CN105543110A - 一种高产漆酶的粗毛栓菌及其应用 - Google Patents

一种高产漆酶的粗毛栓菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高产漆酶的粗毛栓菌及其应用，可有效解决高产漆酶，满足工业生产中对漆酶的需要问题，方法是，一种高产漆酶的粗毛栓菌，分类命名为粗毛栓菌（<i>Trametes？hirsuta</i>）ZLH237，2015年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC？No.11811，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该粗毛栓菌可有效用于制备并高产漆酶，实现粗毛栓菌在高产漆酶中的应用，本发明粗毛栓菌培养基制备简便，原材料来源广泛，价格低廉，并且该菌株在这种培养基培养条件下可产生高活性的漆酶，与现有资料相比该菌株酶活是现有报道的其它粗毛栓菌最高酶活的10倍左右，同时也明显高于同类其它白腐真菌的漆酶酶活。

Description

一种高产漆酶的粗毛栓菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物，特别是一种高产漆酶的粗毛栓菌及其应用。
背景技术
漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一类含铜离子的多酚氧化酶，能催化一大类酚类及非酚类化合物的聚合、分解及转化，期间伴随单电子的转移将分子氧还原成水。其首次报道是日本学者Yoshida在1883年从日本漆树的流出液中分离得到故得名，之后的研究发现，漆酶广泛存在于自然界中，尤其是植物、真菌中，此外在细菌、动物、昆虫中也发现漆酶的存在。漆酶作用底物非常广泛，它能降解木质素，可与有毒的酚类物质作用，使苯氧基类除草剂、石油工业废水去除毒性，还可以氧化降解一些有机磷毒物，以及在微生物菌体形态形成和植物病原等方面的功能，由于其催化生成的产物不污染环境，因此在食品工业、环境保护、造纸工业及其它领域具有很大的研究价值和应用潜力。在近130年的时间里，漆酶作为一种环境友好型的生物催化剂(利用氧的参与，副产品是水)逐渐成为生物、化学、环境、食品等领域的研究热点。
在真菌中，担子菌门的白腐真菌是自然界中漆酶的主要生产者，大部分的白腐真菌分泌的漆酶为胞外漆酶。白腐真菌在真菌中占有重要的地位，它们不像高等植物那样靠光合作用来获得营养，也不像动物那样靠进食、消化获得营养，它们主要是通过吸收腐生物中的营养物质来供其生长、代谢。常见的白腐真菌有栓菌属(Trametes)、侧耳属(Pleurotus)、木耳属(Auricularia)、密孔菌属(Picnoporus)、伞菌属(Agaricus)等。栓菌(Trametes)是一类能有效地降解木质纤维素及多种难降解的苯酚类有机物的丝状真菌，它能用于研究植物生物质利用和自然界有机污染物的生物治理。粗毛栓菌HTC(T.gallicaHTC)是一株可分泌漆酶的白腐丝状真菌，比其它许多真菌，如香菇(Lentinula)、平革菌(Phanerochaete)、侧耳菌(Pleurotus)等能更有效地降解木质素，并具有很高的木质纤维素降解酶活性，可作为生物制浆、纸浆漂白、环境保护等方面的工业生产理想候选菌。因此，筛选得到天然的漆酶高表达菌株，探索漆酶新的应用领域和应用途径，必将具有实际意义和巨大的经济效益。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种高产漆酶的粗毛栓菌及其应用，可有效解决高产漆酶，满足工业生产中对漆酶的需要问题。
本发明解决的技术方案是，一种高产漆酶的粗毛栓菌，分类命名为粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237，2015年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.11811，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该粗毛栓菌可有效用于制备并高产漆酶，实现粗毛栓菌在高产漆酶中的应用。
本发明粗毛栓菌培养基制备简便，原材料来源广泛，价格低廉，并且该菌株在这种培养基培养条件下可产生高活性的漆酶，与现有资料相比该菌株酶活是现有报道的其它粗毛栓菌最高酶活的10倍左右，同时也明显高于同类其它白腐真菌的漆酶酶活，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明是提供一种高产漆酶的粗毛栓菌，分类命名为粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237，2015年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.11811，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该粗毛栓菌可有效用于制备并高产漆酶，实现粗毛栓菌在高产漆酶中的应用。
本发明在具体实施中：
菌种的生产：本发明所提供生产粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237菌种的方法，将粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237接种于PDA（去皮马铃薯200g,蔗糖(或葡萄糖)20g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O1g，VB10.02g,琼脂15~20g）平板上，放置30℃培养箱中培养3-4天备用；
液体发酵和漆酶粗酶液制备：本发明的粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237用于发酵生产漆酶。本发明提供了一种利用粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237发酵生产漆酶的方法。本发明所提供的发酵生产漆酶的方法，包括在液体基础产酶培养基中培养粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237，收集漆酶发酵液的步骤；
上述生产方法中，每升所述液体基础产酶培养基可按照如下方法配制：NaH2PO4·12H2O0.039%，MgSO4·7H2O0.05%，琥珀酸钠0.118%，FeSO4·7H2O0.00315%，CaCl2·2H2O0.01%，MnSO4·H2O0.0035%，CH3COONa·3H2O0.0408%，CoCl2·6H2O0.006%，ZnSO4·7H2O0.0028%，CuSO4·5H2O0.0168%，吐温800.2mL，玉米粉20.0g，小麦麸皮6g，酒石酸铵2g，维生素B110μg，维生素B25μg，维生素B65μg；
将培养好的菌株菌种用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取2块菌饼于灭菌的液体基础产酶培养基中，250mL三角瓶加入100mL液体基础产酶培养基（121℃、25分钟高压灭菌），黑暗培养，培养6-10天，4℃下15000rpm离心5min，离心取上清液即为漆酶粗酶液；
上述发酵生产漆酶的方法中，所述培养采用的培养温度可为25℃-35℃，pH为6-8，转速为120-210，培养时间可为6-10天。
实验证明，本发明所提供的粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237在液体基础产酶培养基中，30℃、pH6，180rmp震荡培养6-10d，每毫升发酵液中的漆酶活性为1242.22U/mL；粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237在2,5二甲基苯胺发酵培养基（2,5二甲基苯胺发酵培养基是向液体发酵培养基中加入2,5二甲基苯胺溶液至2,5二甲基苯胺终浓度为0.01%-0.2%的液体培养基）中30℃发酵6-10d，粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237的胞外漆酶产量为2500-2900U/mL。
本发明所提供的粗毛栓菌培养基制备简便，原材料来源广泛，价格低廉，并且该菌株在这种培养基培养条件下可产生高活性的漆酶，与现有资料相比该菌株酶活是现有报道的其它粗毛栓菌最高酶活的10倍左右，同时也明显高于同类其它白腐真菌的漆酶酶活。
粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237筛选及鉴定
1、菌株的分离筛选
采取河南省境内树木的枯木枝上，分离得到三株真菌菌株命名为ZLH237、ZLH238和ZLH239，将获得的菌株通过液体发酵进一步筛选产漆酶活性较高的菌株；
将分离纯化的菌株ZLH237ZLH238和ZLH239接种于PDA培养基平板上，放置30℃培养箱中培养4-5天备用。将培养好的菌株用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取2块菌饼于灭菌的液体基础产酶培养基中，250mL三角瓶加入100mL基础产酶培养基，30℃，摇床180r/min，黑暗培养。培养6-10天后4℃下15000rpm离心5min，离心取上清液即为粗酶液。上述实验重复3次；
2、漆酶活性测定
将步骤1得到三种菌株的粗酶液分别按照下述方法进行漆酶活性测定：
本实验采用ABTS法测定漆酶酶活，反应体系为2mL，含pH4.0酒石酸缓冲液（酒石酸1.5009g/100mL和酒石酸钠2.301g/100mL）1mL，蒸馏水0.78mL、发酵酶液20ul和ABTS（0.137gABTS用50mL蒸馏水溶解200ul，终浓度为500μM），30℃水浴，反应30s，于420nm处测定光吸收值，每组三个重复。酶活性定义：每min催化产生1μmol的NADH或NADPH的量为一个酶活单位，即1U/mL；
实验结果表明真菌菌株ZLH237每毫升发酵液的漆酶活性是1242.22-1500U/mL，ZLH238和ZLH239的漆酶活性分别为634.81U/mL和441.5U/mL，因此对漆酶酶活较高的菌株ZLH237进行生物学鉴定；
3、菌株鉴定
通过菌落形态和分子生物学18sDNA对菌株进行鉴定；
菌落形态特征如下：该菌株菌丝体呈白色，浓密，生长比较快3-4天即可长满平板；
采用通用模板ITS1(5'TCCGTAGGTGAACCTGCGC3')和ITS4(5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3')进行PCR扩增，扩增产物送华大基因公司进行测序，得到的序列经校对后提交GenBank，对其序列进行比对分析，通过BLAST序列对比，该菌株与粗毛栓菌（Trameteshirsuta）的相似度为99%，因此根据菌落形态和分子生物学测定均鉴定该菌株为粗毛栓菌（Trameteshirsuta）。
粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237液体培养条件的优化
1、实验材料
培养基：PDA培养基、基础产酶培养基，组成同上；
2、不同营养成分对产漆酶酶活的影响
（1）碳源对产漆酶的影响：所选碳源为麸皮、大豆粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉，分别替代基础产酶培养基中的玉米粉、麸皮，碳源浓度均为30mg/L，基础产酶培养基中其它成分不变，每个处理3个重复；
各个处理250mL三角瓶加入50mL基础产酶培养基，高压灭菌。将活化的粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237接种于PDA培养基平板上，放置30℃培养箱中培养4-5天备用，将培养好的菌株用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取5块菌饼接入灭菌的基础产酶培养基中，30℃，摇床180r/min，黑暗培养6-10天。离心取上清液即为粗酶液，采用ABTS法测定漆酶酶活；
结果表明当碳源为玉米粉时菌株漆酶活性最高为1300-1500U/mL，产漆酶能力明显高于其它碳源（400U/mL），其次为可溶性淀粉(150U/mL)，其它碳源酶活性非常低；
（2）氮源对产漆酶的影响：所选氮源为豆粕、酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵，酒石酸铵，分别替代基础产酶培养基中的氮源，碳源为筛选后的最佳碳源玉米粉，基础产酶培养基中其它成分不变，每个处理3个重复；
各个处理250mL三角瓶加入50mL基础产酶培养基，高压灭菌。将活化的粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237接种于PDA培养基平板上，放置30℃培养箱中培养4-5天备用，将培养好的菌株用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取5块菌饼接入灭菌的基础产酶培养基中，30℃，摇床180r/min，黑暗培养6-10天。离心取上清液即为粗酶液，采用ABTS法测定漆酶酶活；
结果表明当氮源为豆粕、酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵时菌株产漆酶能力较低，而当氮源为酒石酸铵时菌株产漆酶较高1300-1500U/mL；
（3）碳氮比对产漆酶的影响：在获得碳氮源最佳发酵培养基上考察最佳碳氮源的浓度对漆酶活性的影响；
使基础产酶培养基中酒石酸铵的含量为2g/L，玉米粉的含量为5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L，配制成C/N比分别为2.5/1、5/1、10/1、15/1、20/1和25/1的不同培养基，pH值自然，每处理3次重复；
各个处理250mL三角瓶加入50mL基础产酶培养基，高压灭菌。将活化的粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237接种于PDA培养基平板上，放置30℃培养箱中培养4-5天备用，将培养好的菌株用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取2块菌饼接入灭菌的基础产酶培养基中，30℃，摇床180r/min，黑暗培养6-10天。离心取上清液即为粗酶液，采用ABTS法测定漆酶酶活；
结果表明C/N比为2.5/1时粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237菌株不产漆酶酶活，当碳氮比为10/1-20/1时粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237菌株产漆酶酶活最高为1300-1500U/mL。
3不同培养条件对产漆酶酶活的影响
（1）培养温度对产漆酶的影响
分别用上述试验中最适碳氮源替代基础产酶培养基中的碳源、氮源，调整C/N比为最适C/N比，配成改良培养基，其组成如下：NaH2PO4·12H2O0.039%，MgSO4·7H2O0.05%，琥珀酸钠0.118%，FeSO4·7H2O0.00315%，CaCl2·2H2O0.01%，MnSO4·H2O0.0035%，CH3COONa·3H2O0.0408%，CoCl2·6H2O0.006%，ZnSO4·7H2O0.0028%，CuSO4·5H2O0.0168%，玉米粉40.0g，酒石酸铵2g，Tween-800.2mL，维生素B110μg，维生素B25μg，维生素B65μg，pH自然。接种后分别在为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的条件下发酵培养，分析温度对菌株产漆酶的影响。每处理3次重复。
各个处理250mL三角瓶加入50mL基础产酶培养基，高压灭菌。将活化的粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237接种于PDA培养基平板上，放置30℃培养箱中培养4-5天备用，将培养好的菌株用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取5块菌饼接入灭菌的基础产酶培养基中，30℃，摇床180r/min，黑暗培养6-10天。离心取上清液即为粗酶液，采用ABTS法测定漆酶酶活。
结果表明当温度为30℃时菌株产酶能力最高，漆酶酶活为1300-1500U/mL，菌株在这个温度条件适合产漆酶，其它温度条件产漆酶能力相对较低。
（2）培养基pH对产漆酶的影响
上述改良培养基灭菌后调pH值为分别4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，每处理3次重复。
各个处理250mL三角瓶加入50mL基础产酶培养基，高压灭菌。将活化的粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237接种于PDA培养基平板上，放置30℃培养箱中培养4-5天备用，将培养好的菌株用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取5块菌饼接入灭菌的基础产酶培养基中，30℃，摇床180r/min，黑暗培养6-10天。离心取上清液即为粗酶液，采用ABTS法测定漆酶酶活。
结果表明菌株在偏酸环境条件下产漆酶能力相对较差，在pH值为6-8时产漆酶能力相对较高1300-1500U/mL。
（3）接种量对产漆酶的影响：
上述改良培养基调节pH为6-8，灭菌后在温度为30℃培养发酵，在培养基中分别接入1、3、5、7个菌饼，分析接种量对漆酶酶活的影响。每处理3次重复。
各个处理250mL三角瓶加入50mL基础产酶培养基，高压灭菌。将活化的粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237接种于PDA培养基平板上，放置30℃培养箱中培养4-5天备用，将培养好的菌株用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取5块菌饼接入灭菌的基础产酶培养基中，30℃，摇床180r/min，黑暗培养6-10天。离心取上清液即为粗酶液，采用ABTS法测定漆酶酶活。
结果表明在接种量为1个菌饼时菌株的产酶活能力相对较低，当接种量为3、5和7时菌株漆酶酶活相对较高为1300-1500U/mL。
粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237在不同浓度诱导剂中液体发酵产漆酶
选用诱导剂为2,5-二甲基苯胺，测试了五种浓度条件的液体发酵培养基，分别为0.01%2,5-二甲基苯胺培养基、0.02%2,5-二甲基苯胺培养基、0.08%2,5-二甲基苯胺培养基、0.1%2,5-二甲基苯胺培养基和0.2%2,5-二甲基苯胺培养基。02,5-二甲基苯胺培养基是改良培养基。0.01%2,5-二甲基苯胺培养基是向改良培养基中加入2,5-二甲基苯胺溶液至2,5-二甲基苯胺终浓度0.01%得到的液体。0.02%2,5-二甲基苯胺培养基是向改良培养基中加入2,5-二甲基苯胺溶液至2,5-二甲基苯胺终浓度0.02%得到的液体。0.08%2,5-二甲基苯胺培养基是向改良培养基中加入2,5-二甲基苯胺溶液至2,5-二甲基苯胺终浓度0.08%得到的液体。0.1%2,5-二甲基苯胺培养基是向改良培养基中加入2,5-二甲基苯胺溶液至2,5-二甲基苯胺终浓度0.1%得到的液体。0.2%2,5-二甲基苯胺培养基是向改良培养基中加入2,5-二甲基苯胺溶液至2,5-二甲基苯胺终浓度0.2%得到的液体。
将活化的粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237接种于PDA培养基平板上，放置30℃培养箱中培养3-4天备用。将培养好的菌株用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取3块菌饼分别接入于灭菌的50mL的0.01%2,5-二甲基苯胺培养基、0.02%2,5-二甲基苯胺培养基、0.08%2,5-二甲基苯胺培养基、0.1%2,5-二甲基苯胺培养基和0.2%2,5-二甲基苯胺培养基的容积为250三角瓶中，30℃，摇床180r/min，黑暗培养6-10d。4℃下15000rpm离心5min，收集上清液得到发酵液，按照实施例1的方法测定发酵液的漆酶活性。实验设3次重复。
结果表明，0.01%-0.1%2,5-二甲基苯胺培养基提高了粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237漆酶产量，0.1%2,5-二甲基苯胺培养基降低粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237的漆酶产量，0.2%2,5-二甲基苯胺培养基极大的降低粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237的漆酶产量。其中0.01%2,5-二甲基苯胺培养基极大的提高粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237漆酶产量，产量为2500-2900U/mL，是没有添加2,5-二甲基苯胺培养基的酶活量的2-3倍。粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237在没有添加2,5-二甲基苯胺培养基培养基中的酶活为1242.22U/mL。
粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237对多环芳烃PAHs降解特性
取上述获得的粗酶液4.5mＬ置于30mＬ具塞棕色试剂瓶中，加入0.5ｍＬ用乙腈稀释后的PAHs标准品，反应体系中PAHs初始浓度见表1，拧紧瓶塞，摇匀，置于暗室培养48ｈ(30℃)，加入5ｍＬ乙腈终止反应。摇匀，静置1ｈ后取有机相，高速离心(15000ｇ)，过0.22μｍ滤膜，高效液相测定。对照为粗酶液以灭活(煮沸30min)形式加入，其他步骤同上，每个处理3个重复。
使用安捷伦LC-1200型高效液相色谱仪测定PAHs含量。分离柱为Zorbax300SBC18(4.6×150mm，安捷伦)，柱温30℃，流动相为乙腈和水（体积比为65%：35%），流速1mL/min-1，紫外检测波长254nm。
表1　粗酶液对2种PAHs的降解
多环芳烃 标准品初始浓度（mg/L） 反应体系初始浓度（mg/L）
芘 100 10
菲 10 1
结果表明该菌株所产漆酶对两种PAHs均有一定的降解效果，反应48h后其中菲降解率为45%-60%，芘的降解率为25%-40%。表明粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237在环境修复中有着较大的应用潜力。
由上述可以清楚的表明，本发明制备方法简单，原材料丰富，成本低，粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237用于漆酶，产量高，活性强，酶活提高10倍，产量达到2500-2900U/mL，有效解决了工业上对漆酶的需要，有显著的经济和社会效益。

Claims (2)

1.一种高产漆酶的粗毛栓菌，分类命名为粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237，2015年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.11811，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的粗毛栓菌（Trameteshirsuta）ZLH237在高产漆酶中的应用。
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