CN114262669A - 一种塔宾曲霉的分离方法及塔宾曲霉的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种塔宾曲霉的分离方法及塔宾曲霉的应用，以秸秆为载体提取可以降解秸秆的微生物，通过培养使得菌种可以大量繁殖，通过分离得到红褐色至褐黑色的分生孢子，呈球形或放射状，分子孢子梗大多生自基质，产孢结构大多为双层，密生顶囊的菌落；将挑取的菌落进行活化，用ABTS显色固体培养基、苯胺蓝显色固体培养基培养，可以看到菌株染色后均产生了脱色圈，证明菌株可分泌漆酶和木质素过氧化物酶，通过对筛选到的菌株ITS序列扩增，再在NCBI对序列进行对比，获得相似序列信息，利用MEGA‑X建立系统发育树，确定菌株为塔宾曲霉，并可将塔宾曲霉应用于降解木质素以及染料脱色。
Description
技术领域
本发明属于微生物学工程与技术领域，具体涉及一种塔宾曲霉的分离方法及塔宾曲霉的应用。
背景技术
秸秆是一种很好的生物质能源，现在国内外有很多秸秆降解方面的研究，包括物理方法、化学方法和微生物方法。秸秆组织中的木质素通常与其他成分以嵌合体的形式存在，包围或黏合纤维素，使水分难以渗透，保护纤维素免遭微生物或其酶的攻击，成为有效利用秸秆中纤维素、半纤维素等资源的一大障碍。
目前，秸秆生物质降解的方法多需要先通过物理或化学的方法去除木质素，再通过添加外源微生物的方法降解纤维素和半纤维素。这种办法可有效分解木质素的网状结构，显著改善生物质的酶解特性进而提高降解效率，这也是目前生物质预处理的一个核心环节。然而，这种方法一方面并未有效利用木质素这一生物资源，造成资源的一大浪费。另一方面，物理或化学的预处理方法治理成本高，易造成二次污染。多年以来，科学家们在微生物降解木质素方面进行了很多的探索，也取得了相当大的研究进展，已从森林凋落物、土壤、朽木等基质中分理处一些木质素降解微生物，并尝试利用固态发酵等方法对其进行放大培养。从研究结果看出，自然界参与降解木质素的微生物主要来自真菌，尤其是白腐菌种的担子菌被确认能彻底分解木质素为CO2和水。然而，这些微生物种类有限，且都需要外源添加的方式应用于秸秆生物质的降解，降解效率严重受限。因此，分离筛选高效的秸秆木质纤维素降解菌对促进秸秆生物质资源的高效利用、减轻环境污染有极其重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种从秸秆中分离出塔宾曲霉的方法；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供塔宾曲霉在降解木质素中的应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种塔宾曲霉的分离方法，包括以下步骤：
步骤S1：材料准备，将秸秆清洗干净并室温干燥至含水量6.5％～8.5％后，裁剪成长度0.3～1.5cm的秸秆粒；
步骤S2：培养，称取秸秆粒置于干净灭菌的玻璃培养皿中，加入浓度为0.5％～3％的灭菌蔗糖溶液，在黑暗中培养7～15天后转移至三角瓶中，然后置于35～40℃恒温培养箱，200～250rpm震荡培养0.5～3h得到悬液；
步骤S3：分离，将悬液进行离心，取上清，用ddH2O进行梯度稀释，在PDA培养基固体平板上涂布经过梯度稀释的悬液，黑暗中培养5～10天后，观察菌落形态，挑取呈球形或放射状、分生孢子红褐色或褐黑色、产孢结构为双层、表面密生顶囊的单菌落保存备用；
步骤S4：活化，将挑取后进行保存备用的单菌落接种于PDA液体培养基中，然后置于30～40℃恒温培养箱，120～250rpm培养8～20h，得菌液；
步骤S5：取2μl菌液点在ABTS显色固体培养基、苯胺蓝显色固体培养基中，在25～35℃培养3～5天，产生具有脱色圈的菌株；
步骤S6：分子鉴定，进行ITS序列鉴定，再使用NCBI对序列进行比对以得出鉴定结果。
本申请以秸秆为载体提取可以降解秸秆的微生物，通过培养使得菌种可以大量繁殖，通过分离得到的菌落具有以下特征：菌落质地丝绒状或呈絮状，表面初始为白色，随后变为亮黄色，后期呈黑色厚丝绒状，直径达到68～73mm，背面无色或中央微黄褐色，分生孢子红褐色至褐黑色，呈球形或放射状，分子孢子梗大多生自基质，产孢结构大多为双层，密生顶囊，从形态上看该菌属于曲霉属；将挑取的菌落进行活化，用ABTS显色固体培养基、苯胺蓝显色固体培养基培养，可以得到菌株染色后均产生了脱色圈，证明菌株可分泌漆酶(可通过ABTS监测)和木质素过氧化物酶(可脱色苯胺蓝)，通过对筛选到的菌株ITS序列扩增，再在NCBI对序列进行对比，获得相似序列信息，利用MEGA-X建立系统发育树，以泡盛曲霉Aspergillus awamori为外群，结果显示，该菌属于塔宾曲霉。
进一步地，所述的塔宾曲霉的分离方法，在所述步骤S1中，所述秸秆为水稻秸秆、小麦秸秆、番茄秸秆、麻类秸秆、青稞秸秆、花生秸秆、薯类秸秆中的至少一种，所述秸秆的初始含水量为6.8～9.2％。
进一步地，所述的塔宾曲霉的分离方法，在所述步骤S2中，悬液中秸秆粒的浓度为0.1～0.3g/mL，培养温度为20～35℃。在黑暗中培养菌种，可减少光线对真菌生长发育和产生次生代谢物的影响，且在该浓度和温度下，菌种的繁殖效率可以得到提高。
进一步地，在所述步骤S3中，悬液的离心速率为8000～12000rpm，离心时间为5～30min，用ddH2O进行梯度稀释时，稀释梯度为102、104和106。其中，各PDA培养基固体平板均长出真菌，其中稀释倍数相对较小(102，104)的培养板PDA培养基固体平板因密度较高，出现的都是菌群，稀释106倍的培养板在培养5～7代后，出现真菌单菌落。
进一步地，所述的塔宾曲霉的分离方法，在所述步骤S3中，所述PDA培养基固体平板的配置：
步骤S3.1：称取100～200g去皮马铃薯切成小块，加水1000mL，加热至马铃薯煮烂，用纱布过滤掉滤渣，补水至1000mL，加热；
步骤S3.2：加入20g琼脂，继续加热搅拌，待琼脂溶解完后，加入20g葡萄糖、3gKH2PO4、1.5g MgSO4·7H2O、0.01g维生素B1搅拌均匀；
步骤S3.3：分装平板，以厚度0.003～0.010mm的PU塑料膜覆盖在培养基表面，180℃灭菌20min，室温凝固后备用。
PDA培养基固体平板的培养基表面覆盖有厚度0.003～0.010mm的PU塑料膜，厚度极薄，180℃时会变为粘弹状态与培养基表面融合，凝固后，在PDA培养基固体平板上涂布经过梯度稀释的悬液，塔宾曲霉可以很好降解培养基表层，并在PDA培养基固体平板上繁殖生长，而其余菌株由于无法降解PU，因此无法获取足够的养分而被淘汰，因此，PDA培养基固体平板可以起到很好菌种筛选作用，有利于纯化菌株。
进一步地，所述的塔宾曲霉的分离方法，在所述步骤S4中，用3mm×3mm打孔器提取单菌并落接种于PDA液体培养基中，以血球计数器计数，稀释至分生孢子数为107～1010个/mL。
进一步地，所述的塔宾曲霉的分离方法，在所述步骤S4中，PDA液体培养基的制备：称取200g去皮马铃薯切成小块，加水1000mL，加热至马铃薯煮烂，用纱布过滤掉滤渣，补水至1000mL，加热；加入20g琼脂，继续加热搅拌，待琼脂溶解完后，加入15～20g葡萄糖、0.3～1g NaCl、0.3～1g NaNO3、0.3～1g MgSO4·7H2O、0.3～0.5g NH4Cl搅拌均匀；121℃灭菌20min，混匀后再倾注平皿备用；
进一步地，所述的塔宾曲霉的分离方法，在所述步骤S5中，所述ABTS显色固体培养基的制备：称取200g去皮马铃薯切成小块，加水1000mL，加热至马铃薯煮烂，用纱布过滤掉滤渣，补水至1000mL，加热；加入20g琼脂，继续加热搅拌，待琼脂溶解完后，加入10g葡萄糖、20g酵母粉、5g蛋白胨、5gNaCl搅拌均匀。121℃灭菌20min。倒平板前加入100μL0.5mmol/L的ABTS。
所述苯胺蓝显色固体培养基的制备：称取200g去皮马铃薯切成小块，加水1000mL，加热至马铃薯煮烂，用纱布过滤掉滤渣，补水至1000mL，加热；加入20g琼脂，继续加热搅拌，待琼脂溶解完后，加入10g葡萄糖、20g酵母粉、5g蛋白胨、5gNaCl搅拌均匀。121℃灭菌20min。倒平板前加入含量为0.01％的苯胺蓝燃料。
进一步地，所述塔宾曲霉的分离方法得到的塔宾曲霉菌株。
进一步地，一种塔宾曲霉在降解木质素方面以及染料的脱色的应用。具体可以将其与纤维素结合，用于降解秸秆、竹材、木材、植物外皮、植物根茎；可以将其应用于纺织废水中的染料和有毒的合成染料的脱色。
进一步地，含有所述的塔宾曲霉的木质纤维分解复合菌剂。
进一步地，含有所述的塔宾曲霉的脱色剂。
进一步地，所述的含有所述的塔宾曲霉的木质纤维分解复合菌剂包含塔宾曲霉、纤维素酶、山梨酸钠、KH2PO4、β-环糊精、MgSO4、纤维二糖。
进一步地，所述的塔宾曲霉的木质纤维分解复合菌剂在秸秆降解中的应用。
与现有技术相比，本申请的塔宾曲霉的分离方法高效简单，分离筛选出的菌株可以产生漆酶，从而高效降解秸秆中的木质素，还可以应用于废水燃料脱色，促进秸秆资源以及水资源的高效利用，且含有该塔宾曲霉的木质纤维分解复合菌剂可以很好提高对秸秆的降解的效率。
附图说明：
图1为本发明一种塔宾曲霉的分离方法的秸秆粒培养示意图；
图2为本发明PDA培养基固体平板示意图；
图3为本发明塔宾曲霉在ABTS显色固体培养基上的菌落形态特征示意图；
图4为本发明塔宾曲霉在苯胺蓝显色固体培养基上的菌落形态特征示意图；
图5为本发明塔宾曲霉的菌株形态示意图；
图6为本发明塔宾曲霉的分生孢子形态示意图；
图7为本发明塔宾曲霉的ITS序列进化树；
图8为塔宾曲霉对木质纤维素的降解影响试验中A组试验组30天降解后水稻秸秆的含量示意图；
图9为塔宾曲霉对木质纤维素的降解影响试验中A1组30天降解后水稻秸秆的形态示意图；
图10为塔宾曲霉对木质纤维素的降解影响试验中A2组30天降解后水稻秸秆的形态示意图；
图11为塔宾曲霉对木质纤维素的降解影响试验中B组试验组30天降解后番茄秸秆的含量示意图；
图12为塔宾曲霉对木质纤维素的降解影响试验中B1组30天降解后水稻秸秆的形态示意图；
图13为塔宾曲霉对木质纤维素的降解影响试验中B2组30天降解后水稻秸秆的形态示意图；
图14为塔宾曲霉对木质纤维素的降解影响试验中A2组培养基中木质纤维素(包括纤维素、半纤维素、木质素和矿物质)含量变化；
图15为塔宾曲霉对木质纤维素的降解影响试验中B2组培养基中木质纤维素(包括纤维素、半纤维素、木质素和矿物质)含量变化；
图16为塔宾曲霉及其木质纤维分解复合菌剂对秸秆降解的影响试验的各组秸秆细胞壁组织结构的示意图；
图17为塔宾曲霉对染料的脱色能力试验中a～f六组中试验组和对照组的染料脱色情况对照图；
图18为塔宾曲霉对染料的脱色能力试验中a～f六组中分光度的变化折线图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明中所涉及的材料、器皿、试剂以及设备，均可通过市售或本领域常规技术手段获得。
实施例一：
根据图1-图4所示，本实施例提出从秸秆中分离菌株过程具体为：
一种塔宾曲霉的分离方法，包括以下步骤：
步骤S1：材料准备，将秸秆清洗干净并室温干燥至含水量6.5％～7.3％后，裁剪成长度0.3～1.5cm的秸秆粒；所述秸秆为水稻秸秆，所述秸秆的初始含水量为8.1～9.2％；
步骤S2：培养，称取秸秆粒置于干净灭菌的玻璃培养皿中，加入浓度为1％的灭菌蔗糖溶液，秸秆粒与灭菌蔗糖溶液的配比为0.3g/mL，在培养箱中28℃恒温黑暗培养10天后转移至三角瓶中，然后置于40℃恒温培养箱，220rpm震荡培养1h得到悬液；
步骤S3：分离，将悬液置于离心机中进行离心，离心速率10000rpm，离心时间为5～30min，取上清，用ddH2O进行梯度稀释，稀释梯度为10-2、10-4和10-6，在PDA培养基固体平板上涂布经过梯度稀释的悬液，黑暗中培养5～10天后，观察菌落形态，挑取呈球形或放射状、分生孢子红褐色或褐黑色、产孢结构为双层、表面密生顶囊的单菌落保存备用；
步骤S4：活化，用3mm×3mm打孔器提取单菌并接种于PDA液体培养基中，然后置于30℃恒温培养箱，200rpm培养12h，得菌液；
步骤S5：取2μl菌液点在ABTS显色固体培养基、苯胺蓝显色固体培养基中，在30℃培养5天，产生具有脱色圈的菌株；所述ABTS显色固体培养基的制备：称取200g去皮马铃薯切成小块，加水1000mL，加热至马铃薯煮烂，用纱布过滤掉滤渣，补水至1000mL，加热；加入20g琼脂，继续加热搅拌，待琼脂溶解完后，加入10g葡萄糖、20g酵母粉、5g蛋白胨、5gNaCl搅拌均匀。121℃灭菌20min。倒平板前加入100μL 0.5mmol/L的ABTS。
所述苯胺蓝显色固体培养基的制备：称取200g去皮马铃薯切成小块，加水1000mL，加热至马铃薯煮烂，用纱布过滤掉滤渣，补水至1000mL，加热；加入20g琼脂，继续加热搅拌，待琼脂溶解完后，加入10g葡萄糖、20g酵母粉、5g蛋白胨、5gNaCl搅拌均匀。121℃灭菌20min。倒平板前加入含量为0.01％的苯胺蓝燃料。
步骤S6：分子鉴定，进行ITS序列鉴定，再使用NCBI对序列进行比对，利用MEGA-X建立系统发育树，得出鉴定结果。
在本实施例中，在所述步骤S3中，所述PDA培养基固体平板的配置：
步骤S3.1：称取200g去皮马铃薯切成小块，加水1000mL，加热至马铃薯煮烂，用纱布过滤掉滤渣，补水至1000mL，加热；
步骤S3.2：加入20g琼脂，继续加热搅拌，待琼脂溶解完后，加入20g葡萄糖、3gKH2PO4、1.5g MgSO4·7H2O、0.01g维生素B1搅拌均匀；
步骤S3.3：分装平板，以厚度0.003mm的PU塑料膜覆盖在培养基表面，180℃灭菌20min，室温凝固后备用。
从图3、图4可以看出，在步骤S5中，ABTS显色固体培养基上的菌落出现呈绿色的脱色圈，代表有漆酶产生；苯胺蓝显色固体培养基中的菌落周围的出现透明脱色圈，代表菌落产木质素过氧化物酶LiP。
实施例二：
根据上述的塔宾曲霉的分离方法得到的菌株ST-3，参考图5-图6，在显微镜下观察苯胺蓝显色固体培养基中菌株的菌株形态、菌丝及孢子形态，Bar＝200μm，其形态学鉴定：在苯胺蓝显色固体培养基上30℃培养5天，菌落直径达到68～73mm，分生孢子头呈球形或放射状，由菌体中心向外逐步扩散，直径155～420μm，分子孢子梗大多生自基质，壁平滑，密生顶囊，顶囊球形或近球形，直径在25～62μm，产孢结构大多为双层，分身孢子多为球形或近球形，壁粗糙，从形态上看该菌属于曲霉属。
参考图7，将菌株ST-3进行ITS序列鉴定，菌株ITS序列为：AAGGATCATTACCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTATTATACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTTTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCA；通过对筛选到的真菌ITS序列扩增数据提交GenBank，利用NCBI进行同源性比对，获得相似序列信息，菌株ST-3与曲霉属(Aspergillus)菌株的同源性达100％，使用生物信息学分析软件MEGA-X构建系统发育树，分子生物学数据表明该菌株ST-3为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)。
研究塔宾曲霉降解能力试验：
1、木质素降解实验：
1.1、塔宾曲霉含量对木质素降解速率的影响：
试验方法：准确量取10.0g麦草碱木质素5份，分别添加到标号为1～5的PDA液体培养基(100mL)中，搅拌均匀，分别向各液体培养基接种10培养、15培养、20培养、25培养、30培养上述实施例一步骤S4制备得到的菌液，30℃培养10天后，120℃灭菌10min，用浓盐酸调节液体培养基的pH至1.5，静置12h，然后过滤，用超纯水反复洗涤滤饼至滤液为中性，将滤饼至于冷冻干燥机中干燥至恒温，称重，计算木质素的降解率。
降解率＝(初始质量-最终质量)/初始质量
PDA液体培养基的制备：(1)称取200g去皮马铃薯切成小块，加水1000mL，加热至马铃薯煮烂，用纱布过滤掉滤渣，补水至1000mL，加热；(2)加入20g琼脂，继续加热搅拌，待琼脂溶解完后，加入18g葡萄糖、0.5g NaCl、0.5g NaNO3、0.8g MgSO4·7H2O、0.3g NH4Cl搅拌均匀；(3)121℃灭菌20min，混匀后再倾注平皿备用。
1.2、塔宾曲霉对木质纤维素的降解影响：
试验方法：建立两组试验组，A组以水稻秸秆颗粒为降解对象，B组以番茄秸秆颗粒为降解对象，每组试验组设定一组空白对照组以及两组平行试验组，降解对象的粒径为0.3～0.5mm。
准确量取2g的水稻秸秆颗粒3份，番茄秸秆颗粒3份，分别加到6根到试管中，向各试管中加入蒸馏水100mL，121℃，灭菌20min，制成6组木质纤维素降解液体培养基，根据试验组将6组木质纤维素降解液体培养基标记为A1、A2、A3、B1、B2、B3；分别取1mL上述塔宾曲霉的分离方法的步骤S4获得活化后的菌液(使用血球计数板计数，控制1mL菌液中包含107个分生孢子)接种于A2、A3、B2、B3培养基中，在A1、B1培养基中加入1mL纯净水，将各组木质纤维素降解液体培养基置于恒温培养箱，30℃，200rpm培养30天，记录30天后A、B两组试验组中降解对象的含量差距以及测定降解对象中木质纤维素(包括纤维素、半纤维素、木质素和矿物质)含量变化。
含量变化测定方法：降解对象经浓硫酸水解后，分离得到不溶物为硫酸木质素，彻底水洗去除杂质后，利用称重法测定含量；用马弗炉5℃灰化后，剩下的组分即为矿物质灰分，称重；另称取5mg降解对象，在三氟乙酸中水解后，离心分离得到上清液和固体残渣，固体残渣用于苯酚-硫酸法测定纤维素含量，上清液用于气相色谱-质谱联用法测定半纤维素含量。
1.3、塔宾曲霉及其木质纤维分解复合菌剂对秸秆降解的影响：
建立三组试验组，第一组以水稻秸秆表皮颗粒为降解对象，第二组以水稻秸秆纤维颗粒为降解对象，第三组以番茄秸秆颗粒为降解对象，每组试验组设有无处理空白对照组、塔宾曲霉处理组、纤维素酶处理组以及木质纤维分解复合菌剂处理组，降解对象的粒径为0.3～0.5mm。
试验对象：(1)塔宾曲霉采用上述塔宾曲霉的分离方法的步骤S4获得活化后的菌液(使用血球计数板计数，控制1mL菌液中包含107个分生孢子)；(2)纤维素酶采用南宁东恒华道生物科技有限责任公司生产的商用纤维素酶；(3)木质纤维分解复合菌剂中塔宾曲霉、纤维素酶、山梨酸钠、KH2PO4、β-环糊精、MgSO4、纤维二糖质量比为1:1:0.8:0.5:3:0.5:0.8。
准确量取2g的水稻秸秆表皮颗粒4份，水稻秸秆纤维颗粒4份，番茄秸秆颗粒4份，分别加到12根到试管中，向各试管中加入蒸馏水100mL，121℃，灭菌20min，制成12组液体培养基，将12组液体培养基分别标记为A～L；其中，第一组试验组包含A～D液体培养基，第二组试验组包含E～H液体培养基，第三试验组包含I～L液体培养基，分别向A、E、I液体培养基中加入1mL纯净水，分别取1mL上述塔宾曲霉的分离方法的步骤S4获得活化后的菌液接种于B、F、J液体培养基中，分别向C、G、K液体培养基中加入2g纤维素酶，分别向D、H、I液体培养基中加入2g木质纤维分解复合菌剂；将各液体培养基置于恒温培养箱，30℃，200rpm培养3天，5000rpm离心10min，用扫描电子显微镜(SEM)获取降解处理后各组秸秆细胞壁组织结构的示意图。
2、研究塔宾曲霉对染料的脱色能力试验：
配置12组10mL的CDA液体培养基，分为序号a～f六组处理组，每组处理组中包含对照组(标记为序号1)和试验组(标记为序号2)；取苯胺蓝(Aniline blue)、靛蓝(Indigoblue)、活性蓝(Reactive blue)、橙黄(Orange G6)、考马斯亮蓝(Coomassie bright blue)和胭脂红(Carmine)六种染料，分别配置成母液后过0.22μm膜，分别将1mL的苯胺蓝、靛蓝、活性蓝、橙黄、考马斯亮蓝和胭脂红六种染料母液添加到a～f六组脱色组的PDA液体培养基中，PDA液体培养基中染料浓度为100mg/mL，分别取1mL上述塔宾曲霉的分离方法的步骤S4获得活化后的菌液接种于a～f六组的试验组，分别取1mL纯净水放入a～f六组的对照组，培养9天后观察a～f六组中试验组和对照组的染料脱色情况。
CDA液体培养基(Czapek Dox Agar)包含KH2PO4 1.0g、NaNO3 3.0g、NaCl 0.5g、MgSO4·7H2O：0.5g、FeSO4·7H2O：0.01g、蔗糖30.0g，pH(25℃)：7.3±0.2。
每隔2天取3mL a～f六组中试验组的CDA液体培养基，15000rpm离心5min，取上清用分光光度计测定吸光度。
脱色率计算公式：
脱色率(％)＝(A0-At)/A0×100
其中，A0代表对照组吸光度；At代表实验组在不同培养时间下的吸光度。
3、试验结果
3.1塔宾曲霉含量对木质素降解速率的影响试验结果如表1所示：
表1木质素降解实验结果
| 组分 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 最终质量 | 7.3 | 6.4 | 5.6 | 4.8 | 4.2 |
| 降解率 | 27％ | 36％ | 44％ | 56％ | 58％ |
由表1可以得到，塔宾曲霉可以降解木质素，且随着塔宾曲霉含量的增加，在单位时间内，木质素的降解效率也得到提升。
3.2塔宾曲霉对木质纤维素的降解影响试验结果如图8～图15所示：
通过图8、图11可以得到，30天降解培养后，添加了塔宾曲霉的A2、A3培养基中的水稻秸秆含量明显少于A1培养基中的水稻秸秆，添加了塔宾曲霉的B2、B3培养基中番茄秸秆的含量明显低于B1培养基中番茄秸秆的含量，证明塔宾曲霉对水稻秸秆以及番茄秸秆都具有很好的降解效果；通过图9～图10、图12-图15可以看出，通过塔宾曲霉处理后的秸秆其粒径以及粗细程度明显小于相比于未通过塔宾曲霉处理过的秸秆，且通过塔宾曲霉处理后的培养基中，半纤维素、纤维素以及木质素含量明显低于未通过塔宾曲霉处理过培养基，由此可以说明通过所述分离方法提取到的塔宾曲霉对秸秆具有较好的降解效果。
3.3塔宾曲霉及其木质纤维分解复合菌剂对秸秆降解的影响试验结果如图16所示：
从图16可以看出，未采用塔宾曲霉处理的A、E、I液体培养基中的秸秆纤维组织紧密，水稻秸秆表皮的表面纤维组织有囊状木质素保护，而用塔宾曲霉培养3天后的秸秆纤维表面结构组织有明显的松弛，且水稻秸秆表皮表面的纤维组织表面有囊状木质素明显减少，水稻秸秆纤维的纤维组织和番茄秸秆的纤维组织出现腐蚀，采用纤维素处理的秸秆，秸秆纤维的结构组织与采用塔宾曲霉处理的效果接近，采用含有塔宾曲霉木质纤维分解复合菌剂处理后，秸秆纤维的结构组织变得更加疏松，更易被酶解形成孔洞，且水稻秸秆比番茄秸秆更易降解。
从图16可以看出，处理后的秸秆中纤维素、半纤维素、木质素的含量都明显降低，秸秆细胞壁组织结构明显变的更为疏松。
3.4塔宾曲霉对染料的脱色能力试验结果如图17～图18所示：
除Orange G6脱色率为55.78％外，其他染料处理9天后脱色率接近为98％。其中，共培养液1天后靛蓝去除率最高，达95.44％，至9天时脱色率最高，达97.33％。胭脂红、考马斯亮蓝、苯胺蓝和活性蓝19在9天时的去除率分别为97.76％、98.29％、95.03％和98.34％。这些结果表明，该菌株除了能够降解秸秆生物质外，还可以应用于纺织废水中的染料和有毒的合成染料的脱色。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种塔宾曲霉的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：材料准备，将秸秆清洗干净并室温干燥至含水量6.5％～8.5％后，裁剪成长度0.3～1.5cm的秸秆粒；
步骤S2：培养，称取秸秆粒置于干净灭菌的玻璃培养皿中，加入浓度为0.5％～3％的灭菌蔗糖溶液，在黑暗中培养7～15天后转移至三角瓶中，然后置于35～40℃恒温培养箱，200～250rpm震荡培养0.5～3h得到悬液；
步骤S3：分离，将悬液进行离心，取上清，用ddH2O进行梯度稀释，在PDA培养基固体平板上涂布经过梯度稀释的悬液，黑暗中培养5～10天后，观察菌落形态，挑取呈球形或放射状、分生孢子红褐色或褐黑色、产孢结构为双层、表面密生顶囊的单菌落保存备用；
步骤S4：活化，将挑取后进行保存备用的单菌落接种于PDA液体培养基中，然后置于30～40℃恒温培养箱，120～250rpm培养8～20h，得菌液；
步骤S5：取2μl菌液点在ABTS显色固体培养基、苯胺蓝显色固体培养基中，在25～35℃培养3～5天，产生具有脱色圈的菌株；
步骤S6：分子鉴定，进行ITS序列鉴定，再使用NCBI对序列进行比对以得出鉴定结果。
2.如权利要求1所述的塔宾曲霉的分离方法，其特征在于，在所述步骤S1中，所述秸秆为水稻秸秆、小麦秸秆、番茄秸秆、麻类秸秆、青稞秸秆、花生秸秆、薯类秸秆中的至少一种，所述秸秆的初始含水量为6.8～9.2％。
3.如权利要求1所述的塔宾曲霉的分离方法，其特征在于，在所述步骤S2中，悬液中秸秆粒的浓度为0.1～0.3g/mL，培养温度为20～35℃。
4.如权利要求1所述的塔宾曲霉的分离方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述PDA培养基固体平板的配置：
步骤S3.1：称取200g去皮马铃薯切成小块，加水1000mL，加热至马铃薯煮烂，用纱布过滤掉滤渣，补水至1000mL，加热；
步骤S3.2：加入20g琼脂，继续加热搅拌，待琼脂溶解完后，加入20g葡萄糖、3gKH2PO4、1.5g MgSO4·7H2O、0.01g维生素B1搅拌均匀；
步骤S3.3：分装平板，以厚度0.003～0.010mm的PU塑料膜覆盖在培养基表面，180℃灭菌20min，室温凝固后备用。
5.如权利要求1所述的塔宾曲霉的分离方法，其特征在于，在所述步骤S4中，用3mm×3mm打孔器提取单菌并落接种于PDA液体培养基中，以血球计数器计数，稀释至分生孢子数为107～1010个/mL。
6.如权利要求1所述的塔宾曲霉的分离方法，其特征在于，在所述步骤S5中，所述ABTS显色固体培养基的制备：称取200g去皮马铃薯切成小块，加水1000mL，加热至马铃薯煮烂，用纱布过滤掉滤渣，补水至1000mL，加热；加入20g琼脂，继续加热搅拌，待琼脂溶解完后，加入10g葡萄糖、20g酵母粉、5g蛋白胨、5g NaCl搅拌均匀。121℃灭菌20min。倒平板前加入100μL0.5mmol/L的ABTS。
所述苯胺蓝显色固体培养基的制备：称取200g去皮马铃薯切成小块，加水1000mL，加热至马铃薯煮烂，用纱布过滤掉滤渣，补水至1000mL，加热；加入20g琼脂，继续加热搅拌，待琼脂溶解完后，加入10g葡萄糖、20g酵母粉、5g蛋白胨、5gNaCl搅拌均匀。121℃灭菌20min。倒平板前加入含量为0.01％的苯胺蓝燃料。
7.一种采用权利要求1-6任一项所述塔宾曲霉的分离方法得到的塔宾曲霉菌株。
8.如权利要求7所述一种塔宾曲霉在降解木质素方面以及染料的脱色的应用。
9.含有如权利要求8所述的塔宾曲霉的木质纤维分解复合菌剂。
10.含有如权利要求9所述的塔宾曲霉的木质纤维分解复合菌剂在秸秆降解中的应用。
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 刘震飞: "秸秆木质纤维素降解菌的筛选及发酵工艺优化的研究", 中国硕士论文电子期刊 * |
| 叶童童: "嘉兴地区秸秆降解菌的资源调查(I):部分霉菌的分类鉴定", 安徽农业科学 * |
| 蓝丽娜: "塔宾曲霉F12对类黑精及糖蜜酒精废水的脱色机理", 广西大学学报 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114854602A (zh) * | 2022-04-27 | 2022-08-05 | 江汉大学 | 一株塔宾曲霉Sys60及其在降解邻苯二甲酸酯类增塑剂中的应用 |
| CN114854602B (zh) * | 2022-04-27 | 2023-04-25 | 江汉大学 | 一株塔宾曲霉Sys60及其在降解邻苯二甲酸酯类增塑剂中的应用 |
| CN115404172A (zh) * | 2022-09-14 | 2022-11-29 | 广西科技大学 | 塔宾曲霉菌株Yw-4及其应用 |
| CN115404172B (zh) * | 2022-09-14 | 2024-03-05 | 广西科技大学 | 塔宾曲霉菌株Yw-4及其应用 |
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