CN107325974A - 高植物细胞壁降解活性瘤胃真菌及其在饲料青贮中的应用 - Google Patents

高植物细胞壁降解活性瘤胃真菌及其在饲料青贮中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高植物细胞壁降解活性瘤胃真菌及其在饲料青贮中的应用，属于微生物及饲料加工技术领域。本发明采用亨盖特厌氧滚管技术从西农萨能奶山羊瘤胃中分离筛选具有细胞壁降解酶活性的厌氧真菌，最终筛选获得木聚糖酶和乙酰酯酶在较宽的温度和pH范围内均具有较高的活性，同时具有良好的热稳定性和酸碱稳定性的Piromyces sp.CN6，保藏号为CGMCC No.14449，该菌株能够改善青贮饲料的发酵品质，提高粗纤维的降解率，可以作为青贮添加剂应用于实际生产。

Description

高植物细胞壁降解活性瘤胃真菌及其在饲料青贮中的应用
技术领域
本发明属于微生物及饲料加工技术领域，具体涉及一株高植物细胞壁降解酶活性瘤胃真菌分离鉴定及其在青贮饲料中应用效果评价。
背景技术
农作物秸秆作为反刍动物重要的饲料原料，是我国极其丰富、可再生的木质纤维素生物质资源。我国每年农作物秸秆产量达8.4亿多吨，然而仅有22.6～27.5％的秸秆被用作饲料，超过3亿吨的秸秆未被利用，造成极大的浪费。农作物秸秆青贮和黄贮是我国奶畜养殖重要的优质粗饲料来源的两种有效方式。在青贮过程中添加产纤维素酶的真菌或纤维素酶，可破坏植物细胞壁，改善青贮的营养品质，降低秸秆中粗纤维含量，因而能够提高动物对饲草的利用率。微生物制剂和酶制剂作为生物性青贮添加剂是牧草营养学的重点领域。
然而，植物细胞壁多糖成分的复杂性、合成酶系的多样性和超分子结构的异质性成为生物质资源抵抗微生物和酶消化的主要原因。目前研发和应用于酶制剂生产的菌株存在不能产生降解植物细胞壁所需的全部酶类、产酶成本高和活性不稳定等问题。
自1975年Orpin首次从绵羊(Ovis aires)瘤胃内容物中分离出瘤胃厌氧真菌(Neocallimastigomycota)以来，国内外学者经过40多年的研究已证明厌氧真菌是反刍动物消化道中一类重要的降解植物细胞壁的功能菌，在植物细胞壁消化中起着重要的作用。已有研究表明，草食动物消化道真菌所产的植物细胞壁降解酶活性高于目前广泛应用的菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)和曲霉(Aspergillus nidulans)。Wei等(2016a，Anaerobe,39:158-164)发现纯培养瘤胃真菌能够降解秸秆产生大量乙醇和乙酸。稻草黄贮时添加纯培养瘤胃真菌能够降低黄贮饲料中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，提高黄贮饲料粗纤维的降解率(Lee et al.,2015，Journal of Applied Microbiology,118(3):565)。目前，已在牦牛(Bos grunniens)、肉牛(Bos taurus)等反刍动物瘤胃及粪便中筛选获得了产细胞壁降解酶瘤胃真菌(Zhu et al.,1997，Anaerobe,3(1):49-59；Gruninger et al.,2014，FEMS Microbiology Ecology,90(1):1-17；Wei et al.,2016b，Journal of AppliedMicrobiology,3(120):571-587)，但都未广泛应用于生产。因此，进一步开发和利用瘤胃厌氧真菌来提高植物饲料细胞壁中多糖的消化率成为研究热点。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明采用亨盖特厌氧滚管技术从西农萨能奶山羊瘤胃中分离筛选植物细胞壁降解酶活性的厌氧真菌，最终筛选获得的瘤胃厌氧真菌Piromyces sp.CN6具有较高的植物细胞壁降解酶活性，且木聚糖酶和乙酰酯酶在较宽的温度和pH范围内均具有较高的活性，同时具有良好的热稳定性和酸碱稳定性。通过玉米青贮验证表明，Piromyces sp.CN6能够改善青贮饲料的发酵品质，提高粗纤维的降解率，可以作为青贮添加剂应用于实际生产。
本发明的目的之一在于提供一株具有高植物细胞壁降解酶活性的厌氧真菌。
本发明的目的之二在于提供上述厌氧真菌的培养方法。
本发明的目的之三在于提供上述厌氧真菌的应用。
为实现上述发明目的，具体的，本发明涉及以下技术方案：
首先，本发明公开了一株具有细胞壁降解酶活性的厌氧真菌Piromyces sp.CN6，该菌株已于2017年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.14449。该菌株为单中心类型；丝状假根；游动孢子多为球形或椭圆形，孢子直径约为4-10μm；多为单鞭毛，偶见双鞭毛或多鞭毛，鞭毛长度约为10-30μm；成熟孢子囊为球形或椭圆形，孢子囊直径约为20-75μm；孢子梗较长，与假根相连。
该菌株培养5d的木聚糖酶、羧甲基纤维素酶和乙酰酯酶活性分别为1655.3mU、93.4mU和152.8mU。酶学特性表明，Piromyces sp.CN6分泌的木聚糖酶最适反应温度为50℃，最适pH为5.0，该酶在40℃和pH 5.0～8.0下较稳定；K+、Ca2+和Co2+对其有激活作用，Zn2 +、Cu2+、Mg2+、Fe2+和Mn2+抑制该酶活性。乙酰酯酶的最适反应温度为50℃，最适pH为9.0，该酶在40℃和pH 5.0～10.0下较稳定；Mg2+、K+、Ca2+对乙酰酯酶有激活作用，Zn2+、Fe2+、Co2+和Mn2 +抑制该酶活性。
其次，本发明公开了厌氧真菌Piromyces sp.CN6的培养方法，包括将Piromycessp.CN6在厌氧环境进行培养的步骤。
优选的，所述厌氧环境所用的培养基为：葡萄糖1.0g/L，酵母膏1.0g/L，蛋白胨1.0g/L，NaHCO37.0g/L，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g/L，盐溶液A 82.5mL/L，盐溶液B 16.5mL/L，0.1g/L刃天青溶液1.0mL/L。
盐溶液A：NaCl 6.0g，(NH4)2SO43.0g，KH2PO4 3.0g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·7H2O0.6g，蒸馏水定容至1000mL。盐溶液B：4g K2HPO4蒸馏水定容至1000mL。
液体培养基：在基础培养基中添加1％(w/v)的粉碎风干的小麦秸秆。
固体培养基：在基础培养基中添加15mg/mL的琼脂。
上述Piromyces sp.CN6的发酵培养物、菌体也是本发明的公开范围。
此外，本发明还公开了Piromyces sp.CN6的应用，所述应用包括在制备植物细胞壁降解酶中的应用，或者在农作物秸秆饲料制备中应用。
具体的，本发明公开了一种用于植物细胞壁降解的组合酶的制备方法，包括Piromyces sp.CN6进行发酵培养的步骤和对发酵液中酶进行纯化的步骤。
本发明还公开了一种农作物秸秆青贮饲料的制备方法，包括在青贮工程中添加Piromyces sp.CN6菌体或培养液的步骤。
优选的，添加Piromyces sp.CN6菌体105TFU/g或培养液中Piromyces sp.CN6真菌数量>106TFU ml-1。
优选的，青贮饲料的制备方法中在青贮之前还包括Piromyces sp.CN6进行发酵培养的步骤。
优选的，所述农作物秸秆为玉米秸秆。
基于此，本发明也公开了一种青贮微生态制剂，包括Piromyces sp.CN6菌体。
优选的，所述青贮微生态制剂还包括其他菌体，如植物乳杆菌等乳酸菌。
本发明取得了以下有益效果：
(1)本发明采用亨盖特厌氧滚管技术从西农萨能奶山羊瘤胃中分离获得12株具有细胞壁降解酶活性的厌氧真菌，通过形态学观察、核糖体内转录间隔区和28S rDNA D1/D2区基因序列分析确定其分类地位。测定12株真菌的植物细胞壁降解酶活性(木聚糖酶、羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、乙酰酯酶和β-葡聚糖酶)，并对活性最高菌株的木聚糖酶和乙酰酯酶进行酶学特性分析。结果表明，12株瘤胃厌氧真菌均为Piromyces属，分别命名为Piromyces sp.CN1-Piromyces sp.CN12。其中，Piromyces sp.CN6的木聚糖酶、羧甲基纤维素酶和乙酰酯酶活性分别为1655.3mU、93.4mU和152.8mU，显著高于其他菌株(P<0.05)，Piromyces sp.CN3的微晶纤维素酶活性最高，但与Piromyces sp.CN6差异不显著(P>0.05)，各菌株的β-葡聚糖酶活性差异不显著(P>0.05)，且木聚糖酶与羧甲基纤维素酶、乙酰酯酶存在极显著正相关(P<0.01)，与微晶纤维素酶呈显著正相关(P<0.05)。酶学特性表明，Piromyces sp.CN6的木聚糖酶最适反应温度为50℃，最适pH为5.0，该酶在40℃和pH5.0-8.0下较稳定；K+、Ca2+、Co2+对其有激活作用，Zn2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+和Mn2+抑制该酶活性。乙酰酯酶的最适反应温度为50℃，最适pH为9.0，该酶在40℃和pH 5.0-10.0下较稳定；Mg2+、K+、Ca2+对乙酰酯酶有激活作用，Zn2+、Fe2+、Co2+和Mn2+抑制该酶活性。本发明从奶山羊瘤胃内容物筛选获得的Piromyces sp.CN6具有较高的植物细胞壁降解酶活性，其中木聚糖酶和乙酰酯酶在较宽的温度和pH范围内均具有较高的活性，同时具有良好的热稳定性和酸碱稳定性。
(2)本发明采用单因素完全随机设计，每组设5个重复，以全株玉米为青贮原料，分别设为对照组、真菌组(105TFU/g)和复合酶组(0.033mg/g)，聚乙烯袋真空包装，室温下存储10d、30d、60d后开封取样。结果表明，真菌组和复合酶组青贮饲料达到1级优良，对照组达到2级较好，瘤胃真菌Piromyces sp.CN6作为青贮接种剂能够在青贮前期大量繁殖并附着在玉米茎叶表面。与对照组相比，真菌组和酶制剂组均可显著降低发酵30d青贮玉米pH、乙酸含量和NH3-N/TN(P<0.05)，显著降低发酵10d、30d、60d后青贮玉米NDF和ADF含量(P<0.05)，显著提高发酵30d青贮饲料干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维体外消化率(P<0.05)，显著提高发酵30d青贮玉米可溶性糖含量、粗蛋白含量、乳酸含量和乳酸/乙酸比值(P<0.05)。综上，瘤胃真菌Piromyces sp.CN6能够改善青贮饲料的发酵品质，提高粗纤维的降解率，可以作为青贮添加剂应用于实际生产。
附图说明
图1瘤胃厌氧真菌的扫描电镜图
图2瘤胃厌氧真菌的生长阶段
图3瘤胃厌氧真菌的ITS序列进化树
图4瘤胃厌氧真菌的28S rDNA D1/D2序列进化树
图5木聚糖酶和乙酰酯酶的最适温度
图6木聚糖酶和乙酰酯酶的温度稳定性
图7木聚糖酶和乙酰酯酶的最适pH
图8木聚糖酶和乙酰酯酶的pH稳定性
图9金属离子对木聚糖酶和乙酰酯酶的影响
图10青贮玉米扫描电镜图
图11不同处理对青贮玉米NDF和ADF的影响
具体实施方式
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本文中，青贮是将收割的鲜(青)秸秆粉碎后直接窖贮、装袋或打捆包裹贮藏的一种技术。青贮料经压实密封，在适宜的湿度条件下，自身所含有的或添加的微生物厌氧发酵，使贮料内部的pH降到4.5左右。此时，大部分微生物都会停止繁殖，最后乳酸菌也被自身产生的乳酸所控制而停止生长，从而达到青贮的目的。由于青贮要求秸秆含水率在60％～70％以上，含水率过低时便不能作业，因此受到时间上的限制。
本文中，黄贮是利用己变干(黄)秸秆做原料，经机械揉搓粉碎后，加适量水和生物菌剂，压捆以后再装袋贮存的一种技术。黄贮加入的高效复合菌剂，在适宜的厌氧环境下，将大量的纤维素、半纤维素，甚至一些木质素分解，并转化为糖类。糖类经有机酸发酵转化为乳酸、乙酸和丙酸，并抑制丁酸菌和霉菌等有害菌的繁殖，最后达到与青贮同样的贮存效果。
诚如背景技术中所述，为进一步开发和利用瘤胃厌氧真菌来提高植物饲料细胞壁中多糖的消化率，本发明公开了一株具有细胞壁降解酶活性的厌氧真菌Piromycessp.CN6，该菌株已于2017年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.14449。
本发明所述厌氧真菌可以产生一个多组分的纤维素酶系，主要包括内切-β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase)、外切-β-1,4-葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase)和β-1,4-葡萄糖苷酶(β-1,4-cellobiase)，它们通过协同作用快速降解微晶纤维素。其中，内切葡聚糖酶作用于纤维素多糖链上的非结晶区，通过随机地切断糖苷键，使纤维多糖长链变短，产生新的糖链末端或长短不一的纤维寡糖。外切纤维素酶作用于纤维素糖链的还原端或非还原端，以渐进的方式切割，释放出纤维二糖或葡萄糖。β-葡聚糖酶能够快速地水解可溶性的纤维糊精或纤维二糖生成葡萄糖。
本发明厌氧真菌产生的半纤维素酶主要为木聚糖酶，包括木二糖酶、β-木聚糖酶和β-木糖苷酶。以随机切割的方式，将木聚糖水解成木糖分子，从而有效地消除木聚糖的抗营养作用。另外，木聚糖酶和乙酰酯酶可以通过协同作用加速植物细胞壁中乙酰基团的释放和木聚糖的降解，提高饲料细胞壁的降解效率。
此外，本发明厌氧真菌还能够分泌乙酰酯酶、p-香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶等酯酶和果胶酶。酯酶能够打开细胞壁中酚酸和半纤维素形成的酯键，使半纤维素从木质素和纤维素的复合体中释放出来。果胶酶能够降解植物细胞壁果胶成分，释放出的细胞壁其他成分又可以为其他降解酶的酶解提供反应底物，在植物细胞壁降解的初始阶段具有非常重要的意义。瘤胃厌氧真菌产生的阿魏酸酯酶和乙酰酯酶活性要比瘤胃细菌高数倍，是反刍动物降解细胞壁酚酸类物质的关键酶。
该菌株培养5d的木聚糖酶、羧甲基纤维素酶和乙酰酯酶活性分别为1655.3mU、93.4mU和152.8mU；木聚糖酶与羧甲基纤维素酶、乙酰酯酶存在极显著正相关(P<0.01)，与微晶纤维素酶呈显著正相关(P<0.05)；酶学特性表明，Piromyces sp.CN6分泌的木聚糖酶最适反应温度为50℃，最适pH为5.0，该酶在40℃和pH 5.0～8.0下较稳定；K+、Ca2+和Co2+对其有激活作用，Zn2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+和Mn2+抑制该酶活性。乙酰酯酶的最适反应温度为50℃，最适pH为9.0，该酶在40℃和pH 5.0～10.0下较稳定；Mg2+、K+、Ca2+对乙酰酯酶有激活作用，Zn2+、Fe2+、Co2+和Mn2+抑制该酶活性。
本发明的另一实施方案中公开了厌氧真菌Piromyces sp.CN6的培养方法，包括将Piromyces sp.CN6在厌氧环境进行培养的步骤。
所述厌氧环境所用的培养基为：葡萄糖1.0g/L，酵母膏1.0g/L，蛋白胨1.0g/L，NaHCO37.0g/L，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g/L，盐溶液A 82.5mL/L，盐溶液B 16.5mL/L，0.1g/L刃天青溶液1.0mL/L。
盐溶液A：NaCl 6.0g，(NH4)2SO43.0g，KH2PO4 3.0g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·7H2O0.6g，蒸馏水定容至1000mL。盐溶液B：4g K2HPO4蒸馏水定容至1000mL。
液体培养基：在基础培养基中添加1％(w/v)的粉碎风干的小麦秸秆。
固体培养基：在基础培养基中添加15mg/mL的琼脂。
上述Piromyces sp.CN6的发酵培养物、菌体也是本发明的公开范围。
此外，本发明的实施方案中公开了一种用于植物细胞壁降解的组合酶的制备方法，包括括Piromyces sp.CN6进行发酵培养的步骤和对发酵液中酶进行纯化的步骤。
本发明还公开了一种农作物秸秆青贮饲料的制备方法，包括在青贮工程中添加Piromyces sp.CN6菌体或培养液的步骤。
优选的实施例中，添加Piromyces sp.CN6菌体105TFU/g或培养液中真菌数量>106TFU ml-1。
优选的实施例中，青贮饲料的制备方法中在青贮之前还包括Piromyces sp.CN6进行发酵培养的步骤。
优选的实施例中，所述农作物秸秆为玉米秸秆。
以下通过具体实施例来阐述本发明。
实施例1高植物细胞壁降解酶活性瘤胃真菌分离鉴定及酶学特性分析
1.1材料及方法
菌株来源：瘤胃内容物取自西北农林科技大学畜牧教学基地3头装有永久性瘤胃瘘管且体况良好的西农萨能奶山羊，试验动物分别在08﹕30和17﹕30各饲喂一次，日粮精粗比为3﹕7，自由饮水，饲粮组成及营养水平见表1。瘤胃内容物的采集操作：奶山羊晨饲后2h，瘤胃内容物通过负压装置从瘘管中采集，装入已灭菌并充满CO2的厌氧瓶中，将厌氧瓶放入39℃保温瓶中，迅速带回实验室，进行瘤胃厌氧真菌的分离培养。
表1 日粮组成及营养水平(干物质基础)
每千克预混料含有:石粉476.0g，FeSO4·7H2O 25.38g，CuSO4·5H2O 13.45g，MnSO4·H2O 12.56g，ZnSO4·7H2O 40.20g，CoCl2·6H2O 83mg，Na2SeO3 45mg，KI 66mg，VA 3×106IU，VD3 7.8×105IU，VE 3×103IU。2营养水平为实际测量值。
基础培养基：葡萄糖1.0g/L，酵母膏1.0g/L，蛋白胨1.0g/L，NaHCO37.0g/L，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g/L，盐溶液A 82.5mL/L，盐溶液B 16.5mL/L，0.1g/L刃天青溶液1.0mL/L，瘤胃液12 000rpm离心20min后收集的上清170.0mL/L。
盐溶液A：NaCl 6.0g，(NH4)2SO43.0g，KH2PO4 3.0g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·7H2O0.6g，蒸馏水定容至1000mL。盐溶液B：4g K2HPO4蒸馏水定容至1000mL。
液体培养基：在基础培养基中添加1％(w/v)的粉碎风干的小麦秸秆。
固体培养基：在基础培养基中添加15mg/mL的琼脂。
培养基分装到亨盖特厌氧管中(9mL/管)，厌氧管通过针头接入带有真空泵和高纯CO2的抽气装置进行除氧。培养基除氧后于121℃高温高压湿热灭菌20min备用。
复合抗生素：医用硫酸链霉素1g(100万单位)与医用青霉素钠0.48g(80万单位)溶解于5mL液体培养基中。氯霉素溶液：100mg氯霉素溶解于5mL乙醇(以无菌水为溶质，浓度50％(v/v)的乙醇)。厌氧真菌传代时每次添加100uL复合抗生素和25uL氯霉素溶液到10mL培养体系，使其在培养基中的终浓度分别达到2000IU/mL、1600IU/mL和50μg/mL。
瘤胃厌氧真菌的分离纯化：采用亨盖特厌氧滚管技术进行厌氧真菌的分离纯化，采集的瘤胃内容物充分混合后，用无菌注射器取1mL接种到39℃预热的液体培养基中，39℃培养3-4d。取1mL菌液接种于煮沸融化后置于45℃水浴的固体培养基，冰上滚管至培养基凝固并均匀分布于管壁，39℃培养3-4d。选择菌落密度适中的培养管在荧光显微镜下观察厌氧真菌菌落形态，并根据甲烷菌自身荧光特点，选择没有甲烷菌共生的单菌落，在厌氧条件下挑取菌落至新鲜的39℃预热的液体培养基中。同时，整个分离纯化过程用气相色谱仪检测是否有甲烷产生。重复上述过程，直到镜检厌氧管中所有菌体形态一致，且检测不到甲烷，在荧光显微镜下观察不到甲烷菌，即获得了瘤胃厌氧真菌单菌株。
菌株的鉴定
(1)菌落及菌体形态特征观察：用倒置显微镜观察培养2-3d固体培养基表面的厌氧真菌菌落形态。取50uL培养3-5d的培养液置于载玻片上，在普通光学显微镜下观察厌氧真菌游动孢子、孢子囊及营养体形态。参照Rezaeian等(2004，Mycological Research.108(10):1215-1226)方法处理培养3-5d培养基中的麦秸，用扫描电镜观察麦秸上定植的厌氧真菌菌体形态、孢子梗、孢子囊、菌丝体和假根等。根据厌氧真菌的形态学特征对其做出种属鉴定。
(2)系统进化树发育分析：液氮研磨菌体后，采用CTAB法提取厌氧真菌基因组DNA，进行核糖体内转录间隔区(ITS)序列和28S rDNA D1/D2区基因序列扩增。真菌ITS特异性引物如下：JB206:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(SEQ ID NO:1)和JB205:5’-TCCTCCGCTTATTAATATGC-3’(SEQ ID NO:2)。扩增体系：10×PCR buffer 5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，dNTPs 1μL，上下游引物(100ng/μl)各1μL，模版DNA 1μL，ddH2O补足体积至50μL。PCR反应条件：95℃，5min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，1min；35个循环；72℃，6min。采用引物NL1(5’-GCATATCAATAAGC GGAGGAAAAG-3’SEQ ID NO:3)和NL4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’SEQ ID NO:4)扩增菌株的28S rDNA D1/D2区基因序列。进行PCR产物的T载体连接和转化，挑选阳性克隆由华大基因公司测序。
植物细胞壁降解酶活性测定
粗酶液的制备：将培养5d的菌液1000×g离心10min,取上清液测定酶活。
将适当稀释的粗酶液、10g/L底物和50mM PBS缓冲液(pH＝7.0)置于39℃预热15min，然后向75μL粗酶液中加入75μL缓冲液和50μL底物，39℃反应一定时间后加入300μLDNS溶液终止反应。沸水浴5min后，冷却至室温。取200μL于干净的96孔酶标板上，用多功能酶标仪在540nm下检测吸光度。木聚糖酶的底物为木聚糖、反应时间为15min，根据木糖的标准曲线计算木聚糖酶活性。羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶和β-葡聚糖酶的底物分别为羧甲基纤维素、微晶纤维素和β-葡聚糖，反应时间为30min，根据葡萄糖的标准曲线计算酶活性。
乙酰酯酶活性测定：将适当稀释的粗酶液、2mM p-硝基苯乙酯和50mM PBS缓冲液(pH＝7.0)置于39℃预热15min，然后向50μL粗酶液中加入100μL缓冲液和50μL底物，39℃反应30min后，用多功能酶标仪在415nm下检测吸光度，根据p-硝基苯的标准曲线计算乙酰酯酶活性。
1个酶活力单位(U)是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物中释放1μmol葡萄糖所需的酶量。
酶学特性分析
最适反应温度：按照木聚糖酶和乙酰酯酶活力测定方法，分别测定反应温度为20，30，40，50，60和70℃时的酶活力。以温度为横坐标，以相对酶活(活力最高定为100％)为纵坐标，比较不同温度对酶活的影响。
温度稳定性：将粗酶液在40℃和50℃保温1、3、5、7、9、11和24h后，最佳反应温度下测定木聚糖酶和乙酰酯酶活性。以最适反应温度下未保温处理的粗酶液所测得酶活为100％，分析木聚糖酶和乙酰酯酶的温度稳定性。
最适作用pH:按照木聚糖酶和乙酰酯酶活力测定方法，分别测定pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0下的酶活力。以相对值表示各pH下的酶活。
pH稳定性：将粗酶液用pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的缓冲液适度稀释，预保温1h，最适温度下测定木聚糖酶和乙酰酯酶活性。以相同pH配制未保温酶液处理的酶活为100％计算相对活力，分析酶的pH稳定性。
金属离子对酶活性影响：取4.0mmol/L MgSO4、FeSO4、ZnCl2、CuCl2、CoCl2、CaCl2、MnCl2、KCl等储液与等体积的粗酶液混合，39℃保温30min后，测定木聚糖酶和乙酰酯酶活性。
1.2试验结果
菌株形态特征观察：经过反复多次的分离纯化，从西农萨能奶山羊瘤胃中分离得到12株厌氧真菌，分别编号为CN1-CN12。显微镜和扫描电镜观察(图1，图2)发现CN1-CN12均为单中心类型；丝状假根；游动孢子多为球形或椭圆形，孢子直径约为4-10μm；多为单鞭毛，偶见双鞭毛或多鞭毛，鞭毛长度约为10-30μm；成熟孢子囊为球形或椭圆形，孢子囊直径约为20-75μm；孢子梗较长，与假根相连。
菌株系统发育学分析：测序结果显示扩增得到的ITS和28S rDNA D1/D2基因片段均为700bp左右。将菌株CN1-CN12的ITS基因序列和28S rDNA D1/D2区基因序列与GenBank数据库进行同源性比较，结果显示12株真菌的ITS序列与Piromyces sp.E GRL-6(JF974104)相似度最高，达98％，12株真菌的28S rDNA基因序列与Piromyces sp.10GFM-3(JF974127)相似度最高，达99％。采用MEGA 6.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)对目的菌株进行系统发育树分析，确定菌株的进化地位。结果(图3，图4)显示：菌株CN1-CN12均可与Piromyces属真菌聚于同一分支。结合扫描电镜和显微镜观察结果可以确定菌株CN1-CN12均为Piromyces属。
高植物细胞壁降解酶活性菌株筛选：由表2可知，12株厌氧真菌的木聚糖酶、羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、乙酰酯酶和β-葡聚糖酶活力分别为462.5-1655.3、20.0-93.4、29.2-54.5、94.1-152.8、57.3-68.5mU。菌株Piromyces sp.CN6的木聚糖酶(1655.3mU)、羧甲基纤维素酶(93.4mU)和乙酰酯酶(152.8mU)均显著高于其他菌株(P<0.05)。菌株Piromyces sp.CN3产生的微晶纤维素酶活性最高，但与菌株Piromyces sp.CN6差异不显著(P>0.05)。12株菌株产生的β-葡聚糖酶活性差异不显著(P>0.05)。确定菌株Piromycessp.CN6的细胞壁降解酶活性最高，对其分泌的木聚糖酶和乙酰酯酶进行酶学特性分析。
植物细胞壁降解酶活性的相关分析：对12株厌氧真菌的5种降解酶活性进行相关分析，由表3可知，木聚糖酶、羧甲基纤维素酶和乙酰酯酶相互间均存在极显著正相关(r>0.555，P<0.01)，同时木聚糖酶、羧甲基纤维素酶与微晶纤维素酶呈显著正相关(r>0.367，P<0.05)。木聚糖酶、羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、乙酰酯酶与β-葡聚糖酶无显著相关性(r<0.119，P>0.05)。
酶学特性分析
木聚糖酶和乙酰酯酶的最适温度及温度稳定性：由图5可知，随着温度的升高，菌株Piromyces sp.CN6的木聚糖酶和乙酰酯酶活性逐渐升高，当温度达到50℃时，木聚糖酶和乙酰酯酶活性均达到最高；超过50℃以后，木聚糖酶活性迅速降低，乙酰酯酶活性缓慢降低。木聚糖酶和乙酰酯酶均具有较强的温度适应性，乙酰酯酶的温度适应性更强。
热稳定性结果(图6)表明，木聚糖酶和乙酰酯酶在40℃以下时相对稳定，40℃处理11h小时后木聚糖酶残余活性为71％，乙酰酯酶残余活性为65％；50℃保温时，酶活力随时间的延长而逐渐丧失，5h后木聚糖酶残余酶活力为34％，乙酰酯酶残余酶活力为44％。木聚糖酶和乙酰酯酶具有较好的热稳定性。
木聚糖酶和乙酰酯酶的最适pH及pH稳定性：由图7可知，木聚糖酶的最适pH为5.0，偏酸性。pH在3.0-5.0时，木聚糖酶的活力逐渐增加，当pH在4.0-7.0的范围内，酶活力维持在82％以上，表现出较强的活力；pH在5.0-10.0时，酶活力逐渐降低，当pH>9.0时相对酶活力低于40％。由此可知，木聚糖酶为酸性酶，在pH 4.0-7.0能更好的发挥作用。
乙酰酯酶的相对活力在pH为9.0时最高，在pH<5.0的酸性环境中，酶活力几乎为0。pH在5.0-6.0时，酶活力缓慢增加，pH在6.0-9.0时，酶活力快速增加至最大，该酶的最适pH为9.0，pH达到10.0时，酶活力仅有略微降低，仍达到90％左右。乙酰酯酶为碱性酶，在pH8.0-10.0能更好的发挥作用。
pH稳定性表明(图8)，木聚糖酶和乙酰酯酶在pH 5.0-9.0范围内保温1h后残余酶活在76％以上，活性较稳定，特别是pH为10.0时，乙酰酯酶活性仍有81％。说明菌株Piromyces sp.CN6分泌的木聚糖酶在pH 5.0-8.0范围内较稳定，乙酰酯酶在pH 5.0-10.0范围内较稳定。
金属离子对菌株CN6木聚糖酶和乙酰酯酶的影响：由图9可知，K+、Ca2+、Co2+对木聚糖酶有激活作用，Cu2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+和Mn2+抑制该酶活性。Ca2+、Mg2+、K+对乙酰酯酶有激活作用，Fe2+、Co2+、Zn2+和Mn2+抑制该酶活性。
表2 瘤胃真菌分离株纤维素降解酶活性
同列无字母或肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，同列肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。数值表示为平均值±标准差，下同。
表3 各菌株培养液中5种酶活性的相关系数
*：相关系数达到显著水平(P<0.05)，**：相关系数达到极显著水平(P<0.01)，未标注的表明差异不显著(P>0.05)。
实施例2Piromyces sp.CN6对全株玉米青贮发酵品质、营养成分及体外消化率的影响
2.1材料与方法
青贮原料：西北农林科技大学畜牧教学基地栽培的全株玉米(中原单32)，乳熟期刈割，含水量在64％左右，揉碎至1-3cm。全株玉米的组成成分如表4所示。
表4 全株玉米的营养成分
复合酶制剂：日本Snow Brand Seed公司生产的青贮专用添加剂，固体剂型，含纤维素酶和木聚糖酶，活力分别为90FPU/g及6000IU/g。
真菌接种剂：菌株Piromyces sp.CN6为实验室前期从西农莎能奶山羊分离获得的高植物细胞壁降解酶活性瘤胃厌氧真菌，菌液为接种菌株5d后的培养液，真菌数量>106TFUml-1。
试验采用单因子完全随机设计，分别设置对照组(CK)、真菌组(FU)和酶制剂组(EN)。每个处理5个重复，每个重复1kg切短全株玉米。对照组均匀喷洒100mL的蒸馏水，真菌组均匀喷洒100mL厌氧真菌培养液，酶制剂组均匀喷洒100mL含33mg复合酶制剂的蒸馏水，青贮调制在厌氧工作站中完成。将处理后的玉米秸秆迅速装入聚乙烯真空包装袋中压实并用真空包装机真空封口，室温条件下(25～32℃)储藏，发酵10d、30d、60d后开封，去除表层青贮饲料，充分混均后取样，立即于-80℃保存，待测。
样品采集与指标测定
感官评定：全株玉米青贮30d后开封，弃掉表层的青贮样品，按照德国农业协会感官青贮评分标准及等级评定方法从色泽、气味和结构等方面对青贮玉米进行综合评定。发酵品质：称取10g青贮样品放入100mL锥形瓶，加入90mL蒸馏水，充分混均后用封口膜封口，在4℃下静置24h，再分别通过4层纱布和定性滤纸过滤，获得青贮玉米浸提液，用于pH、氨态氮(NH3-N)和有机酸的测定。使用日立L-2000型高效液相色谱仪测定浸提液中的乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。氨态氮含量的测定采用苯酚-次氯酸比色法。
营养成分评价：进行青贮饲料的采集，采用常规法测定样品的干物质(DM)含量、粗蛋白(CP)含量、可溶性碳水化合物(WSC)含量、粗脂肪(EE)含量、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量。进行干物质回收率(DMR)的测定。
扫描电子显微镜观察：参照Rezaeian等(2004，Mycological Research.108(10):1215-1226)方法处理真菌组青贮30d的玉米茎叶，用扫描电镜观察叶片表面损坏及真菌附着情况。
青贮玉米饲料的体外发酵：参照Adesogan等(2005，Animal Feed Science andTechnology.119(3):333-344)文章中描述方法，略加改进后应用体外模拟培养液测定发酵30d青贮玉米干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维48h体外消化率。具体方法为：预先用丙酮洗涤ANKOM F57滤袋3-5min并完全干燥，称量每个滤袋并记录重量，去皮后直接在滤袋中称量0.5g左右风干青贮饲料样品。滤袋封口后放置于39℃预热的Daisy Ⅱ Incubator培养箱消化罐中，每个罐放置23个含样品滤袋和2个空白滤袋，平衡分布在消化罐分隔板的两侧。迅速向消化罐分别加入39℃预热的瘤胃缓冲液1600mL和四层纱布过滤后的瘤胃液400mL。立即将消化罐放置于培养箱中，打开加热和转动开关。培养48h小时后取出消化罐倒出液体，用冷水冲洗滤袋直至干净为止。
2.2试验结果
青贮玉米的感官评定：对发酵30d的青贮饲料进行感官评定，分析得出(表5)真菌组和酶制剂组为1级优良，表现为茎叶结构保持良好，色泽呈淡黄色，有明显的芳香味。对照组为2级较好，表现为茎叶结构保持较好，色泽呈淡黄色，芳香味不如添加剂组强。
表5 青贮玉米的感官评定(n＝5)
扫描电子显微镜观察结果：由图10可知，发酵30d青贮玉米茎叶表明附着大量瘤胃厌氧真菌，同时青贮玉米茎叶表面结构破坏严重。由此可知，瘤胃厌氧真菌能够在全株玉米青贮前期大量繁殖并且成功附着在茎叶表面。
不同处理对青贮30d发酵品质的影响：由表6可知，发酵第10d，酶制剂组pH显著低于对照组和真菌组pH(P<0.05)，真菌组pH和对照组差异不显著(P>0.05)。发酵第30d，真菌组和酶制剂组pH均显著低于对照组pH(P<0.05)。发酵第60d，不同处理对青贮玉米的pH无显著性影响(P>0.05)。发酵第30d和60d，各组pH显著低于第10d(P<0.05)，但第30d和60d之间的差异均不显著(P>0.05)。
表6 不同处理对青贮玉米pH的影响
ab：同行无字母或肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，同行肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。xy：同列肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。
由表7可知，发酵第30d，与对照组相比，真菌接种剂和复合酶制剂可显著降低青贮饲料乙酸含量和NH3-N/TN(P<0.05)，显著提高青贮玉米的乳酸含量、乳酸/乙酸比值(P<0.05)。三个处理组均未检测出丁酸，说明青贮发酵以乳酸发酵为主。
表7 不同处理对青贮30d发酵品质的影响
不同处理对青贮玉米NDF和ADF含量的影响：由图11可知，与对照组相比，真菌接种剂和复合酶制剂可显著降低发酵10d、30d、60d青贮玉米的NDF和ADF含量(P<0.05)。
不同处理对青贮30d玉米营养物质和干物质回收率的影响：由表8可知，与对照组相比，真菌接种剂和复合酶制剂均可显著降低发酵30d青贮饲料的NDF和ADF含量(P<0.05)，显著提高青贮饲料WSC和CP含量(P<0.05)。不同处理对发酵30d青贮饲料的DM和EE含量无显著影响(P>0.05)。不同处理对发酵30d青贮饲料干物质回收率(DMR)无显著性影响(P>0.05)。
表8 不同处理对青贮30d玉米营养物质的影响
不同处理对青贮玉米体外消化率的影响：由表9可知，与对照组相比，真菌接种剂和复合酶制剂可显著降低发酵30d青贮饲料DM、NDF和ADF体外消化率(P<0.05)。
表9 不同处理对青贮玉米体外消化率的影响
本发明中，全株玉米经30d青贮后，真菌组青贮饲料NDF和ADF含量分别降低9.59％、8.67％，酶制剂组青贮饲料NDF和ADF含量分别降低8.98％、6.86％。与酶制剂组相比，真菌组青贮饲料的NDF和ADF含量分别降低1.55％、1.94％。另外，本发明中瘤胃厌氧真菌还能够提高青贮饲料IVDMD、IVNDFD和IVADFD。同样，相比酶制剂组，真菌组青贮饲料干物质、NDF和ADF的体外消化率分别提高3.44％、5.13％和6.15％。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110>西北农林科技大学
<120>高植物细胞壁降解活性瘤胃真菌及其在饲料青贮中的应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213>引物JB206
<400> 1
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>引物JB205
<400> 2
tcctccgctt attaatatgc 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213>引物NL1
<400> 3
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213>引物NL4
<400> 4
ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims (10)

1.一株具有植物细胞壁降解酶活性的厌氧真菌Piromyces sp.CN6，该菌株已于2017年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14449。
2.权利要求1所述厌氧真菌Piromyces sp.CN6的培养方法，包括将Piromyces sp.CN6在厌氧环境进行培养的步骤。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述厌氧环境所用的培养基为：葡萄糖1.0g/L，酵母膏1.0g/L，蛋白胨1.0g/L，NaHCO37.0g/L，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g/L，盐溶液A 82.5mL/L，盐溶液B 16.5mL/L，0.1g/L刃天青溶液1.0mL/L；
盐溶液A：NaCl 6.0g，(NH4)2SO43.0g，KH2PO4 3.0g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·7H2O0.6g，蒸馏水定容至1000mL；
盐溶液B：4g K2HPO4蒸馏水定容至1000mL；
液体培养基：在基础培养基中添加1％的粉碎风干的小麦秸秆；
固体培养基：在基础培养基中添加15mg/mL的琼脂。
4.权利要求1所述Piromyces sp.CN6的发酵培养物、菌体制剂。
5.一种用于植物细胞壁降解的组合酶的制备方法，包括权利要求1所述Piromycessp.CN6进行发酵培养的步骤和对发酵液中酶进行纯化的步骤。
6.一种农作物秸秆青贮饲料的制备方法，其特征在于，包括在青贮工程中添加权利要求1所述Piromyces sp.CN6菌体或培养液的步骤。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，添加Piromyces sp.CN6菌体105TFU/g或培养液中Piromyces sp.CN6真菌数量>106TFU ml-1。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在青贮之前还包括Piromyces sp.CN6进行发酵培养的步骤。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述农作物秸秆为玉米秸秆。
10.一种青贮微生态制剂，其特征在于，包括权利要求1所述Piromyces sp.CN6菌体；
优选的，所述青贮微生态制剂还包括青贮用微生物，如植物乳杆菌。
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