CN110592048A - 一种梨囊鞭菌发酵秸秆生产乙酰酯酶的新方法和应用 - Google Patents

一种梨囊鞭菌发酵秸秆生产乙酰酯酶的新方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体涉及一株梨囊鞭菌发酵秸秆生产乙酰酯酶的方法和应用。本发明公开了一种公开了梨囊鞭菌Piromyces CY1厌氧发酵秸秆生产乙酰酯酶的方法，所述的梨囊鞭菌Piromyces CY1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO.18141。本发明所公开的梨囊鞭菌Piromyces CY1可以通过保藏在体外传代存活，发酵秸秆可产生高活性的乙酰酯酶，且发酵工艺简单，对设备要求低，便于推广，在工业领域具有重要工业应用价值和开发前景。

Description

一种梨囊鞭菌发酵秸秆生产乙酰酯酶的新方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体涉及一种梨囊鞭菌及其发酵秸秆生产乙酰酯酶的方法和应用。
背景技术
木质纤维素是秸秆的主要成分，木质纤维素的水解是整个厌氧消化中的限速步骤，也是技术难点。木质纤维素素生物质主要由纤维素、半纤维和木质素组成，木质素和半纤维素结合的共价键将纤维素分子包埋其中，木质素中醚键和碳-碳键形成的具有三维结构高分子芳香类化合物，这些强的化学键抑制水解酶的作用。因此，需要对木质纤维素进行预处理。常见的预处理木质纤维素方法有机械法、热处理法、化学处理，这些都能有效促进厌氧消化，但这些预处理方法成本高，不环保。普通微生物处理也存在较多缺陷，单一微生物处理效果不好，人工构件的复合菌群效果也不理想，各菌种间存在相互拮抗的表现，导致预处理时间长，转化效率低。
我国油菜种植面积占全世界油菜种植面积的大约四分之一，每年产生的油菜秸秆近千万吨，油菜秸秆外表皮致密光滑，含有脂肪、蜡等弱介质层。其主要化学成份(纤维素、半纤维素、木质素)接近于玉米秸杆、芦苇两种常见禾本科植物和杨木阔叶材，灰分和抽出物与玉米秸杆、芦苇相当且多于杨木。目前油菜秸秆作为能源物质没有得到合理开发利用。对油菜秸秆亟待探索新型高效的利用途径，提高油菜秸秆的利用价值，改变“村村点火，处处冒烟，秸秆遍地，烽烟四起”的局面，减少对生态环境的污染，从根本上解决油菜秸秆的乱烧乱抛现象，更好的利用油菜秸秆，变废为宝，目前尚未有完备的方案进行油菜秸秆的厌氧发酵来生产乙酰酯酶。
犏牛是牦牛与黄牛杂交的一代种。分为犏牛(公)和犏乳牛(母)具有明显杂交优势，肉、乳生产能力、役用能力接近于牦牛。用野血牦牛冻精对农区西门塔尔牛进行杂交，其杂交后代就是犏牛，由于犏牛中含有50％野牦牛血液，具有较高的青藏高原环境适应能力。犏牛瘤胃内栖息着独特的，复杂多样，大量的微生物群落协同代谢高效降解野牧草为牦牛提供生存能量和营养物质，长期的自然选择和进化使犏牛瘤胃成为一个高效木质纤维素降解酶系统，具有独特优势和高效的木质纤维素降解能力。
采用梨囊鞭菌处理油菜秸秆，是一个较新也较为有效的手段。在本专利中，1个酶活力单位(U)是：在39℃，1mL酶液在1min内自标准底物对-硝基苯乙酯中释放1μmol对-硝基苯所需的酶量。
发明人魏博士在攻读博士期间研究了牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌的共培养物以及梨囊鞭菌纯培养物以玉米秸秆、水稻秸秆和小麦秸秆为底物进行厌氧发酵(魏亚琴.牦牛瘤胃梨囊鞭菌与甲烷菌共培养物的多样性及其纤维降解特性研究[D].2016.)，通过检测产气量、多糖水解酶活性、各种酯酶活性、干物质降解率、酚酸释放量、甲烷和乙酸产量来评估梨囊鞭菌和甲烷菌共培养物以及梨囊鞭菌纯培养物降解三大秸秆的功效，研究结果显示：高效降解三大秸秆的N属梨囊鞭菌纯培养物(N.frontalis)Yak16分别以三大秸秆为底物厌氧培养7天，其中以水稻秸秆为底物第7天培养期的乙酰酯酶活性达到最高值110.5mU；高效降解三大秸秆的P属梨囊鞭菌纯培养物Piromyces Yak18分别以三大秸秆为底物厌氧培养7天，其中以水稻秸秆为底物厌氧发酵第7天培养期的乙酰酯酶活性达到最高值92.7mU；高效降解三大秸秆的最佳优势组合共培养物N.frontalis Yak16+M.ruminantium以玉米秸秆为底物所产乙酰酯酶活性达到199.3mU，高于以小麦秸秆和水稻秸秆为底物，以上所产的乙酰酯酶的活性普遍都偏低，无法满足生物制酶的广泛用途。
针对上述技术问题，本发明另辟蹊径，从犏牛瘤胃中分离梨囊鞭菌纯培养物，将其用于秸秆的厌氧发酵，意外地得到了一种能够高效分解油菜秸秆并产生高活性乙酰酯酶的梨囊鞭菌。
发明内容
本发明公开了一种梨囊鞭菌Piromyces CY1，分离自青藏高原的甘肃省天祝县安远镇南泥湾村的乌鞘岭牧场的全放牧犏牛瘤胃内容物中，所述的梨囊鞭菌Piromyces CY1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO.18141，保藏日期为2019年7月9 日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还公开了梨囊鞭菌Piromyces CY1以秸秆为底物厌氧发酵生产乙酰酯酶的方法，所述的方法具体包括如下步骤：
(1)Piromyces CY1纯培养物菌剂的制备
将Piromyces CY1纯培养物菌液以10％v/v接种量接种到液体基本培养基中，加入1％w/v 干燥粉碎的秸秆作为底物，同时加入复合抗生素传代培养，置39℃厌氧培养72h即得到高活力菌剂；
(2)厌氧发酵秸秆生产乙酰酯酶
吸取步骤(1)制备的菌剂，按10％v/v接种量接入以1％w/v秸秆为底物的与步骤(1) 相同的液体基本培养基中，同时加入复合抗生素，39℃厌氧培养7天。
优选的，所述的液体基本培养基的配方为：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO37.0g， 1.0g/L刃天青1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min 后的上清170mL，盐溶液I165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL。
优选的，所述的盐溶液I包括NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL。
优选的，所述的盐溶液II包括K2HPO4 4g，蒸馏水定容至1000mL。
优选的，所述的步骤(1)中加入的秸秆为小麦秸秆。
优选的，所述的步骤(2)中加入的秸秆为油菜秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆的任一种。
优选的，所述的步骤(2)中加入的秸秆为油菜秸秆。
优选的，所述的步骤(2)中加入秸秆底物后除氧，高温高压灭菌。
优选的，复合抗生素为青霉素、硫酸链霉素和氯霉素；在发酵过程中添加复合抗生素，可防止共培养物体系不受细菌和甲烷菌污染，提高厌氧发酵效率。
优选的，所述的青霉素和硫酸链霉素在厌氧培养基的终浓度分别为1600IU/mL和2000 IU/mL，氯霉素在培养基的终浓度是50μg/mL。
所述的梨囊鞭菌Piromyces CY1在生物制乙酰酯酶中的应用。
本发明的有益效果是：①本发明所公开的梨囊鞭菌Piromyces CY1厌氧发酵油菜秸秆所产乙酰酯酶的活性很高，达到419.7mU，相较于现有技术获得了显著提高；②本发明中采用的梨囊鞭菌可以通过保藏在体外存活传代，发酵油菜秸秆可产生大量高活性乙酰酯酶，且发酵工艺简单，对设备要求低，便于推广，在工业领域具有重要工业应用价值和开发前景；③通过天祝放牧犏牛瘤胃梨囊鞭菌厌氧发酵油菜秸秆可产生大量的高活性乙酰酯酶，可进一步提高油菜秸秆的使用率，显著提高经济效益。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明所请求保护的技术方案进行说明，但本发明所请求保护的范围并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的厌氧培养基如下：
液体基本培养基的配方：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO3 7.0g，刃天青(1.0g/L)1 mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液I包括NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O0.6g，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液II包括4g K2HPO4，蒸馏水定容至1000mL。
分离纯化培养基：在液体基本厌氧培养基中添加1.0g/L葡萄糖，不加秸秆，然后除氧和高压灭菌。
琼脂滚管培养基：在液体基本培养基中添加1.0g/L葡萄糖和20g/L琼脂粉，然后除氧和高压灭菌。
秸秆培养基：在液体基本培养基中分别添加1％(w/v)的粉碎风干的油菜秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆或水稻秸秆，然后除氧和高压灭菌。
传代培养基：在液体基本培养基中添加1％(w/v)的粉碎风干的小麦秸秆，然后除氧和高压灭菌。
除氧方法：将液体基本培养基分装到亨氏厌氧管或厌氧瓶中，厌氧管或厌氧瓶通过针头接入带有真空泵和高纯CO2的抽气装置进行培养基除氧。首先真空泵抽出管中气体达到负压时培养基颜色改变，然后充入高纯CO2。每管抽气充气3次，其中第1次约15min，其余 2次每次5min，最后1次充气后用无菌株针再放气使得厌氧管内外压平衡，然后于121℃高温高压湿热灭菌20min后备用。
实施例一、梨囊鞭菌Piromyces CY1菌剂的制备
吸取1mL梨囊鞭菌Piromyces CY1培养物接种到20mL体积的亨氏厌氧管中以风干粉碎的0.1g小麦秸秆为底物的9mL厌氧培养基中，同时加入复合抗生素，使青霉素钠和硫酸链霉素在厌氧培养基的终浓度分别为1600IU/mL和2000IU/mL，氯霉素在培养基中的终浓度为50μg/mL。39℃厌氧培养72h，即达到生长高峰，此时发酵液为高活力菌剂。
实施例二、梨囊鞭菌Piromyces CY1发酵秸秆生产乙酰酯酶的方法
1.发酵秸秆生产乙酰酯酶的方法
在100mL体积厌氧发酵瓶中盛90mL液体基本培养基，分别以1.0g粉碎风干后的油菜秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆为底物。除氧。灭菌。把传代培养72h的梨囊鞭菌Piromyces CY1用无菌注射器吸取10mL分别接种到上述加有油菜秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆的厌氧培养基中，同时加入复合抗生素，使其在厌氧培养基溶液的终浓度为青霉素1600IU/mL，硫酸链霉素2000IU/mL，氯霉素在培养基中的终浓度为50μg/mL，39℃厌氧培养7天。共设置3个平行实验，隔24h测定发酵液中的乙酰酯酶的活性。
2.乙酰酯酶的活性的测定方法
乙酰酯酶(AE)活性的测定：稀释粗酶液并置39℃预热15min，2mM对-硝基苯乙酯作为底物和50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)置于39℃预热15min。向50μL粗酶液中加入100μL 磷酸钠缓冲液和50μL底物，39℃反应30min后，用酶标仪(680XR，Bio-rad，美国)在415nm 下检测吸光值，根据对-硝基苯的标准曲线计算乙酰酯酶活性。
1个酶活力单位(U)是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物对-硝基苯乙酯中释放1μmol对-硝基苯所需的酶量。
实验结果显示，梨囊鞭菌Piromyces CY1高效降解油菜秸秆的同时产生高活性乙酰酯酶，活性达到419.7mU，显著高于现有技术所报道的梨囊鞭菌降解各种秸秆所产乙酰酯酶的活性，也显著高于梨囊鞭菌Piromyces CY1降解小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆所产生的乙酰酯酶的活性。具体结果如下表：
表7天培养期内梨囊鞭菌Piromyces CY1发酵各类秸秆所产乙酰酯酶的活性
通过以上实施例我们可以看到：犏牛瘤胃梨囊鞭菌Piromyces CY1降解油菜秸秆的同时产生高活性的乙酰酯酶，达到419.7mU，在工业领域和生物降解领域具有重要的工业应用价值和开发前景。

Claims (10)

1.一种梨囊鞭菌Piromyces CY1厌氧发酵秸秆生产乙酰酯酶的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)梨囊鞭菌Piromyces CY1纯培养物菌剂的制备
将Piromyces CY1纯培养物菌液以10％v/v接种量接种到液体基本培养基中，加入1％w/v干燥粉碎的秸秆作为底物，同时加入复合抗生素传代培养，厌氧培养即得到高活力菌剂；
(2)厌氧发酵秸秆生产乙酰酯酶
吸取步骤(1)制备的菌剂，按10％v/v接种量接入以1％w/v小麦秸秆为底物的液体基本培养基中，加入复合抗生素厌氧培养。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梨囊鞭菌Piromyces CY1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO.18141，保藏日期为2019年7月9日。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的液体基本培养基配方为：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO3 7.0g，1.0g/L刃天青1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的盐溶液I包括NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL；所述的盐溶液II包括4g K2HPO4，蒸馏水定容至1000mL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复合抗生素为青霉素钠、硫酸链霉素和氯霉素；所述的青霉素钠和硫酸链霉素在厌氧培养基的终浓度分别为1600IU/mL和2000IU/mL，所述的氯霉素在培养基终浓度为50μg/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其特征在于，所述步骤(1)中加入的秸秆为小麦秸秆。
7.如权利要求1所述的梨囊鞭菌Piromyces CY1厌氧发酵秸秆生产乙酰酯酶的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中加入的秸秆分别为油菜秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆的任一种。
8.如权利要求5所述的梨囊鞭菌Piromyces CY1厌氧发酵秸秆生产乙酰酯酶的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中加入的秸秆为油菜秸秆。
9.如权利要求1所述的梨囊鞭菌Piromyces CY1厌氧发酵秸秆生产乙酰酯酶的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中加入秸秆底物后除氧，高温高压灭菌。
10.如权利要求1所述的梨囊鞭菌Piromyces CY1在生物法制乙酰酯酶中的应用。
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