CN102409005B - 一株具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌 - Google Patents
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Abstract
一株具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，它涉及一株高温菌。具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，它为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NF705，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No：4489，保藏日期为2010年12月17日。本发明以自然堆积的牛粪为分离源，采用高温培养驯化的手段分离筛选出一株具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，它具有较高纤维素酶活与蛋白酶活，羧甲基纤维素相对酶活性，1.56±0.11cm.d-1，蛋白酶相对活性1.28±0.2cm.d-1。
Description
技术领域
本发明涉及一株高温菌。
背景技术
目前，高温好氧堆肥化处理是解决农村固体废物问题的一个重要途径，具有保护环境，节约原材料和能源、投资少、运行费用低等优点。但是，农业固体废物，尤其是牛等食草动物的粪便中含有大量的木质纤维素，其成分复杂，难以被充分利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用。因此，它们的生物降解成为生物技术处理有机固体废物的关键，也是近年来研究的重点。然而，在堆肥过程中木质素、纤维素和半纤维素等分子产生破坏，断裂和分解的主要阶段是在堆肥高温阶段，由于温度的影响，微生物种群受到很大的抑制，表现为种类单一，数量减少，比中温阶段要少1-2个数量级，这无疑限制了大分子难降解的木质纤维素物质的快速降解。已有的研究表明，在堆肥高温阶段，堆肥中绝大部分的寄生虫、虫卵、孢子和病原菌等被杀死，是保证堆肥无害化的最重要阶段。大量的研究表明，堆体温度应控制在45℃-65℃之间，尤其是在55℃-60℃时比较好，此时也是木质纤维素等大分子物质降解的最适温度。研究该温度范围内的微生物及其活动特性对堆肥技术的提高具有重要意义。从已有的文献中可以看出，现今关于牛粪堆肥的而研究是非常活跃的，相关的文献也较多，但关于分离于牛粪堆肥的同时具有纤维素酶活与蛋白酶活的高温地衣芽孢杆菌的研究还极少，目前关于地衣芽孢杆菌的研究主要集中于其淀粉酶活与产抗生素的研究方面。
发明内容
本发明提供了一株具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌。
具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，它为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)NF705，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo：4489，保藏日期为2010年12月17日；它为杆菌，长为1.5μm～3.5μm，宽为0.6μm～0.8μm，无荚膜，中生椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。
本发明中具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，它为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)NF705，它的培养特征如下：
琼脂斜面：生长旺盛，粗糙，不透明，粘着，扩展，有毛状枝条。
葡萄糖琼脂斜面：生长丰厚，有皱纹，表面有似挤出的小滴或粘液状囊，沿接种线有毛状枝条。
酪氨酸琼脂斜面：生长旺盛，粗糙，不透明，粘着，扩展，有毛状枝条。
肉汁琼脂平板：菌落大，扩展，表面粗糙或具皱纹，有毛状枝条，暗白色，培养物颜色加深，呈微黄褐色。
本发明中具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，它为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)NF705，其明胶穿刺快速的呈漏斗状、淀粉水解呈阳性、乙酰甲基甲醇反应呈阳性、利用柠檬酸盐、硝酸盐还原呈阳性、卵磷脂酶试验呈阴性、利用阿拉伯糖、利用木糖、利用葡萄糖、利用蔗糖、利用甘露醇产酸、不产气、固体培养基上最适生长温度为45～55℃，液体培养基上最适生长温度为58～62℃，最适生长pH值为4.5～8.5。
本发明中具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，它为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)NF705，其16S rRNA序列分析结果显示与Bacillus licheniformis的16S rRNA序列的相似性最高，达到99％；并结合细菌形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果，确定地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NF705为芽孢杆菌属的一个新菌种。
本发明中具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，它为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)NF705，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No：4489，保藏日期为2010年12月17日。
本发明以自然堆积的牛粪为分离源，采用高温培养驯化的手段分离筛选出一株具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，它具有较高纤维素酶活与蛋白酶活，羧甲基纤维素相对酶活性，1.56±0.11cm.d-1，蛋白酶相对活性1.28±0.2cm.d-1。
本发明具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，对堆肥技术的提高具有重要意义。
附图说明
图1为具体实施方式一中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NF705含芽孢G+菌体的显微镜观察图；图2为具体实施方式一中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NF705对数生长期菌体的显微镜观察图；图3为具体实施方式一中地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)NF705和相近菌株的16S rRNA基因序列构建的系统发育树谱图；图4为具体实施方式一中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NF705的生长曲线图，其中◆表示OD值。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，它为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NF705，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No：4489，保藏日期为2010年12月17日；它为杆菌，长为1.5μm～3.5μm，宽为0.6μm～0.8μm，无荚膜，中生椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。
本实施方式中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NF705(见图1和2)，其进行常规生理生化鉴定，实验结果为：明胶穿刺快速的呈漏斗状、淀粉水解呈阳性、乙酰甲基甲醇反应呈阳性、利用柠檬酸盐、硝酸盐还原呈阳性、卵磷脂酶试验呈阴性、利用阿拉伯糖、利用木糖、利用葡萄糖、利用蔗糖、利用甘露醇产酸、不产气。
本实施方式中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NF705，它的培养特征如下：
琼脂斜面：生长旺盛，粗糙，不透明，粘着，扩展，有毛状枝条。
葡萄糖琼脂斜面：生长丰厚，有皱纹，表面有似挤出的小滴或粘液状囊，沿接种线有毛状枝条。
酪氨酸琼脂斜面：生长旺盛，粗糙，不透明，粘着，扩展，有毛状枝条。
肉汁琼脂平板：菌落大，扩展，表面粗糙或具皱纹，有毛状枝条，暗白色，培养物颜色加深，呈微黄褐色。
本实施方式具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，它为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)NF705，该菌株分离自哈尔滨市机场路八里堡农户传统堆置牛粪堆肥固体样品；它按以下步骤进行分离培养：
a、哈尔滨市机场路八里堡农户传统堆置牛粪堆肥固体样品经风干晾晒，分筛，除去杂物及水分(晾晒时注意遮蔽阳光暴晒及雨淋，适当的翻动)后装于玻璃容器中待用，放于4℃冰箱中保存，备用；
b、将处理后的牛粪堆肥样品在75～80℃水浴锅中水浴10min后，冷却，采用10倍稀释，平板涂布法，用牛肉膏蛋白胨培养基进行高温菌的分离培养；培养温度60℃±2℃，培养时间24h～72h，其间观察菌落的生长情况并记录；挑取在此培养条件下，菌落生长迅速，菌落较大的单个的菌落转接于牛肉膏蛋白斜面培养基中；将分离到的斜面培养物在牛肉膏蛋白胨平板中采用多次划线分离60℃±2℃高温培养的方法，最终获得纯培养物，将获得的纯培养物转接于牛肉膏蛋白斜面培养基，放于4℃冰箱保存备用；共分离细菌菌株25株；
c、将初步分离得到的斜面菌株加入少量的无菌水，制备成菌悬液，采用钢圈滴注的方法，滴1滴加到酪素培养基平板中，重复3次，置于60℃±2℃的恒温培养箱中培养24h～72h，每隔4小时观察透明圈产生情况，挑取产生透明圈的菌落，转接于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，备用；共分离菌株16株；
d、再将上述斜面培养物加入少量的无菌水，制备成菌悬液，采用钢圈滴注的方法，滴1滴加到纤维素刚果红培养基平板中，重复3次，置于60℃±2℃的恒温培养箱中培养24h～72h，每隔4小时观察透明圈产生情况，挑取产生透明圈的菌落，转接于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，备用；共分离菌株11株；此11株菌可以确定均为高温菌，并同时具有耐高温纤维素酶与蛋白酶活；经过初次分筛获得的高温菌株中，以编号为705，保藏编号CGMCC No.4489的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的水解透明圈的直径最大；
其中牛肉膏蛋白胨培养基由3.0g的牛肉膏、10.0g的蛋白胨、5.0g的NaCl、15.0g的琼脂和1000ml的H2O组成，pH值为7.0，121℃下蒸汽灭菌30min；
酪素培养基由10g的蛋白胨、1.0g的葡萄糖、5.0g的NaCl、0.1g的CaCl、0.1g的L-Tyr、5.0g的酪素、18g的琼脂和1000ml的H2O组成，pH值为7.2～7.4，121℃下蒸汽灭菌30min；
纤维素刚果红培养基由0.5g的KH2PO4、0.25g的MgSO47H2O、1.88g的微晶纤维素、2g的明胶、0.2g的刚果红、100ml的土壤浸出液、15g的琼脂和900ml的H2O组成，pH值为6.5，121℃下蒸汽灭菌30min。
依据《伯杰氏细菌学鉴定手册》对筛选出的具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌进行常规生理生化鉴定；采用CTAB法进行细菌总DNA的提取，然后对其进行16S rRNA序列分析，结果显示(见图3)与Bacillus licheniformis的16S rRNA序列的相似性最高，达到99％；并结合细菌形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果，确定具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌为芽孢杆菌属的一个新菌种，命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)NF705。
本实施方式中筛选出的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NF705，将其菌株的斜面培养物挑取1环接种于100ml牛肉膏蛋白胨发酵培养基中(由3.0g的牛肉膏、1.0g的蛋白胨、0.5g的NaCl、和100ml的H2O组成，pH值为7.0～7.2，121℃下灭菌30min)，在60℃±2℃，180转/分，培养24h～36h，每隔4小时取样一次，以不接菌的牛肉膏蛋白胨发酵培养液为参比调零点，采用分光光度计法在600nm波长下测定其吸光度，进而测定其菌密度(见表1)，并绘制生长曲线，如图4所示，该菌可以在高温的条件下良好的生长，4个小时后即进入生长的对数期，在16个小时即达到了稳定期。
表1NF705以牛肉膏蛋白胨为培养基60℃下不同时间的菌密度
| 时间 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 | 24 | 28 | 32 | 36 |
| OD值 | 0.224 | 0.981 | 1.896 | 2.909 | 2.876 | 2.902 | 2.990 | 2.876 | 2.789 |
本实施方式中筛选出的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NF705，为了验证该菌的高温条件的稳定性，经过超过5次以上传代后，挑取1环该菌株的斜面培养物接种于100ml牛肉膏蛋白胨发酵培养基中，在60℃±2℃，180转/分，培养16h结束发酵。取该培养物按1％的接种量接入不同的培养基中，进行液体发酵培养，在60℃±2℃，180转/分，经过24小时和36小时培养后，以无菌水为参比，调零点，各发酵液稀释10倍后，利用分光光度计法，在600nm波长测定吸光度，测定其菌密度，观察该菌的生长情况；
结果见表2(不同培养基、不同培养温度条件下菌株生长状况)，其中处理1为牛肉膏蛋白胨培养基：由3.0g的牛肉膏、1.0g的蛋白胨、0.5g的NaCl、和100ml的H2O组成，pH值为7.0，121℃下蒸汽灭菌30min。处理2为CMC培养基：由1.5g的CMC-Na、0.1g的NH4NO3、0.1g的酵母膏、0.05g的MgSO4·7H2O、0.1g的KH2PO4和100ml的H2O组成，pH值为7.0～7.2，121℃下蒸汽灭菌30min。用250ml三角瓶，每个三角瓶装入100ml培养基。从结果可以看出，该菌的生长温度范围广，最适的生长范围是45～65℃，在55℃时，24h菌密度就达到了峰值。
表2不同培养基、不同培养温度条件下NF705的生长状况
本实施方式中筛选出的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NF705，将其牛肉膏蛋白胨培养物点接于纤维素刚果红培养基平板和酪素培养基平板，3次重复，待菌液完全吸收，将平板倒置培养于55℃±2℃的恒温培养箱中，在20～48小时内，观察纤维素分解与酪蛋白分解产生的透明圈情况，并记录。
分解能力用Up代表，Up＝(D/d)2
相对酶活用A代表，A＝D/t
d-代表菌落的直径，cm
D-代表透明圈的直径，cm
t-代表透明圈产生的时间，d
培养基配方如下：
培养基1为纤维素刚果红培养基：由0.5g的KH2PO4、0.25g的MgSO4·7H2O、1.88g的微晶纤维素、2g的明胶、0.2g的刚果红、100ml的土壤浸出液、15g的琼脂和900m的H2O组成，pH值为6.5，121℃下蒸汽灭菌30min。
培养基2为酪素培养基：由10g的蛋白胨、1.0g的葡萄糖、5.0g的NaCl、0.1g的CaCl、0.1g的L-Tyr、5.0g的酪素、18g的琼脂和1000ml的H2O组成，pH值为7.2～7.4，121℃下蒸汽灭菌30min。结果见表3，水解透明圈的出现说明该菌具有分解纤维素和分解蛋白质的能力(其中羧甲基纤维素相对酶活性为1.56±0.11cm.d-1，蛋白酶相对活性1.28±0.2cm.d-1)，水解透明圈的大小，及水解圈出现的时间直观的反映该菌分解纤维素的能力和分解蛋白质的能力的大小，Up值大于3，说明分解能力强。
表3NF705分解纤维素与蛋白质的能力
| 培养基 | d(cm) | D(cm) | t(d) | Up | A |
| 1 | 0.63±0.05 | 1.42±0.1 | 0.91 | 5.03±0.3 | 1.56±0.11 |
| 2 | 0.58±0.06 | 1.28±0.2 | 1 | 4.82±0.51 | 1.28±0.2 |
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)NF705在固体培养基上最适生长温度为45～55℃，液体培养基上最适生长温度为58～62℃，最适生长pH值为4.5～8.5。其它与具体实施方式一相同。
Claims (1)
1.一株具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，其特征在于它为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)NF705，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No：4489，保藏日期为2010年12月17日。
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