CN112553089A - 筛选有效降解木质纤维素的厌氧真菌的简易培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域,具体涉及筛选有效降解木质纤维素的厌氧真菌的简易培养基。所述的1L培养基包括以下原料:酵母膏,蛋白胨,葡萄糖,秸秆,盐溶液I,盐溶液II,NaHCO3,刃天青,L‑半胱氨酸盐酸盐和瘤胃液中的几种,所述的培养基不需要瘤胃液、盐溶液和NaHCO3被减量,氮源简化为一种,不添加葡萄糖,只添加秸秆作为唯一碳源,有利于通过此配方简易的培养基筛选出有效降解木质纤维素的厌氧真菌,同时,本发明所述的培养基配方简单,成本较低,方便易行,能够有效筛选出降解木质纤维素的厌氧真菌,在实际生产中更具有应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域,具体涉及筛选有效降解木质纤维素的厌氧真菌的简易培养基。
背景技术
微生物培养基是人工合成供微生物等生长的人工配制的营养物质。微生物培养基一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。不同营养类型的微生物需要采用不同的培养基。有的培养基还含有抗生素和色素,用于单种微生物培养和鉴定。培养基由于配制的原料不同,使用要求不同,贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后,易被细菌污染或分解变质,因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基(如组织培养基),较长时间的贮存,必须放在2-6℃的冰箱内。
常见的丝状真菌培养基包括:
(1)萨氏培养基
该培养基的组份包括蛋白胨10g;琼脂20g;麦芽糖40g;水1000mL;该培养基的制作方法为:先把蛋白胨、琼脂加水后,加热,不断搅拌,待琼脂溶解后,加入40g麦芽糖(或葡萄糖),搅拌,使其溶解,然后分装,灭菌。
(2)马铃薯糖琼脂培养基
该培养基的组份包括马铃薯200g;琼脂10g;糖20g;水1000mL。该培养基的制作方法为:把马铃薯洗净去皮,取200g切成小块,加水1000mL,煮沸半小时后,补足水分,在滤液中加入10g琼脂,煮沸溶解后加糖20g,补足水分,分装,灭菌,备用。培养基的pH值调到7.2-7.4。
(3)豆芽汁培养基
该培养基的组份包括黄豆芽100g;琼脂15g;葡萄糖20g;水1000mL。该培养基的制作方法为:洗净黄豆芽,加水煮沸30min,用纱布过滤,滤液中加入琼脂,加热溶解后放入葡萄糖,搅拌使它溶解,补足水分到1000mL,分装,灭菌。
(4)豌豆琼脂培养基
该培养基的组份包括豌豆100g;琼脂25g;水1000mL。该培养基的制作方法为:取100g干豌豆加水,煮沸1h,用纱布过滤后,在滤液中加入琼脂,煮沸到溶解,分装,灭菌。
这些常见的微生物培养基在进行丝状真菌培养时,由于丝状真菌的生长速度较慢,环境中的细菌等也常常会造成培养基的污染,从而影响丝状真菌的大规模快速生长。
厌氧真菌的生长需要严格厌氧条件,厌氧培养条件的限制使其很难大规模培养,厌氧培养条件也提高了生产成本,因此厌氧真菌的工业化应用生产仍然存在很大的困难。发明人历经10年对厌氧真菌的研究,深刻认识到厌氧真菌最重要的功能就是能够高效降解和转化木质纤维素,如何在传统培养基的基础上,研制出一种方便简易,成本低廉,又适合能够高效降解木质纤维素的厌氧真菌生长的新型培养基是厌氧真菌研究领域的一个重点方向,这对于今后加速厌氧真菌降解木质纤维素的功能研究以及促进厌氧真菌在工农畜牧等领域的推广应用都具有重大意义。
针对上述技术问题,发明人在厌氧真菌通用培养基的基础之上,最新研究出一种配方简单、使用方便、成本低廉、能够快速有效地筛选出降解木质纤维素的厌氧真菌的简易培养基。
发明内容
针对上述技术问题,本发明提供了一种1.筛选有效降解木质纤维素的厌氧真菌的简易培养基,其特征在于,所述的1L培养基包括以下原料:酵母膏0-1.0g,蛋白胨0-1.0g,葡萄糖0-1.0g,秸秆0.1g/管,盐溶液I 82.5-165mL,盐溶液II 16.5-165mL,NaHCO3 3.0-7.0g,刃天青1mL 1.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.0-1.7g,瘤胃液0-170mL,余量为水;所述的盐溶液I的配制步骤如下:NaCl 6g,(NH4)2SO4 3g,KH2PO4 3g,CaCl2·2H2O 0.4g,MgSO4·2H2O 0.6g,蒸馏水定容至1000mL;所述的盐溶液II的配制步骤如下:4g K2HPO4,蒸馏水定容至1000mL。
优选地,所述的1L培养基包括以下原料:酵母膏1.0g,蛋白胨1.0g,葡萄糖1.0g,秸秆0.1g/管,盐溶液I 82.5-165mL,盐溶液II 16.5-165mL,NaHCO3 3.0-5.0g,刃天青1mL1.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.0-1.7g,瘤胃液0-170mL,余量为水。
优选地,所述的1L培养基包括以下原料:酵母膏1.0g,葡萄糖1.0g,秸秆0.1g/管,盐溶液I 82.5mL,盐溶液II 16.5mL,NaHCO3 3.0g,刃天青1mL 1.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.0g,余量为水。
优选地,所述的1L培养基包括以下原料:蛋白胨1.0g,葡萄糖1.0g,秸秆0.1g/管,盐溶液I 82.5mL,盐溶液II 16.5mL,NaHCO3 5g,刃天青1mL 1.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.0g,余量为水。
优选地,所述的1L培养基包括以下原料:酵母膏1.0g,秸秆0.1g/管,盐溶液I82.5-165mL,盐溶液II 16.5-165mL,NaHCO3 3.0-5.0g,刃天青1mL 1.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.0-1.7g,余量为水。
优选地,所述的1L培养基包括以下原料:酵母膏1.0g,秸秆0.1g/管,盐溶液I82.5mL,盐溶液II 16.5mL,NaHCO3 3.0g,刃天青1mL 1.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.0g,余量为水。
优选地,所述的秸秆为小麦秸秆。
本发明的有益效果是:1.不需要瘤胃液,避免了传统通用厌氧真菌培养基中必须要加瘤胃液,克服了采集反刍动物瘤胃液过程过于繁琐的缺陷。2.盐溶液和NaHCO3被减量,节约成本。3.氮源简化为一种,只提供必要的氮源即可,减少氮源的种类与复杂的操作步骤。4.不添加葡萄糖,只添加秸秆作为唯一碳源,因为添加葡萄糖后虽然有利于各个种类的厌氧真菌的生长,但是不利于有效降解木质纤维素的厌氧真菌的分离和筛选。如果在培养基中只添加粉碎的秸秆作为唯一碳源,且本发明选用中性洗涤纤维素含量较高的小麦秸秆作为唯一碳源。5.本发明所述的培养基配方简单,方便易行,能够有效筛选出降解木质纤维素的厌氧真菌,在实际生产中更具有应用价值。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下文将结合较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述,但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义,下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的,并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
常用(通用)液体基本培养基的配制步骤如下:酵母膏1.0g,蛋白胨1.0g,葡萄糖1.0g,NaHCO3 7.0g,刃天青(1.0g/L)1mL,L-半胱氨酸盐酸盐1.7g,晨饲前采集瘤胃液8000×g,4℃离心20min后的上清170mL,盐溶液I 165mL,盐溶液II 165mL,蒸馏水定容至1000mL。盐溶液I的配制步骤如下:NaCl 6g,(NH4)2SO4 3g,KH2PO4 3g,CaCl2·2H2O 0.4g,MgSO4·2H2O 0.6g,蒸馏水定容至1000mL。盐溶液II的配制步骤如下:4gK2HPO4,蒸馏水定容至1000mL。
加入小麦秸秆底物后除氧。高温高压灭菌。
实施例一、菌剂的制备
在本实验中分别采用三种菌剂来检测和优化有效降解木质纤维素的厌氧真菌的培养基。
菌剂1:来自青藏高原天祝藏族自治区的放牧牦牛瘤胃液的自然混合的厌氧真菌。
自然混合的厌氧真菌菌剂制备:选择采食天然牧草,无补饲的放牧牦牛为实验动物。用不锈钢胃管一头通过开口器插入瘤胃,另一头接抽空气设备抽吸出胃管内空气形成负压后瘤胃食糜液从不锈钢胃管中流出,迅速用无菌注射器分别吸取1mL瘤胃食糜液接种到9mL上述的液体基本培养基中,先加入终浓度1600IU/mL青霉素钠和2000IU/mL硫酸链霉素,消除细菌,再加入终浓度50μg/mL氯霉素消除甲烷菌,得到混合厌氧真菌,每4d传代一次,每次传代加入上述三种抗生素。
菌剂2:来自青藏高原的海南州兴海县的放牧牦牛瘤胃液的自然混合的厌氧真菌。制备的方法同上。每4d传代一次,每次传代加入上述三种抗生素。
菌剂3:来自青藏高原的海南州兴海县的放牧牦牛瘤胃内容物中分离出的自然共存的由厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibactergottschalkii)组成的混合培养物YakQH5。
混合培养物YakQH5的制备方法如下:用无菌注射器吸取1mL牦牛瘤胃食糜样品,接种到39℃预热的9mL液体基本培养基中,即制成10-1稀释液,再取稀释液依次梯度稀释至10-2、10-3,1mL稀释液被接种到亨盖特厌氧管,厌氧管内有9mL液体基本培养基、葡萄糖(1g/L)和融化的琼脂(20g/L)。接种的同时,每管液体培养基中用七号注射针头无菌注射器加入复合抗生素溶液2滴。被接种的厌氧管立即在冰上滚管后放置,39℃培养4天。真菌单菌株在接种后2-3天长出,在厌氧条件下,用接种环挑取单菌接种到无秸秆的,添加葡萄糖(1g/L)的液体基本培养基中,接种的同时,每管液体培养基中用7号注射针头无菌注射器加入复合抗生素溶液2滴。这个过程在亨盖特琼脂滚管和葡萄糖液体培养基之间重复4-5次,直到亨盖特琼脂滚管上的真菌菌落镜检后形态一致,即获得了厌氧真菌单菌。将获得的单菌接种于小麦秸秆培养基中,39℃培养,每4天传代1次。每次传代时加入复合抗生素溶液消除细菌。用荧光显微镜(Eclipse 80i,尼康,日本)在420nm下观察每1株分离的厌氧真菌单菌株的发酵液是否有蓝色或蓝绿色荧光,同时使用气相色谱仪测定每1株分离的厌氧真菌单菌株是否产生甲烷,确保分离出的混合培养物中甲烷菌的存在,从而筛选出培养物菌株组合。
混合培养物的传代:用无菌注射器吸取1mL混合培养物到厌氧管中的9mL小麦秸秆培养基,4天传代1次。
所述的复合抗生素为:1600IU/mL青霉素钠和2000IU/mL硫酸链霉素。
实施例二、筛选有效降解木质纤维素的厌氧真菌的培养基的优化
发明人在现有的通用的培养厌氧真菌的液体基本培养基配方的基础上,进一步对培养基中含有的碳源、氮源、盐溶液、NaHCO3、瘤胃液、L-半胱氨酸盐酸盐、显示剂刃天青等的加入量分别进行调整,使得调整后的液体培养基能够用于筛选有效降解木质纤维素的厌氧真菌,即只有能够有效降解木质纤维素的厌氧真菌才能够在此培养基上正常生长,从而通过此培养基提高筛选有效降解木质纤维素的厌氧真菌的效率。发明人经过反复大量的实验,制备得到的筛选有效降解木质纤维素的厌氧真菌的改良培养基的配方如表1所示。
表1制备得到的改良培养基配方
注:每管指每1个厌氧管中盛有9mL培养基+1mL接种菌液,然后以1%w/v小麦秸秆为底物,即:每1个厌氧管中加入0.1g小麦秸秆为底物。
吸取实施例一制备得到的菌剂,按10%v/v接种量分别接3种菌剂于七种改良培养基中,七种改良培养基均以1%w/v小麦秸秆为底物,同时加入所需抗生素,39℃厌氧培养5天。在5天培养期内,三种菌剂在七种改良培养基中都能正常生长。
具体生长情况如下:三种菌剂在同时含有葡萄糖和瘤胃液的培养基(第一种改良培养基和第二种改良培养基)中生长普遍更快,总产气量更高,木聚糖酶和内切葡聚糖酶的活性也更高,这主要是因为能源物质—葡萄糖和提供一些生长因子的营养物质—瘤胃液都可以直接促进厌氧真菌的生长,但是对于筛选有效降解木质纤维素的厌氧真菌来说,我们需要设计一种没有直接能源物质的培养基,只能靠厌氧真菌自身降解和转化木质纤维素为葡萄糖为其自身提供生长的能源物质,所以葡萄糖是一定不能加入的物质。瘤胃液为厌氧真菌的生长提供一些生长因子,有利于厌氧真菌生长,但是瘤胃液的大量采集就需要给反刍动物做瘤胃瘘管手术,操作繁琐,而且增加养殖等成本,不利于厌氧真菌在生产中的推广应用。通过我们的实验,证明了不加瘤胃液,三种菌剂仍然能够正常生长,所以本发明中设计的筛选有效降解木质纤维素的厌氧真菌的简化的改良培养基中不加瘤胃液。盐溶液I和盐溶液II的加入量(在表中范围内)对三种菌剂的生长、产气量,以及木聚糖酶和内切葡聚糖酶酶活影响不明显。当NaHCO3低于3.0g时,三种菌剂都不生长。除氧剂L半胱氨酸盐酸盐的加入量在1.0-1.7g之间都能够起到充分的除氧效果,最低加入量是1.0g。
发明人进行了多次实验,并意外的获得了如第七种改良培养基所示的配方,在本培养基中,未添加葡萄糖和瘤胃液,且氮源只有酵母膏,三种菌剂在第七种改良培养基中的生长速度、产气量和木聚糖酶和内切葡聚糖酶的活性虽然低于含有葡萄糖和/或瘤胃液的培养基,但是,3种菌剂也能够正常生长,并没有因为缺少营养物质而难以生长。
正是因为第七种改良培养基没有葡萄糖作为直接能源物质,亦没有瘤胃液作为提供更多生长因子的营养物质,只有一种小麦秸秆作为底物,反而更加有利于筛选有效降解木质纤维素的厌氧真菌,即:有利于筛选在简单的生长和营养条件下能够有效降解唯一碳源小麦秸秆生成葡萄糖为厌氧真菌自身提供生存能量的厌氧真菌。
综上所述,本发明所述的第七种改良厌氧真菌培养基和目前普遍使用的通用厌氧真菌培养基相比,不需要加瘤胃液,避免了采集动物瘤胃液的繁琐过程;盐溶液和NaHCO3都被减量,节约了成本;氮源简化为只加一种;不添加葡萄糖,只添加粉碎的秸秆作为唯一碳源,因为添加葡萄糖后虽然有利于各个种类的厌氧真菌的生长,但是不利于有效降解木质纤维素的厌氧真菌的分离和筛选。如果在培养基中只添加粉碎的秸秆作为唯一碳源,那么就只有能够降解秸秆并转化秸秆为葡萄糖的厌氧真菌才能够稳定传代和存活,从而有利于通过此培养基筛选出有效降解木质纤维素的厌氧真菌。且本发明选用中性洗涤纤维素含量较高的小麦秸秆作为唯一碳源,可以使一部分降解木质纤维素能力很弱的厌氧真菌不容易生长,从而有利于通过此培养基筛选出有效降解木质纤维素的厌氧真菌。第七种改良培养基在实际生产中成本低廉、配方简单、不需要大量采集瘤胃液、方便易行,而且能够高效地筛选出能够有效降解木质纤维素的厌氧真菌,在实际生产中更具有应用价值,能够进一步促进厌氧真菌的应用开发研究,今后将具有广阔的应用前景。
Claims (7)
1.筛选有效降解木质纤维素的厌氧真菌的简易培养基,其特征在于,所述的1L培养基包括以下原料:酵母膏0-1.0g,蛋白胨0-1.0g,葡萄糖0-1.0g,秸秆0.1g/管,盐溶液I 82.5-165mL,盐溶液II 16.5-165mL,NaHCO3 3.0-7.0g,刃天青1mL 1.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.0-1.7g,瘤胃液0-170mL,余量为水;所述的盐溶液I的配制步骤如下:NaCl 6g,(NH4)2SO43g,KH2PO4 3g,CaCl2·2H2O 0.4g,MgSO4·2H2O 0.6g,蒸馏水定容至1000mL;所述的盐溶液II的配制步骤如下:4g K2HPO4,蒸馏水定容至1000mL。
2.如权利要求1所述的简易培养基,其特征在于,所述的1L培养基包括以下原料:酵母膏1.0g,蛋白胨1.0g,葡萄糖1.0g,秸秆0.1g/管,盐溶液I 82.5-165mL,盐溶液II 16.5-165mL,NaHCO33.0-5.0g,刃天青1mL 1.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.0-1.7g,瘤胃液0-170mL,余量为水。
3.如权利要求2所述的简易培养基,其特征在于,所述的1L培养基包括以下原料:酵母膏1.0g,葡萄糖1.0g,秸秆0.1g/管,盐溶液I 82.5mL,盐溶液II 16.5mL,NaHCO3 3.0g,刃天青1mL 1.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.0g,余量为水。
4.权利要求1所述的简易培养基,其特征在于,所述的1L培养基包括以下原料:蛋白胨1.0g,葡萄糖0-1.0g,秸秆0.1g/管,盐溶液I 82.5mL,盐溶液II 16.5mL,NaHCO3 3.0g,刃天青1mL 1.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.0g,余量为水。
5.如权利要求1所述的简易培养基,其特征在于,所述的1L培养基包括以下原料:酵母膏1.0g,秸秆0.1g/管,盐溶液I 82.5-165mL,盐溶液II 16.5-165mL,NaHCO3 3.0g,刃天青1mL 1.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.0g,余量为水。
6.如权利要求5所述的简易培养基,其特征在于,所述的1L培养基包括以下原料:酵母膏1.0g,秸秆0.1g/管,盐溶液I 82.5mL,盐溶液II 16.5mL,NaHCO3 3.0g,刃天青1mL 1.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐1.0g,余量为水。
7.如权利要求1-6任一项所述的简易培养基,其特征在于,所述的秸秆为小麦秸秆。
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