CN113201460B

CN113201460B - 一株药用真菌一色齿毛菌及其应用

Info

Publication number: CN113201460B
Application number: CN202110308774.0A
Authority: CN
Inventors: 宋元达; 张子晨; 王秀文; 吴琛
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2021-03-23
Filing date: 2021-03-23
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2041-03-23
Also published as: CN113201460A

Abstract

本发明公开了一株药用真菌一色齿毛菌及其应用，属于药用真菌开发技术领域。本发明的一色齿毛菌为一色齿毛菌(Cerrna unicolor)SP02，保藏编号为CGMCC No.21073。本发明的菌株SP02适应性广，可用于多种富含木质纤维的植物材料类型，经过低能耗、低成本的固态发酵处理，能快速破坏其中的木质素、纤维素、半纤维素组分的交联，将一半以上的不溶组分降解，可溶物成倍增加，处理后的富含木质纤维的植物材料接近中性，体积减小，该菌具有食药用价值，发酵后剩余的富含木质纤维的植物材料具有高的生物安全性，可用于饲料及肥料，发酵过程还能产酶、多糖等高价值的代谢产物，也用于高价值代谢产物的提取。

Description

一株药用真菌一色齿毛菌及其应用

技术领域

本发明属于药用真菌开发技术领域，具体涉及一株药用真菌一色齿毛菌及其应用。

背景技术

由于产出的价值非常低，秸秆的利用一直是伴随农业历来已久的问题，不予及时处理会带来耕地占用、病虫害传播等问题，由于含热能较大，直接焚烧处理还带来雾霾等更多环境问题。

木质纤维素结构复杂，其利用一直是各国的资源利用难题，目前工业化的纤维素技术通常具有环境污染性、高能耗、生物安全性低，不能应用于食品、药品、化妆品等人体安全性要求较高的领域。

微生物发酵法是目前公认的最有潜力能同时达到低污染和低成本的一种生产策略。但木质纤维素很难被单一微生物所降解，能直接转化木质纤维素合成生物基产品或生物能源的微生物也较少，很多研究采用构建协同分解纤维素、半纤维素及木质素的复合菌系或菌种改造手段去降解木质纤维素。因此筛选到本身酶系全面，木质纤维素降解能力强的野生型菌种是必要条件。在此基础上才能进行合理的生物处理步骤设计，高效、清洁、低污染地将秸秆降解转化为微生物产品。

单一微生物处理木质纤维素的发酵过程更加稳定可控，但自然界极少有全能型的微生物可以快速适应并降解木质纤维素原料。未经过预处理的木质纤维素结构复杂致密，难以生物利用，由于目前工业预处理的技术限制，工业处理后的木质纤维素含有生物毒性的发酵抑制物，不能应用于食品、药品、化妆品等对生物安全性要求高的高价值产品领域。

白腐菌类能较安全的降解木质纤维素，一些白腐菌还可脱除木质纤维素工业加工过程产生的的部分呋喃类、酸类及酚类，但绝大部分野生型白腐菌自然生长速度极为缓慢，远达不到可工业应用的水平。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株药用真菌一色齿毛菌；本发明的目的之二在于提供该一色齿毛菌的生物制剂；本发明的目的之三在于提供一种富含木质纤维的植物材料的降解方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一株药用真菌一色齿毛菌，所述一色齿毛菌为一色齿毛菌(Cerrna unicolor)SP02，保藏编号为CGMCC No.21073。

上述一色齿毛菌SP02可用于制备降解富含木质纤维的植物材料的制剂。

生物制剂，包含保藏编号为CGMCC No.21073的一色齿毛菌菌悬液或全培养物。

上述的生物制剂在富含木质纤维的植物材料降解中的应用；具体是用于降解富含木质纤维的植物材料中的木质素、纤维素和半纤维素；所述富含木质纤维的植物材料可以为植物纤维性农业废弃物，包括但不限于玉米秸、水稻秸、小麦秸、花生壳、松树皮、栎树皮、葡萄籽等。

一种富含木质纤维的植物材料的降解方法是将保藏编号为CGMCC No.21073的一色齿毛菌种子液接种在由富含木质纤维的植物材料制备的固体发酵培养基上进行固体发酵培养。在一个具体的实施例中，所述种子液的接种量为1mL/g，种子液的生物量为5±0.5g/L；固体发酵的温度为28℃，固体发酵的时间为3-18d。

在一个具体的实施例中所述保藏编号为CGMCC No.21073的一色齿毛菌种子液由以下方法制备而成：

保藏编号为CGMCC No.21073的一色齿毛菌接种于PDA平板上28℃恒温暗培养4天，切取边缘菌丝直径为0.5cm的菌片，按5mL每片的接种量接种到种子培养基，28℃150r/min摇瓶暗培养6天；然后将培养后的菌丝球悬浮液打成均一的菌丝浆即为种子液。

本发明药用真菌一色齿毛菌还可用于纤维素酶和/或滤纸酶的生产。

本发明技术方案的优点

本发明的菌株SP02本身就是药用真菌，能产酶、多糖等高价值的代谢产物，有广泛的研究和应用价值。

本发明的菌株SP02适应性广，可用于多种富含木质纤维的植物材料类型，经过低能耗、低成本的固态发酵处理，能快速破坏富含木质纤维的植物材料中木质素、纤维素、半纤维素组分的交联，将一半以上的不溶组分降解，可溶物成倍增加，处理后的富含木质纤维的植物材料接近中性，体积减小，该菌具有食药用价值，发酵后剩余的富含木质纤维的植物材料具有高的生物安全性，可用于饲料及肥料，发酵过程还能产酶、多糖等高价值的代谢产物，也用于高价值代谢产物的提取。

附图说明

图1菌株SP02 ITS1/ITS4 PCR扩增结果；

图2菌株SP02的进化发育分析；

图3菌株SP02在7种木质纤维素(唯一碳源)培养基上的生长情况；

图4菌株SP02在秸秆上的固态发酵过程；

图5菌株SP02固态发酵过程基质pH的变化；

图6菌株SP02在固态发酵过程漆酶lac活性的变化；

图7菌株SP02在固态发酵过程锰过氧化酶mnp活性的变化；

图8菌株SP02在固态发酵过程木质素过氧化酶lip活性的变化；

图9菌株SP02在固态发酵过程纤维素酶CMCase活性的变化；

图10菌株SP02在固态发酵过程滤纸酶FPase活性的变化。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1菌株的分离纯化及鉴定

一色齿毛菌于2017年10月1日采集于山东临沂，采集的子实体用无菌水冲洗，再用75％的酒精清洗子实体表面，小心切取菌丝块，切去边缘取中心组织，转移到在PDA培养基上进行分离纯化。

形态学和生理生化特征鉴定：初生菌丝洁白柔软，子实体宽瓦状，无菌柄，子实体成熟后伞盖颜色呈黑褐色环状加深，质地坚硬，在PDA上气生菌丝发达，在液体震荡培养条件菌丝球呈较为光滑的圆球形，产木质素酶、纤维素酶及半纤维素酶等胞外酶，最适pH6，显微镜下观察菌丝有隔，可见锁状联合。

分子生物学鉴定：将分离纯化的菌株接种于PDA平板上活化并接种到PDB摇瓶振荡培养28℃150r/min，尼龙布过滤收集的菌丝体，用生理盐水冲洗并提取基因组，利用ITS两端的引物PCR扩增该菌株的ITS基因，并进行DNA测序，与GenBank中的已知序列进行同源性比对后，判定真菌种类，将该真菌划分到属或种。

其中，采用的扩增引物为：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(SEQ ID NO:1)；

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(SEQ ID NO:2)，

扩增电泳图如图1所示；双向测序拼接序列为：

SEQ ID NO:3

根据上述扩增获得的核酸序列，进行进化分析，结果如图2所示。

由图2可知，本发明的菌株SP02与Cerrna unicolor FCL139聚为一支；因而，结合形态学和生理生化特征将菌株SP02鉴定为一色齿毛菌(Cerrna unicolor)，将上述鉴定菌株一色齿毛菌(Cerrna unicolor)SP02，保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2020年11月30日，保藏编号CGMCC No.21073，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2菌株SP02在不同基质上的生长情况

分别以玉米秸、水稻秸、小麦秸、花生壳、松树皮、栎树皮、葡萄籽7种组分为基质，用于测定菌株SP02在不同基质上的生长情况；基质均制备成20目大小。分离的菌种SP02在PDA平板上进行活化，将5mm尖端菌丝的菌块的接种于以木质纤维素为单一碳源的培养基上测试在7种不同基质上的生长状况，木质纤维素培养基(g/L):基质30，NaNO₃ 3，KH₂PO₄ 0.8，K₂HPO₄ 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.5，酵母提取物2，琼脂20，pH 6，以3g/L葡萄糖碳源的培养基为对照。观察菌株SP02在不同基质上的生长情况结果如图3所示。

由图3可知，菌株SP02能快速适应绝大部分基质类型，在各种基质中，松树皮不是其适宜的基质，但依然能在该基质上快速生长。

实施例3菌株SP02在不同基质培养基上的固态发酵情况

分别采用玉米秸秆、水稻秸秆、小麦秸秆、松树皮四种不同的基质制备发酵培养基，用于测定菌株SP02在不同基质培养基上的固态发酵情况；其中，种子培养基含葡萄糖15g/L、NaNO₃ 3g/L、KH₂PO₄ 0.8g/L、K₂HPO₄ 0.2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、酵母提取物2g/L，pH6。

固态发酵培养基是由基质和液体培养基按照5g/20mL的比例制备而成，其中的液体培养基组成为：NaNO₃ 3g/L、KH₂PO₄ 0.8g/L、K₂HPO₄ 0.2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、酵母提取物2g/L。

将菌株SP02接种于PDA平板上28℃恒温暗培养4天，用0.5cm打孔器切取边缘菌丝菌片，按5mL每片的接种量接种到种子培养基装液量30mL/150mL的三角瓶，28℃150r/min摇瓶暗培养6天，然后将培养后的菌丝球悬浮液打成均一的菌丝浆作为种子液(生物量5±0.5g/L)，均匀接种5mL到含固体发酵培养基5g的250ml三角瓶。

在28℃恒温暗培养3、6、9、12、15、18d，取样进行酶活及组分分析。每瓶样30％用于酶活分析，70％用于组分分析(NREL法)。结果如表1和表2所示：

表1固态发酵过程基质组分的变化

由表1可知，由于菌株SP02对基质和组分利用的偏好性，不同基质中几种组分的消耗速率不同导致组成在不同发酵阶段有所变化，玉米秸秆和小麦秸秆整体利用率高，表现为随发酵时间增加可溶物质含量上升而其余组分下降，水稻秸秆表现为半纤维素及纤维素组分随时间下降，松树皮各组分比例几乎不变。

表2固态发酵过程基质组分的消耗比例及增长情况

由表2可知，菌种SP02在玉米秸秆表现为早期消耗纤维素及半纤维素较多，而后木质素消耗加快；小麦秸秆中对木质素及半纤维素的消耗率相比纤维素的消耗较快；水稻秸秆中倾向于消耗纤维素和半纤维素；松树皮利用差，几种组分的变化都极为缓慢。几种基质(除松皮)中消耗的组分都部分转化为可溶组分，但该菌种SP02依然能利用松皮这种微生物极难利用的木质纤维素(纤维素含量低木质素含量高，低pH，且含酚类等抑制物)，进行降解利用，该菌是筛选到的唯一能对该基质缓慢降解的真菌。

菌株SP02在秸秆上的固态发酵过程如图4所示，发酵三天时菌丝可布满整个培养基，气生较发达，菌丝稀疏，可见基质，9天后菌丝致密，逐渐形成一层硬质菌丝膜，基质被包裹几乎不可见，发酵12-18天，被菌丝膜包裹的基质颜色逐渐褪去，粗颗粒变小。

菌株SP02在固态发酵过程中pH，漆酶lac，锰过氧化酶mnp，lip木质素过氧化酶，纤维素酶CMCase，滤纸酶FPase的变化分别如图5-10所示。

由图5可知，几种大田秸秆初始PH具有高碱性(＞7.5)，松树皮初始PH较酸(4.5左右)，经过固态发酵过程秸秆基质pH基本被调节到在适中的范围内(5-6)，该范围PH也是该菌种的最适PH范围。

由图6-10可知，酶活表现说明玉米秸秆是菌株产木质素降解酶类好的基质，尤其是高应用价值的漆酶，在玉米秸秆上能长时间保持较高活力，说明该菌种应用于固态秸秆发酵这种成本、能耗极低的发酵方式不仅能快速降解秸秆类木质纤维素，还能产高价值的生物酶类。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 山东理工大学

<120> 一株药用真菌一色齿毛菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 627

<212> DNA

<213> 一色齿毛菌(Cerrna unicolor)

<400> 3

cctgcggaag gatcattaat gaattttatg gcagagttgt agctggcccc aatcgggtat 60

gtgcacactt tgttcattcc attctcatac acctctgtgc acttttcata ggtttagtta 120

tggatgaggc acttttatag tgtcttggaa gtgactatcc tatgtatttt acaaacgctt 180

cagttttaga atgtcattag cgtataacgc aataaataca actttcagca acggatctct 240

tggctctcgc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt 300

cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacct tgcgcccctt ggtattccga ggggcatgcc 360

tgtttgagtg tcatggtatt ctcaataccc taaatctttg cagatgaggg tgtattggat 420

ttggaggttt ttgcaggcaa tattcattgt cagctcctct taaatacatt agcagagata 480

ttactgctac tctccagtgt gataattgtc tacactgtta gtagtgcggt ataatcaaag 540

tctttgcttc taatcgtctt cggacaattc tttgacatct gacctcaaat caggtaggac 600

tacccgctga acttaagcat atcaata 627

Claims

1.一株药用真菌一色齿毛菌，其特征在于，所述一色齿毛菌为一色齿毛菌（Cerrena unicolor）SP02，保藏编号为CGMCC No. 21073。

2.权利要求1所述药用真菌一色齿毛菌在制备降解富含木质纤维的植物材料的制剂中的应用。

3.生物制剂，其特征在于，包含保藏编号为CGMCC No. 21073的一色齿毛菌。

4.权利要求3所述的生物制剂在富含木质纤维的植物材料降解中的应用。

5.一种富含木质纤维的植物材料的降解方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No.21073的一色齿毛菌种子液接种在由富含木质纤维的植物材料制备的固体发酵培养基上进行固体发酵培养。

6.根据权利要求5所述富含木质纤维的植物材料的降解方法，其特征在于，所述一色齿毛菌的种子液的生物量为5±0.5g/L，所述一色齿毛菌的种子液的接种量为1mL/g。

7.根据权利要求6所述富含木质纤维的植物材料的降解方法，其特征在于，所述保藏编号为CGMCC No. 21073的一色齿毛菌种子液由以下方法制备而成：

保藏编号为CGMCC No. 21073的一色齿毛菌接种于PDA平板上28 ℃恒温暗培养4天，切取边缘菌丝直径为0.5cm的菌片，按5mL每片的接种量接种到种子培养基，28℃ 150 r/min摇瓶暗培养6天；然后将培养后的菌丝球悬浮液打成均一的菌丝浆即为种子液。

8.根据权利要求5所述富含木质纤维的植物材料的降解方法，其特征在于，固体发酵的温度为28℃，固体发酵的时间为3-18d。

9.根据权利要求5-8任一项所述富含木质纤维的植物材料的降解方法，其特征在于，所述富含木质纤维的植物材料为植物纤维性农业废弃物。

10.权利要求1所述的药用真菌一色齿毛菌在纤维素酶和/或滤纸酶生产中的应用。

11.根据权利要求9所述富含木质纤维的植物材料的降解方法，其特征在于，所述富含木质纤维的植物材料为玉米秸、水稻秸、小麦秸、花生壳、松树皮、栎树皮、葡萄籽中的至少一种。