CN107130001A - 一种共培养物及其发酵小麦秸秆产甲烷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种厌氧真菌‑产甲烷菌共培养物及其发酵小麦秸秆生产甲烷的方法。该共培养物是从青藏高原的甘肃天祝南泥湾牧场的全放牧牦牛瘤胃液中分离的自然共存的厌氧真菌和反刍兽甲烷短杆菌（PiromycesYak TZ+M. ruminantium），该共培养物该在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12952。以该共培养物为菌剂对小麦秸秆进行厌氧发酵可产生大量的甲烷，共培养物降解小麦秸秆7天产生的甲烷量达到3.7mmol/g DM，且发酵时间短，发酵工艺简便，具有广阔的应用开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体为一种厌氧真菌甲烷菌共培养物及其厌氧发酵小麦秸秆生产甲烷的方法。
背景技术
小麦是我国的主要粮食作物，播种面积广泛，每年伴随产生的秸秆数量也是非常巨大的。近年来，在全球范围内，随着人口数量的增加，生活质量提高导致的对能源的需求急剧上升。传统的能源物质面临枯竭的危险，且这些传统能源物质在使用时产生了大量温室气体，污染环境。小麦秸秆，作为可再生能源物质受到越来越多的关注。但是目前我国农村的大量小麦秸秆资源完全处于高消耗、高污染、低利用率、低产出状况，小麦秸秆作为能源物质没有得到合理开发利用。通过厌氧消化可再生资源(木质纤维素)产生的生物气(甲烷)，被认为是一种能够替代化石燃料理想的能源。
木质纤维素是小麦秸秆的主要成分，木质纤维素的水解是整个厌氧消化中的限速步骤，也是整个技术的难点。木质纤维素素生物质主要由纤维素、半纤维和木质素组成，木质素和半纤维素结合的共价键将纤维素分子包埋其中，木质素中醚键和碳-碳键形成的具有三维结构高分子芳香类化合物，这些强的键抑制水解酶的作用。因此，需要对木质纤维素进行预处理。常见的预处理木质纤维素方法有机械法、热处理法、化学处理，这些都能有效的促进厌氧消化，但这些预处理方法成本高，不环保。普通的微生物处理也存在较多缺陷，单一微生物处理效果不好，人工构件的复合菌群效果也不理想，各菌种间存在相互拮抗的表现，导致预处理时间长，转化效率低。
专利CN 105505995 A本专利提出一种利用瘤胃微生物预处理水稻秸秆提高甲烷产量的方法，取得了一定效果，但该方法采用瘤胃液进行预处理，瘤胃液的来源受限，必须是屠宰反刍动物后方能获得；其次，瘤胃液中成分复杂，处理效果不稳定；再次，直接取出的瘤胃液必须立即使用，不方便储存运输，适用范围受到限制；最后，瘤胃液中成分多样，气味不好，不方便使用。
发明内容
本发明的目的是客服上述技术的不足，提出一种自然共存的厌氧真菌与甲烷菌共培养物体系及使用该共培养物厌氧发酵小麦秸秆生产甲烷的方法。
本发明中厌氧发酵使用的菌种，是厌氧真菌和反刍兽甲烷短杆菌共培养物，PiromycesYak TZ+M. ruminantium，该共培养物保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12952，保藏时间为2016年11月25日，分类名称为：一株厌氧真菌Piromyces与反刍兽甲烷短杆菌(Methenobrevibacter ruminantium)的共培养物。SEQ ID No.1为PiromycesYak TZ的ITS1序列，SEQ ID No.2为M. ruminantium的16SrDNA序列。
本发明的另一目的是提供一种厌氧发酵小麦秸秆的方法，具体包括如下步骤：
（1）PiromycesYak TZ+M. ruminantium共培养物菌剂的制备
将PiromycesYak TZ+M. ruminantium共培养物菌液以10%（v/v）接种量接种到厌氧培养基中，加入1%（w/v）风干粉碎的小麦秸秆作为底物，同时加入复合抗生素，置39℃厌氧培养72h即得到高活力菌剂。
厌氧培养基配方：酵母膏 1.0 g，蛋白胨 1.0 g，NaHCO3 7.0 g，刃天青 (1.0 g/L) 1 mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7 g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4°C 离心20 min后的上清170 mL，盐溶液I 165 mL，盐溶液II 165 mL，蒸馏水定容至1000 mL。
盐溶液 I 包括 NaCl 6 g，(NH4)2SO4 3 g ，KH2PO4 3 g ，CaCl2·2H2O 0.4 g，MgSO4·2H2O 0.6 g，蒸馏水定容至1000 mL。
盐溶液 II 包括4 gK2HPO4，蒸馏水定容至1000 mL。
加入小麦秸秆作为底物后除氧。高温高压灭菌。
作为优选，复合抗生素为青霉素钠和硫酸链霉素，在厌氧培养基溶液中的终浓度分别为1600 IU/mL和2000 IU/mL。
（2）小麦秸秆发酵生产甲烷
吸取步骤（1）制备的菌剂，按10%（v/v）接种量接入以1%（w/v）小麦秸秆为底物的与步骤（1）相同的厌氧培养基中，同时加入复合抗生素，39°C厌氧培养7天。
作为优选，复合抗生素为青霉素钠和硫酸链霉素，在厌氧培养基溶液中的终浓度分别为1600 IU/mL和2000 IU/mL。
本发明中采用的厌氧真菌和反刍兽甲烷短杆菌共培养物PiromycesYak TZ+M. ruminantiu是从青藏高原天祝南泥湾牧场的全放牧牦牛瘤胃内容物中分离的自然共存的厌氧真菌和反刍兽甲烷短杆菌共培养物，牦牛瘤胃中的微生物协同降解低质野草为牦牛提供生存必需的营养物质，使牦牛适应青藏高原的严酷环境而生存。长期的自然选择和进化使牦牛瘤胃成为一个高效木质纤维素降解酶系统，与人为混合的厌氧真菌和甲烷菌共培养物相比，牦牛瘤胃自然存在的厌氧真菌和甲烷菌共培养物具有独特优势和高效的木质纤维素降解能力。采用PiromycesYak TZ+M. ruminantium发酵小麦秸秆，产甲烷量可达到3.7mmol/g DM。
在发酵过程中添加复合抗生素，可防止共培养物体系不受细菌污染，提高厌氧发酵效率。
同时，本发明中采用的共培养物可以通过保藏在体外存活传代，突破了使用瘤胃液的时间和地域限制，便于推广，为生产提供了极大的方便。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的培养基如下：
厌氧培养基配方：酵母膏 1.0 g，蛋白胨 1.0 g，NaHCO3 7.0 g，刃天青 (1.0 g/L) 1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7 g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4°C 离心20 min后的上清170mL，盐溶液I 165 mL，盐溶液II 165 mL，蒸馏水定容至1000 mL。
盐溶液 I 包括 NaCl 6 g，(NH4)2SO4 3 g ，KH2PO4 3 g ，CaCl2·2H2O 0.4 g，MgSO4·2H2O 0.6 g，蒸馏水定容至1000 mL。
盐溶液 II 包括4 gK2HPO4，蒸馏水定容至1000 mL。
加入小麦秸秆为底物后除氧。高温高压灭菌。
实施例一、PiromycesYak TZ+M. ruminantium菌剂的制备。
吸取1mL PiromycesYak TZ+M. ruminantium共培养物接种到20 mL体积的亨氏厌氧管中的9 mL以风干粉碎的小麦秸秆为底物的厌氧培养基中，同时加入复合抗生素，加入复合抗生素后，培养基溶液终浓度青霉素：1600 IU/mL和硫酸链霉素：2000 IU/mL，39℃厌氧培养72h，即达到生长高峰，此时发酵液为高活力菌剂。
实施例二、厌氧发酵秸秆生产甲烷。
在100 mL体积厌氧发酵瓶中盛45mL液体基本培养基，以0.5 g风干粉碎后的小麦秸秆作为底物，除氧，灭菌。把传代培养72h 的PiromycesYak TZ+M. ruminantium共培养物用无菌注射器吸取5 mL接种到上述加有小麦秸秆的厌氧培养基中，同时加入复合抗生素（培养基溶液终浓度青霉素：1600 IU/mL和硫酸链霉素：2000 IU/mL），39°C厌氧培养7天。共设置3个平行实验，隔24 h测定厌氧瓶中的甲烷量。通过气相色谱法测定甲烷：使用气相色谱仪（GC522，伍丰仪器，中国），配置有GPS101柱（2 m×3 mm），热导检测器，汽化室250°C，柱温100°C，检测器温度150°C，载气为氮气。
实验结果显示，共培养物PiromycesYak TZ+M. ruminantium高效降解小麦秸秆的同时产生大量甲烷，具体结果如下表：
注: b，c，d表示统计学差异性 (p< 0.05)。
共培养物PiromycesYak TZ+M. ruminantium在7天内降解小麦秸秆达到的最高值3.7mmol/gDM。
通过以上我们可以看到，牦牛瘤胃自然共培养物PiromycesYak TZ+M. ruminantium共培养物降解小麦秸秆的同时产生大量甲烷，降解小麦秸秆产生最高产量CH43.7 mmol/g DM，具有重要的工业应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 甘肃省科学院生物研究所
<120> 一种厌氧真菌甲烷菌共培养物及其发酵秸秆产甲烷的方法
<160> 2
<210> 1
<211> 394
<212> DNA
<213> Piromyces Yak TZ
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cctaaagcgt ccgtagccgg tttaataagt ctctggtgaa atcctgtagc ttaactgtgg 480
gaattgctgg agatactatt agacttgaga ccgggagagg ttggaggtac tcccagggta 540
gaggtgaaat tctgtaatcc tgggaggacc gcctgttgcg aaggcgtcta actggaacgg 600
ttctgacggt gagggacgaa agttaggggc gcgaaccgga ttagataccc gggtagtcct 660
aactgtaaac gatgcggact tggtgttggg gtggctttga gctgctccag tgccgaaggg 720
aagctgttaa gtccgccgcc tgggaagtac ggtcgcaaga ctgaaactta aaggaattgg 780
cgggggggca ccacaacgcg tggagcctgc ggtttaattg gattcaacgc cggacgtctc 840
accagaggcg acagctgtat gatagccagg ttgatgactt tgcttgacta gctgagagga 900
ggtgcatggc cgccgtcagc tcgtaccgtg aggcgtcctg ttaagtcagg caacgagcga 960
gacccacgcc cttagttacc agcttgtcct ttttttggat gatgggcaca ctaaggggac 1020
cgcctatgat aaataggagg aaggagtgga cgacggtagg tccgtatgcc ccgaatcctc 1080
tgggcaacac gcgggctaca atggctgaga caatgggttc cgacaccgaa aggtggaggt 1140
aatcctctaa acttagtcgt agttcggatt gaggactgta actcgttctc atgaagctgg 1200
aatgcgtagt aatcgcgtat cactattgcg cggtgaatac gtccctgctc cttgcacaca 1260
tcg 1263
Claims (4)
1.一种厌氧真菌和反刍兽甲烷短杆菌PiromycesYak TZ+M. ruminantium共培养物，其特征在于所述的共培养物在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 12952。
2.一种发酵小麦秸秆生产甲烷的方法，其特征在于使用权利要求1所述的共培养物为厌氧发酵菌剂。
3.根据权利要求2所述的生产甲烷方法，包括如下步骤：
（1）共培养物菌剂的制备：以10%（v/v）接种量向以1%（w/v）小麦秸秆为底物的厌氧培养及中接入PiromycesYak TZ+M. ruminantium共培养物，加入复合抗生素， 39℃厌氧培养72h；
（2）生产甲烷：吸取步骤（1）所得菌剂，以10%（v/v）接种量接入以1%（w/v）小麦秸秆为底物的厌氧培养基中，加入复合抗生素，39°C厌氧培养7天。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于加入的复合抗生素为青霉素钠和硫酸链霉素，在厌氧培养基溶液中的终浓度分别为1600 IU/mL和2000 IU/mL。
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