，按1％接种量接入种子培养基中，于30℃、200rpm条件下培养24h后作为种子液备用，使用超低温(-80℃)甘油冻结管保藏法保藏所得菌株；
取保藏毛栓菌菌株的超低温(-80℃)甘油冻结管置室温溶解并吸取0.1mL液体涂布PDA平板，于30℃培养5d后用无菌水洗下菌丝，每个平板使用5mL无菌水进行洗涤，吸取2mL洗涤后获得的菌丝悬液接入48mL无菌种子培养基中进行接种培养，接种后种子培养基装液量为250mL三角瓶装50mL培养基，培养温度为30℃，摇床转速为220rpm，恒温培养48h后即为摇瓶发酵产酶的种子培养液；
所述PDA培养基配方为：每L培养基含有：土豆浸出汁20g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，pH6.0；
所述种子培养基配方为：每L种子培养基含有：酵母浸出物5g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，pH5.5；
B、使用产漆酶培养基液态发酵产漆酶；
具体为：吸取5mL种子培养液接入45mL产漆酶培养基，接种后置于震荡恒温培养摇床中培养，培养温度为30℃，摇床转速为220rpm，总培养时间12d；接种后发酵培养基装液量为250mL三角瓶装50mL培养基；
所述产漆酶培养基配方为：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉糊精之一或其混合物10～30g，10％麸皮浸出汁80～120g，氯化铵、酒石酸铵、硝酸铵、硝酸钾、豆粕、豆渣之一或其混合物5～10g，酵母粉、蛋白胨之一或其混合物2.5g，五水硫酸铜0.1～0.3g，氯化钠1g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.3g，pH5.5。
所述产漆酶培养基配方中10％麸皮浸出汁按如下方法配置：准确称取100g麸皮，加入1000mL蒸馏水并煮沸30分钟后使用4层纱布过滤，过滤液使用蒸馏水定容至1000mL，即得所述10％麸皮浸出汁。
从所述步骤B中漆酶培养过程中每24h从发酵液中吸取0.5mL液体并对其漆酶活力进行测定，发酵10d后发酵液中的漆酶活力达到320U/mL以上；
漆酶活力的检测方法为：
底物溶液：使用0.1M，pH4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液配置0.5mMABTS(2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))溶液，即为漆酶活力测定底物溶液；
粗酶液处理：吸取0.5mL发酵液于1.5mL离心管中，在室温条件下使用高速离心机(12000r/min)离心10min，吸取上清0.5mL并使用0.1M，pH4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液稀释至1000～5000mL，即得到粗酶液；
酶促反应体系：分别将底物溶液和反应粗酶液置于40℃恒温水浴锅中预热5min后，吸取1.5mL反应粗酶液加入1.5mL底物溶液中，立即充分混匀并分别记录在0至60秒、61至120秒、121秒至180秒内反应液在420nm处吸光值的变化，以上述3次测定的吸光值变化值的平均值记为反应体系平均每min吸光值的变化值；
漆酶活力定义：在上述酶促反应条件下，定义1min内氧化1μmolABTS所需要的酶量为一个漆酶活力单位(U)，并将漆酶发酵活力表示为U/mL。
漆酶作为对偶氮染料脱色的应用；所述偶氮染料为酸性大红GR、酸性铬蓝K、依来铬黑T、直接橙S、酸性红73、直接耐晒蓝B2R。
漆酶作为以ABTS为介体快速脱去含木质素植物中木质素的应用，在木质纤维素生物质能源生产领域具有良好的应用前景。
本发明采用愈创木酚显色法对的多个自然样本进行筛选并获得一株漆酶高效产生菌株，利用筛选的漆酶高产菌株毛栓菌，以酒石酸氨、豆粕、豆渣、硝酸钾、氯化铵为氮源，以麦芽糖、葡萄糖、蔗糖辅以麸皮汁等为碳源经种子培养和液体发酵培养生产漆酶的方法，较未加麸皮汁的培养液比，加入麸皮汁的培养液培养出的漆酶活力显著提高，所生产的漆酶可以被应用与生物质能源、纺织、食品、生物修复、造纸等方面。
本发明的有益效果：
1.菌种生长快速，营养基质利用范围广，培养基成分廉价、易得，易于培养；
2.重复发酵性能稳定，发酵活力高达320U/mL以上；
3.发酵pH适应范围广，工艺控制简单。
4.粗酶液在60℃以下具有良好的热稳定性，以ABTS为底物时，在50℃和pH4.0条件下表现的催化活力最高。
附图说明
图1为栓菌菌落照片和显微照片，图中：A、巨大菌落；B、愈创木酚平板氧化圈；C、400倍普通显微照片；D、600倍电镜照片；
图2为实施例3栓菌发酵产酶时间曲线；
图3为依据栓菌的5.8rDNA-ITS序列构建的系统进化树。
具体实施方式
实施例1
取保藏毛栓菌菌株的超低温(-80℃)甘油冻结管置室温溶解并吸取0.1mL液体涂布PDA平板，于30℃培养5d后用无菌水洗下菌丝，每个平板使用5mL无菌水进行洗涤，吸取2mL洗涤后获得的菌丝悬液接入48mL无菌种子培养基中，接种后种子培养基装液量为250mL三角瓶装50mL培养基。培养条件：培养温度为30℃，摇床转速为220rpm，恒温培养48h后即为摇瓶发酵产酶的种子培养液。
在250mL三角瓶装45mL产酶培养基，接入5mL种子培养液并置于震荡恒温培养中培养。培养条件：培养温度为30℃，摇床转速为220rpm。在上述培养条件下，培养8d后，发酵液中的漆酶活力为262U/mL。
每L产酶培养基含有：麦芽糖30g，10％麸皮浸出汁80g，酒石酸铵7g，酵母粉2.5g，五水硫酸铜0.15g，氯化钠1g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.3g，pH5.5。
实施例2
摇瓶发酵产酶的种子培养液同实施例1
在250mL三角瓶装45mL产酶培养基，接入5mL种子培养液并置于震荡恒温培养中培养。培养条件：培养温度为30℃，摇床转速为220rpm。在上述培养条件下，培养8d后，发酵液中的漆酶活力为304U/mL。
每L产酶培养基含有：葡萄糖10g，10％麸皮浸出汁100g，豆粕7g，酵母粉2.5g，五水硫酸铜0.25g，氯化钠1g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.3g，pH5.5。
实施例3
摇瓶发酵产酶的种子培养液同实施例1
在250mL三角瓶装45mL产酶培养基，接入5mL种子培养液并置于震荡恒温培养中培养。培养条件：培养温度为30℃，摇床转速为220rpm。在上述培养条件下，培养8d后，发酵液中的漆酶活力为326U/mL。
每L产酶培养基含有：葡萄糖20g，10％麸皮浸出汁120g，氯化铵10g，酵母粉3g，五水硫酸铜0.25g，氯化钠1g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.3g，pH5.5。
实施例4
摇瓶发酵产酶的种子培养液同实施例1
在250mL三角瓶装45mL产酶培养基，接入5mL种子培养液并置于震荡恒温培养中培养。培养条件：培养温度为30℃，摇床转速为220rpm。在上述培养条件下，培养8d后，发酵液中的漆酶活力为221U/mL。
每L产酶培养基含有：麦芽糖20g，10％麸皮浸出汁100g，豆粕7g，酵母粉2.5g，五水硫酸铜0.1g，氯化钠1g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.3g，pH5.5。
实施例5
摇瓶发酵产酶的种子培养液同实施例1
在250mL三角瓶装45mL产酶培养基，接入5mL种子培养液并置于震荡恒温培养中培养。培养条件：培养温度为30℃，摇床转速为220rpm。在上述培养条件下，培养8d后，发酵液中的漆酶活力为233U/mL。
每L产酶培养基含有：麦芽糖20g，10％麸皮浸出汁80g，硝酸钾5g，酵母粉2.5g，五水硫酸铜0.1g，氯化钠1g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.3g，pH5.5。
对比例
摇瓶发酵产酶的种子培养液同实施例1
在250mL三角瓶装45mL产酶培养基，接入5mL种子培养液并置于震荡恒温培养中培养。培养条件：培养温度为30℃，摇床转速为220rpm。在上述培养条件下，培养8d后，发酵液中的漆酶活力为169U/mL。
每L产酶培养基含有：葡萄糖20g，豆粕5g，酵母粉2.5g，五水硫酸铜0.25g，氯化钠1g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.3g，pH5.5。
由对比例可以看出，在不加10％麸皮浸出汁的产酶培养基中培养的漆酶活力明显弱于添加了10％麸皮浸出汁的产酶培养基中培养的漆酶活力。
将实施例1得到的漆酶对偶氮染料脱色：
(1)偶氮染料脱色率
使用上海精科仪器有限公司的722n分光光度计在偶氮染料的最大吸收波长下测定漆酶对偶氮染料脱色前后的吸光值变化。脱色率计算公式：脱色率＝(A0-A)/A0*100％，其中A0表示脱色前反应体系中染料的吸光值，A表示脱色后反应体系中染料的吸光值。
(2)漆酶对偶氮染料的脱色作用
分别添加2mL漆酶溶液(浓度为200U/mL)、1mL偶氮染料溶液(浓度为1g/L)和7mL醋酸/醋酸钠缓冲液(浓度为0.1M，pH值为4.0)于试管中，使总反应体系为10mL。将试管在30℃水浴锅中静置反应2h后根据公式计算脱色率。
表1本发明漆酶对偶氮染料的脱色脱色率
SEQUENCELISTING
<110>安徽工程大学
<120>栓菌及其应用
<130>1
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>570
<212>DNA
<213>栓菌5.8SrDNA-ITS
<400>1
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Claims (6)
1.栓菌，保藏编号为：CCTCCNO：M2015191。
2.栓菌作为生产漆酶的应用。
3.一种漆酶的生产方法，步骤包括：
A、制备种子培养液，将栓菌在种子培养基中培养后进行接种；
B、使用产漆酶培养基液态发酵产漆酶。
4.如权利要求3所述的生产方法，其特征在于：
所述产漆酶培养基配方为：每L培养基含有葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉糊精之一或其混合物10～30g，10％麸皮浸出汁80～120g，氯化铵、酒石酸铵、硝酸铵、硝酸钾、豆粕、豆渣之一或其混合物5～10g，酵母粉、蛋白胨之一或其混合物2.5g，五水硫酸铜0.1～0.3g，氯化钠1g，磷酸二氢钾1g，氯化钙0.3g，pH5.5。
5.漆酶作为对偶氮染料脱色的应用。
6.漆酶作为以ABTS为介体快速脱去含木质素植物中木质素的应用。
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