CN111979131B - 一株高效脱色木质素的粗毛栓孔菌 - Google Patents

一株高效脱色木质素的粗毛栓孔菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高效脱色木质素的粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X‑13，属于微生物工程技术领域，将本发明所述菌株接种至含有5g/L木质素的培养基中，于28℃，180rpm条件下培养11d后，该菌对木质素的脱色率可达52.43％。本菌株对于含木质素溶液的脱色效果要优于国内外报道的大部分同种属菌株，且脱色时间较短，操作简单，适合应用于含木质素的废液如造纸工业废液的工业化处理。

Description

一株高效脱色木质素的粗毛栓孔菌
技术领域
本发明涉及一株高效脱色木质素的粗毛栓孔菌，属于微生物工程技术领域。
背景技术
随着人们对不同种类的纸制品需求量不断增加，造纸工业发展迅速，但是造纸工业生产过程中产生的大量有色废水正成为日益严重的污染源，造纸工业废液中由于含有大量的木质素及其衍生物而呈现出黑色，如何对造纸工业废液进行有效处理、减少其对环境影响是目前亟待解决的重要问题。
木质素是由不同结构的苯丙单元通过碳碳键和醚键相互连接而成的一种三维网状空间结构的不溶性的高分子聚合物，天然木质素不溶于水和绝大多数溶剂，难以被酸和酶水解，是难被降解的天然高聚物之一，在木质素的结构中具有羰基、烯基等不饱和双键发色基团，在侧链上则还有苯、丙酮、苯乙酮等助色基团，还存在醌和甲基醌类物质与羰基、稀基形成共轭双键以及一些自由基，这些发色或助色基团的存在使得木质素具有很深的颜色，也是造纸黑液呈黑色的根本原因，木质素的脱色与其发色基团的断裂有密切关系。
目前对于木质素脱色处理主要有传统的物理化学法脱色和生物法脱色；传统的物理化学法对废液的脱色处理操作困难、成本高、脱色效率低，很难作为大规模的工业处理废液方式，而生物法脱色木质素因具有条件温和、利于环保，且不产生后续发酵抑制物等优点，而很有希望成为处理造纸废液的工业应用方法。目前用于生物法脱色的主要是白腐菌，白腐菌能够通过分泌木质素降解酶来脱色木质素，木质素降解酶主要包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶等。但是目前研究的白腐菌菌株存在木质素酶活性普遍不高、酶负荷较高、脱色效率不高等缺点，具有工业应用前景的菌株较少。对于具有高效脱色木质素能力的菌株的筛选和开发将对应用于含木质素的废液如造纸工业废液的工业化处理具有重要的现实意义。
因此，目前急需筛选得到一种具有可高效脱色工业废液中木质素能力的菌株。
发明内容
解决上述技术问题，本发明提供了一株粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13，所述粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18567，保藏日期为2019年09月09日。
本发明的粗毛栓孔菌粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌株来源于山林中枯立木或倒木上生长的真菌子实体，该菌株经测序分析，其ITS基因序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，结果显示与粗毛栓孔菌株(Trameteshirsuta)WZ-219的核酸序列相似度高达100％，选取与其相似度高的菌株构建系统进化树(如图4所示)，结果显示，结合菌株形态特征和基于ITS基因序列的系统进化分析，鉴定为粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)，将其命名为粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13。
所述粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13在PDA琼脂培养基上生长迅速，菌落呈现乳白色且均匀，扁平，菌丝紧致，表面呈现绒毛状，无同生圆。(具体可见图1-图3)
本发明还提供了上述粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13在脱色木质素中的应用。
本发明还提供了一种脱色木质素的方法，所述方法为将权利要求1所述的粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13接种于种子培养基中进行培养，得到种子液；将种子液接种至含木质素的发酵培养基中进行发酵培养。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液中，粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌体的浓度为10～14g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液在发酵培养基中的接种体积与发酵培养基的体积之比为0.5～1.5:10。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的条件为：在温度为26-30℃，转速为160-190rpm的条件下发酵9-15天。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液制备方法为：将粗毛栓孔菌(Trameteshirsuta)X-13接种到种子培养基中，在温度为26-30℃，转速为160-190rpm的条件下培养2-5天。
本发明还提供了一种可用于脱色木质素的产品，所述产品中含有上述粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13。
本发明还提供了一种发酵生产漆酶和/或锰过氧化物酶的方法，所述方法为：将上述的粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌丝体接种于种子培养基中进行培养，得到种子液；将种子液接种至含木质素的发酵培养基中发酵培养，得到发酵液；从发酵液中分离得到漆酶和/或锰过氧化物酶。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液在发酵培养基中的接种量占发酵培养基总体积的至少10％。
有益效果：
(1)本发明提供了一株具有高效脱色木质素能力的粗毛栓孔菌，将本发明所提供的粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13接种至含有5g/L木质素的培养基中，于28℃，180rpm条件下培养11d后，对木质素的脱色率可高达52.43％。
(2)本发明提供的粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌株对于含木质素溶液的脱色效果要优于国内外报道的大部分同种属菌株，且脱色时间较短，操作简单，适合应用于含木质素的废液如造纸工业废液的工业化处理，本发明为含木质素的废液的工业化处理提供了一种优良的微生物资源。
(3)本发明提供了一株具有高效脱色木质素能力的粗毛栓孔菌，该菌能高效脱色木质素，将在含木质素的废液如造纸工业废液的工业化处理方面具有很大的潜力。
生物材料保藏
一株粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13，分类学命名为粗毛栓孔菌Trameteshirsuta，已于2019年09月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18567，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13的菌落形态图正面；
图2：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13的菌落形态图背面；
图3：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13的菌丝形态图；
图4：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13基于ITS序列的系统发育树图；
图5：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13在PDA-愈创木酚琼脂培养基上的产木质素降解酶检测图正面；
图6：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13在PDA-愈创木酚琼脂培养基上的产木质素降解酶检测图背面；
图7：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13在PDA-苯胺蓝琼脂培养基上的产过氧化物酶检测图正面；
图8：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13在PDA-苯胺蓝琼脂培养基上的产过氧化物酶检测图背面；
图9：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13在脱色木质素过程中的生长曲线图；
图10：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13在脱色木质素过程中的漆酶和锰过氧化物酶活性变化图；
图11：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13对木质素的降解率和脱色率随着培养时间变化图；
图12：云芝栓孔菌株Trametes versicolor Z-1对木质素的降解率和脱色率随着培养时间变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的培养基如下：
种子培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、(NH4)2SO4 3.0g/L、KH2PO4 1.0g/L、K2HPO41.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 7.0～7.2。
木质素发酵培养基：木质素5.0g/L、(NH4)2SO4 4.0g/L、KH2PO4 1.0g/L、K2HPO41.0g/L、NaCl 0.1g/L、MgSO4 0.3g/L、MnSO4 0.05g/L、FeSO4 0.01g/L、CuSO4 0.01g/L、ZnSO40.01g/L、CoCl2 0.005g/L、Na2MoO4 0.001g/L、KAl(SO4)2 0.001g/L、H3BO3 0.01g/L，pH 7.0～7.2。
PDA琼脂培养基：200.0g马铃薯的提取液1000mL、葡萄糖10.0g/L、MgSO4 1.5g/L、KH2PO4 3.0g/L、VB0.05 g/L、琼脂20.0g/L，pH 7.0～7.2。
PDA-苯胺蓝琼脂培养基：200.0g马铃薯的提取液1000mL、葡萄糖10.0g/L、苯胺蓝0.1g/L、MgSO4 1.5g/L、KH2PO4 3.0g/L、VB0.05 g/L、琼脂20.0g/L，pH 7.0～7.2。
PDA-愈创木酚琼脂培养基：200.0g马铃薯的提取液1000mL、葡萄糖10.0g/L、愈创木酚1mL、MgSO4 1.5g/L、KH2PO4 3.0g/L、VB0.05 g/L、琼脂20.0g/L，pH 7.0～7.2。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
漆酶活性检测方法：
通过在420nm监测ABTS的氧化后体系中吸光度的增加值来测定(ε420＝36000L·mol-1·cm-1)；3ml的测量体系中含有2850μL的醋酸钠缓冲液，1mmol·L-1的ABTS和100μL粗酶液，使用酶标仪在420nm处测定3min内体系中吸光度的增加值。
锰过氧化物酶活性检测方法：
通过在469nm处监测2,6-DMP被氧化成3,3',5,5'-四甲氧联对苯醌时的体系中吸光度的增加值来检测(ε469＝49600L·mol-1·cm-1)；3mL的测量体系中含有2780μL的醋酸钠缓冲液，1mmol·L-1的MnS04、1mmol·L-1的2,6-DMP和100μL粗酶液，反应在加入1mmol·L- 1H2O2后开始启动，使用酶标仪在469nm处测定3min内体系中吸光度的增加值。
酶活定义：在上述检测条件下，将每分钟使lμmol底物转化为产物所需的酶量定义为一个国际制酶活单位(IU)，并以IU·mL-1的单位来表示酶活力。
木质素脱色率的检测方法：将待测液与磷酸盐缓冲液(pH 7.6)按1:2进行混合，使用紫外分光光度计在465nm处测定吸光度，根据下面公式计算脱色率：
脱色率(％)＝(A0-An)/A0×100；
A0：空白对照的吸光度；An：接种菌株培养第n天的吸光度。
实施例1：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌株的分离、筛选及种属鉴定
1、分离与筛选
将取自湖南省岳麓山中枯立木或倒木上长势良好的真菌子实体，通过无菌水清洗表面、75％酒精擦拭表面后，于超净台中用灭过菌的解剖刀将真菌子实体切成0.5cm×0.5cm的菌块，将菌块接种于PDA琼脂培养基上，并置于28℃恒温培养箱中培养。
待PDA琼脂培养基上长出真菌菌丝体后，用接种铲切下0.5cm×0.5cm带有薄层培养基的菌丝体，接种于新的PDA琼脂培养基中。
通过反复接种培养2～3代后获得微生物的纯菌落，将分离得到的纯菌落分别接种至PDA-苯胺蓝琼脂培养基和PDA-愈创木酚琼脂培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养，分别记录纯菌落在苯胺蓝培养基上的脱色圈直径和在愈创木酚培养基上的显色圈直径，脱色圈直径和显色圈直径最大的菌株即为产木质素降解酶能力最强的菌株，以初步判断菌株产木质素降解酶的能力，筛选出苯胺蓝培养基上的脱色圈和在愈创木酚培养基上的显色圈最大的菌株，即得到菌株X-13。
2、鉴定
将上述得到的菌株X-13单菌落接种到PDA琼脂培养基上，然后将PDA琼脂培养基倒置于28℃恒温培养箱中，培养3～5d，观察长出的菌落形态。菌种在PDA琼脂培养基上生长迅速，由图1～3可知，菌落呈现乳白色且均匀，扁平，菌丝紧致，表面呈现绒毛状，无同生圆，挑选在PDA琼脂培养基上生长良好的菌丝制成菌悬液，光学显微镜油镜下观察，其营养菌丝壁光滑，具分隔，多分枝，形态上与粗毛栓孔菌相似。
3、菌株的系统发育树分析
采用天根生化科技有限公司提供的真菌基因组DNA提取试剂盒，抽提菌株的基因组DNA，以此为模板，利用真菌ITS通用引物通过PCR反应扩增菌株的ITS序列片段，扩增得到的片段由上海生工生物工程有限公司进行测序(其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示)。将测序得到的菌株的ITS序列与NCBI的核酸数据库进行BLAST比对分析，采用MEGA 5.1软件基于临近法构建系统发育树(如图4所示)。
由菌落形态特征与ITS序列分析的实验结果，将该菌鉴定为粗毛栓孔菌(Trameteshirsuta)，命名为粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13。
实施例2：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌株产木质素降解酶的检测
将实施例1得到的粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌丝体接种到PDA-愈创木酚琼脂培养基上，然后将PDA-愈创木酚琼脂培养基倒置于28℃恒温培养箱中，培养3～5d，观察并记录菌落周围培养基的变色情况。
结果如图5～6所示，与未接种粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13的对照相比，接种了该菌的PDA-愈创木酚琼脂培养基上的菌落周围和底部有较大且清晰的红棕色圈，红棕色圈的直径为：31mm，这种现象说明该菌株具有较强的木质素降解酶的能力。
实施例3：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌株产过氧化物酶的检测
将实施例1得到的粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌丝体接种到PDA-苯胺蓝琼脂培养基上，然后将PDA-苯胺蓝琼脂培养基倒置于28℃恒温培养箱中，培养3～5d，观察并记录菌落周围培养基的脱色情况。
结果如图7～8所示，与对照相比，接种了该菌的PDA-苯胺蓝琼脂培养基的蓝色几乎消失，褪色圈的直径为：55mm，且菌丝仍然呈现自然色，这说明该菌能降解并利用苯胺蓝，而不是吸附苯胺蓝，这预示着菌株具有较强的产木质素过氧化物酶或者锰过氧化物酶的能力。
实施例4：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌株在木质素培养基中的生长
(1)将实施例1得到的粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌丝体接种至种子培养基中进行培养，培养至菌体浓度为12.2g/L后得到粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13种子液。
(2)将步骤(1)中得到粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13种子液以10％(v/v)的接种量接种至木质素发酵培养基中，在28℃，180rpm下培养13d，从培养的第1天开始，每隔48h取样品溶液，样品溶液于12000rpm、4℃离心10min后，去上清液得到菌丝球，将菌丝球用去离子水冲洗三遍后，于60℃烘箱中烘干至恒重并称重。
结果如图9所示，菌株在前3天一直保持生长，之后菌体生物量开始下降，直到第7d开始进入稳定期，这说明该菌可以利用培养基中的木质素作为碳源和能源物质进行代谢并维持自身的生长。
实施例5：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌株在木质素培养基培养过程中产漆酶和锰过氧化物酶活性变化特点
(1)将实施例1得到的粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌丝体接种至种子培养基中进行培养，培养至菌体浓度为12.2g/L后得到粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13种子液；
(2)将粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13种子液以10％(v/v)的接种量，接种至木质素发酵培养基中，在28℃，180rpm下培养13d，从培养的第1天开始，每隔48h取样品溶液，将样品于12000rpm、4℃离心10min后，弃沉淀，上清液即为粗酶液。
分别检测粗酶液中漆酶和锰过氧化物酶的酶活，结果如图10所示，该菌在培养的前3天，其漆酶和锰过氧化物酶活性一直在增加，之后锰过氧化物酶活性保持上升，直至第7天达到最大值23.08U/mL，而漆酶活性略微下降后又上升，也是在第7天达到最大值9.94U/mL，随后两种酶活性开始下降，这说明该菌在木质素液体培养基培养过程中可产生大量的漆酶和锰过氧化物酶，但是在降解过程中并未检测到该菌的木质素过氧化物酶活性，这表明该菌对木质素的利用是依赖其分泌的漆酶和锰过氧化物酶。
酶活测定的反应体系为：在50mmol·L-1、pH 5.0和pH4.5的醋酸钠缓冲液中在37℃下进行，加入灭活的粗酶液样品作为参比。
实施例6：粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌株对木质素的脱色率和降解率变化特点
将实施例1得到的粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13菌丝体接种至种子培养基中进行培养，培养至菌体浓度为12.2g/L后得到粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13种子液；
将粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13种子液以10％(v/v)的接种量，接种至木质素发酵培养基中，在28℃，180rpm下培养13d，从培养的第1天开始，每隔48h取样品溶液，将样品于12000rpm、4℃离心10min后，弃沉淀，得到的上清液用于木质素的浓度和色度的检测。
结果显示(如图11所示)，在菌株培养过程中，木质素的脱色率与降解率变化趋势一致，随着培养时间的延迟其脱色率和降解率也一直增加，其中培养的第1d，脱色率和降解率均比较低，可能是菌体进入适应期，随后脱色率和降解率增加较快，直至第11d，其脱色率和降解率达到最大值，分别为52.43％和26.43％，这表明该菌可以高效脱色木质素溶液。
对比例1
具体实施方式同实施例6，区别在于调整菌株为云芝栓孔菌Trametes versicolorZ-1，其中，所述云芝栓孔菌Trametes versicolor Z-1菌株为同期筛选菌株，结果如图12所示，该菌对木质素的脱色率和降解率分别为26.32％和13.54％，远低于本发明菌株粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)X-13的效果，这进一步说明本发明菌株具有强的木质素脱色能力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南林业科技大学
<120> 一株高效脱色木质素的粗毛栓孔菌
<130> BAA200552A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 585
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcctgcgga aggatcatta acgagttttg aaatgggttg ttgctggcct tccgaggcat 60
gtgcacgccc tgctcatcca ctctacacct gtgcacttac tgtaggttgg cgtgggtttc 120
tagcctccgg gctgggagca ttctgccggc ctatgtacac tacaaactct aaagtatcag 180
aatgtaaacg cgtctaacgc atcttaatac aactttcagc aacggatctc ttggctctcg 240
catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc 300
atcgaatctt tgaacgcacc ttgcgctcct tggtattccg aggagcatgc ctgtttgagt 360
gtcatgaaat tctcaaccca taagtccttg tgatctatgg gcttggattt ggaggcttgc 420
tggccctagc ggtcggctcc tcttgaatgc attagcttga ttccgtgcgg atcggctctc 480
agtgtgataa ttgtctacgc tgtgaccgtg aagcgttttg gcaagcttct aaccgtccat 540
taggacaatc tttcaacatc tgacctcaaa tcaggtagac accgg 585

Claims (10)

1.一株粗毛栓孔菌(Trametes hirsuta)，其特征在于，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18567，保藏日期为2019年09月09日。
2.权利要求1所述的粗毛栓孔菌在脱色木质素中的应用。
3.一种脱色木质素的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述的粗毛栓孔菌接种于种子培养基中进行培养，得到种子液；将种子液接种至含木质素的发酵培养基中进行发酵培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述种子液中，粗毛栓孔菌菌体的浓度为10～14g/L。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述种子液在含木质素的发酵培养基中的接种体积与发酵培养基的体积之比为0.5～1.5:10。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：在温度为26～30℃，转速为160-190rpm的条件下发酵9～15天。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子液制备方法为：将粗毛栓孔菌接种到种子培养基中，在温度为26～30℃，转速为160～190rpm的条件下培养2～5天。
8.一种可用于脱色木质素的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的粗毛栓孔菌。
9.一种发酵生产漆酶和/或锰过氧化物酶的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述的粗毛栓孔菌菌丝体接种于种子培养基中进行培养，得到种子液；将种子液接种至含木质素的发酵培养基中发酵培养，得到发酵液；从发酵液中分离得到漆酶和/或锰过氧化物酶。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述种子液在发酵培养基中的接种量占发酵培养基总体积的至少10％。
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