CN114395516B - 一种地衣芽孢杆菌td-4及其生产蛋白酶的方法和应用 - Google Patents
一种地衣芽孢杆菌td-4及其生产蛋白酶的方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114395516B CN114395516B CN202210274694.2A CN202210274694A CN114395516B CN 114395516 B CN114395516 B CN 114395516B CN 202210274694 A CN202210274694 A CN 202210274694A CN 114395516 B CN114395516 B CN 114395516B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus licheniformis
- protease
- culture
- fermentation
- sludge
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 title claims abstract description 57
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 title claims abstract description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000009264 composting Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims abstract description 11
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 claims abstract description 6
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims abstract 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 7
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 claims description 4
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 3
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- VQKDLPNVPRIGCA-UHFFFAOYSA-M potassium;dihydrogen phosphate;heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[K+].OP(O)([O-])=O VQKDLPNVPRIGCA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 abstract description 8
- 239000002910 solid waste Substances 0.000 abstract description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 7
- 238000004064 recycling Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 9
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000008104 plant cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- PYLIXCKOHOHGKQ-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen phosphate;heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O PYLIXCKOHOHGKQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- ZNOKGRXACCSDPY-UHFFFAOYSA-N tungsten trioxide Chemical compound O=[W](=O)=O ZNOKGRXACCSDPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
- Y02W30/00—Technologies for solid waste management
- Y02W30/40—Bio-organic fraction processing; Production of fertilisers from the organic fraction of waste or refuse
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌TD‑4及其生产蛋白酶的方法和应用。所述地衣芽孢杆菌TD‑4的保藏编号为CGMCC NO.24154，该地衣芽孢杆菌TD‑4可用于制备蛋白酶。本发明提供的地衣芽孢杆菌TD‑4能在40℃~55℃的条件下正常生长，其产生的蛋白酶酶活可达到4732.55U/mL，应用于污泥稻壳粉混合堆肥后，其蛋白质含量下降50.51%，在污泥及畜禽粪便等固体废弃物资源化利用领域具有极大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌TD-4及其生产蛋白酶的方法和应用。
背景技术
稻壳、植物秸秆、污泥、畜禽粪便等有机固体废弃物中含有大量的植物纤维素，植物纤维素结构复杂且较难降解，很难有效实现资源化利用。现阶段，国内外对于有机固体废弃物高效稳定的资源化利用基本依靠生物法，利用微生物产生的纤维素酶降解纤维素，利用微生物产生的蛋白酶将蛋白质降解成小分子有机物制成生物肥料，有利于植物吸收。好氧堆肥是实现有机固体废弃物资源化利用的主流处理方式，堆肥腐熟是由微生物主导的生理生化过程，其前提是能够获取具有高效降解蛋白质和纤维素能力的微生物。有机固体废弃物堆肥腐熟过程常常伴随着放热，使堆肥内部的温度升高，能适应较高温度的产蛋白酶微生物在堆肥方面更具有优势。
目前的蛋白质降解菌效果不佳，蛋白质降解菌产酶量相对较少，特别指在堆肥内部温度升高后产酶能力下降明显，不能满足人们对高效蛋白酶菌种的要求。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种地衣芽孢杆菌TD-4及其生产蛋白酶的方法和应用，该菌株能在较高的温度下能生产高活性的蛋白酶，达到良好的蛋白质降解效果。为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案。
一种地衣芽孢杆菌TD-4，其分类名称为地衣芽孢杆菌TD-4（Bacillus licheniformis），于2021年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.24154；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
上述地衣芽孢杆菌TD-4，能在40℃~55℃的条件下正常生长，其产生的蛋白酶酶活可达到4732.55U/ml，应用于污泥稻壳粉混合堆肥中能将堆肥体中的蛋白质含量降低50.5%，在污泥或畜禽粪便等固体废弃物资源化利用领域具有极大的应用价值。
上述地衣芽孢杆菌TD-4的培养方法，在温度为40℃~55℃、pH为6.5~8.0、转速为180r/min~220r/min的培养条件下培养24h~48h。
优化的培养条件为：培养温度50℃，pH 7.0、转速200r/min。
上述优选的培养条件可以进一步提高地衣芽孢杆菌TD-4的繁殖速度和产蛋白酶效率。
利用上述地衣芽孢杆菌TD-4生产蛋白酶的方法，包括以下步骤。
步骤一：将所述地衣芽孢杆菌TD-4接种到LB培养基中进行培养，制成种子液；
步骤二：将生长至对数生长期的地衣芽孢杆菌TD-4种子液，按3%~5%的接种体积接种至发酵培养基中，在40℃~55℃、pH为6.5~8.0、转速为180r/min~220r/min的条件下培养48h~72h，得到含蛋白酶的发酵液。
优选地，上述制备方法的优化条件为：培养温度50℃，pH为7.0，转速200r/min。
优选地，所述步骤二中，每升所述发酵培养基中包括以下组分：葡萄糖2g，蛋白胨2g，碳酸钙2g，硫酸亚铁0.5g，硫酸铵1g，七水硫酸镁2g，磷酸氢二钾2g，七水磷酸二氢钾0.5g。
本发明还提供了所述地衣芽孢杆菌TD-4在降解蛋白质领域的应用。
所述地衣芽孢杆菌TD-4具有在高温条件下正常生长及合成蛋白酶的能力，可作为微生物菌种资源应用于污泥、稻壳和/或畜禽粪便堆肥等固体废弃物资源化利用领域。
本发明提供的蛋白酶生产方法简单、高效，将本发明提供的地衣芽孢杆菌TD-4种子液以4%的接种体积接种到发酵培养基中，在50℃下培养至48h时，经检测得到蛋白酶酶活可达到4732.55U/ml，应用于污泥稻壳粉混合堆肥后，堆肥体中的蛋白质含量下降50.51%，表明本发明生产方法得到的蛋白酶酶活高，在污泥、稻壳和/或畜禽粪便堆肥等固体废弃物资源化利用领域降低蛋白质物质具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明所述地衣芽孢杆菌TD-4的生长曲线。
图2为本发明所述地衣芽孢杆菌TD-4的菌落形态图。
图3为本发明所述地衣芽孢杆菌TD-4的菌株扫描电镜图。
图4为本发明所述地衣芽孢杆菌TD-4基于16S rDNA序列构建的系统发育树。
图5为本发明所述地衣芽孢杆菌TD-4在摇瓶水平发酵过程中蛋白酶活力变化曲线图。
图6为本发明所述地衣芽孢杆菌TD-4在堆肥过程中堆肥体中蛋白质降解率变化图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例所用培养基的配方及配制方法如下。
酪蛋白培养基：磷酸二氢钾0.36g，七水硫酸镁0.5g，氯化锌0.014g，七水磷酸氢二钠1.07g，氯化钠0.16g，氯化钙0.002g，硫酸亚铁0.002g，干酪素2g，胰蛋白胨0.025g，琼脂10g，蒸馏水1000mL，pH为7.2～7.4。
LB培养基：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸粉5g，蒸馏水1000mL。
发酵培养基：葡萄糖2g，蛋白胨2g，碳酸钙2g，硫酸亚铁0.5g，硫酸铵1g，七水硫酸镁2g，磷酸氢二钾2g，七水磷酸二氢钾0.5g，蒸馏水1000mL。
实施例1
1.1 菌株的筛选
采集样品：在牛粪好氧堆肥后的堆肥基质中深度0.5m取样。
样品预处理：取上述样品10g，加入到装有90mL无菌水的无菌三角瓶中，封口膜密封后，150r/min摇床上摇动20min，静置10min后取悬浮液得到菌悬液，备用。
梯度稀释：利用无菌水对上述菌悬液进行10倍梯度稀释，得到浓度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的菌悬液。
平板涂布：在超净操作台中，分别取10-5、10-6和10-7的菌悬液0.1mL滴加到酪蛋白培养基上，进行平板涂布分离，并将接种好的培养基50℃倒置培养48h~60h。
选定菌种：利用酪蛋白培养基，以菌株降解酪素形成的透明圈为初筛指标，筛选挑取水解圈较大的菌株于50℃培养基上进行划线纯化，并保存备用。
菌株的生长特性及鉴定
（1）菌株生长特性：
将1.1选定的菌株分别接种到pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB培养基（用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调整pH），50℃，摇床转速180r/min培养24h；测定在600nm处的OD值，得到该菌株生长的pH范围为6.5~8.0，最适合生长的pH为7.0。
将1.1选定的菌株接种到pH为7.0的LB培养基，分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的不同温度条件下，摇床转速180r/min培养24h；测定在600nm处OD值，得到该菌株生长的温度范围为40℃~55℃，最适合生长的温度为50℃。
将1.1选定的菌株接种到pH为7.0的LB培养基中，摇床转速分别设置150r/min、160r/min、170r/min、180r/min、190r/min、200r/min、210r/min、220r/min，在45℃摇床培养24h，测定在600nm处OD值，得到该菌株生长的摇床转速范围为180r/min~220r/min，最适合摇床转速为200r/min。
生长曲线测定：将1.1选定的菌株接种在pH为7.0的LB培养基，在50℃条件下，摇床转速200r/min培养48h，每隔2h取培养基，测定在600nm处OD值，绘制菌株的生长曲线，如图1所示，最适合培养时间为34h。
（2）菌株的鉴定
形态学鉴定：将1.1选定的菌株在LB培养基上培养24h后，菌落呈椭圆形扁平且边缘不整齐，白色不透明，表面粗糙褶皱，直径2.5mm~3.0mm，如图2所示。革兰氏染色为阳性，在显微镜下观察细胞形态和排列呈长杆状，产芽孢、有鞭毛，无荚膜，如图3所示。
生物学鉴定：细菌基因组DNA采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取，采用细菌16S rDNA通过引物27F和1492R进行PCR扩增；PCR产物由上海生工生物工程股份有限公司测序，测序结果显示所述的16S rDNA序列长度为1448bP，具体序列如序列表所示。
其中，PCR反应体系（25μL）如表1所示。
表1 PCR反应体系
| 试剂 | 体积（μL） |
| 10 X PCR Buffer | 2.5 |
| dNTP (each 10 mM) | 0.25 |
| Taq Plus DNA Polymerase（5 U/μl） | 0.25 |
| 50mM MgSO4 | 9.5 |
| 引物27F (10 µM) | 1 |
| 引物1492R (10 µM) | 1 |
| Template (DNA) | 1 |
| ddH2O | 9.5 |
上游引物的27F的序列为：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’（SEQIDNO:2）。
下游引物的1492R的序列为：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’（SEQIDNO:3）。
PCR扩增的条件见表2。
表2 PCR扩增条件
| 温度 | 时间 | 程序 |
| 95℃ | 5 min | 预变性 |
| 94℃ | 30 s | 30 cycle |
| 57℃ | 30 s | 30 cycle |
| 72℃ | 90 s | 30 cycle |
| 72℃ | 10min | 修复延伸 |
| 4℃ | ∞ | 终止反应 |
通过BLAST工具将扩增序列结果在NCBI网站上进行同源性比对分析，数据库比较分析发现，其16S rDNA序列与地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的同源性高达99%，同时基于16S rDNA序列构建的系统发育树，如图4所示，通过BLAST比对和系统发育树构建可知，上述分离所得的菌株在分类上属于地衣芽孢杆菌，因此将其命名为地衣芽孢杆菌TD-4（Bacillus licheniformis）。该菌株于2021年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.24154，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
利用实施例1筛选得到的地衣芽孢杆菌TD-4生产蛋白酶并测定酶活力。
2.1生产蛋白酶的方法
步骤一：将地衣芽孢杆菌TD-4接种到pH为7.0的LB培养基中，50℃、200r/min摇床中培养34h，制成种子液。
步骤二：将生长至对数生长期的地衣芽孢杆菌TD-4种子液，以4%接种量加入到发酵培养基中，50℃、200r/min摇床培养60h，制成发酵液。
步骤三、将发酵液在4℃、8000r/min条件下离心20min去除菌体，收集上清液得到含有蛋白酶的粗酶液。
2.2 蛋白酶活力的测定方法
根据《GB/T23527-2009》采用福林法测定蛋白酶活力，蛋白酶水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸，在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定吸光度，酶活力与吸光度成比例。
蛋白酶活力以蛋白酶活力单位表示，定义为1mL液体酶，在一定温度和pH条件下，1min水解酪蛋白产生1μmol的酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。
标准曲线：称取105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL为1mg/mL酪氨酸溶液。取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL为100μg/mL的L-酪氨酸标准贮备液。分别吸取0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mLL-酪氨酸标准贮备液于10mL比色管中，用蒸馏水定容至10mL。分别取上述溶液1.00mL，加入42.4g/L的碳酸钠溶液5.00mL、福林试剂1.00mL，振荡均匀于40℃水浴20min，用分光光度计于波长680nm下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。
取粗酶液1.00mL，40℃水浴2min后加入提前预热5min的10g/L酪蛋白溶液1.00mL，振荡均匀于40℃水浴10min后再加入65.4g/L三氯乙酸2.00mL，摇匀后静置10min，用慢速定性滤纸过滤后取1.00mL，加入42.4g/L碳酸钠溶液5.0mL、福林试剂1.00mL振荡均匀于40℃水浴20min，用分光光度计于波长680nm下测定吸光度。
空白：取粗酶液1.00mL，40℃水浴2min后先加入65.4g/L三氯乙酸2.00mL，振荡均匀于40℃水浴10min后再加入提前预热5min的10g/L酪蛋白溶液1.00mL，摇匀后静置10min，用慢速定性滤纸过滤后取1.00mL，加入42.4g/L碳酸钠溶液5.0mL、福林试剂1.00mL振荡均匀于40℃水浴20min，用分光光度计于波长680nm下测定吸光度。
每隔12h采用2.2的测定方法测定2.1中发酵液的蛋白酶含量，结果显示，在发酵0h、12h、24h、36h时，酶活力分别为0 U/mL、1106.82U/mL、2808.67U/mL、3921.94U/mL，48h时，蛋白酶酶活达到最高为4732.55U/mL，如图5所示。
实施例3
将实施例1筛选得到的地衣芽孢杆菌TD-4添加至污泥-稻壳粉混合堆肥中，测定堆肥中的蛋白质含量变化。
污泥-稻壳粉混合堆肥：污泥与稻壳粉按照重量4:1混合，含水率控制在65%左右，接种5%含有地衣芽孢杆菌TD-4的菌剂。曝气采用正压曝气，曝气量为0.9m3/h，以“通风30min-停10min”来进行间歇式曝气。堆肥过程中0d、3d、5d、8d、14d、21d进行翻堆取样，总反应时间为21d。
采用考马斯亮蓝法对堆肥体系中蛋白质的含量进行测定。
考马斯亮蓝G-250溶液配置：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%H3PO4，用超纯水稀释至1000mL，滤纸过滤。
标准曲线的绘制：分别取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL、2.4mL、2.8mL、3.2mL、3.6mL、4.0mL牛血清蛋白标准溶液于50mL比色管中，加蒸馏水至25mL左右，加5mL考马斯亮蓝G-250溶液，定容至50mL。摇匀后静置5min，于595 nm处检测。
称取10g上述堆肥样品，然后用蒸馏水与样品以10:1(V(ml):W(g))的比例在25℃条件下振荡1h后，在4000r/min下离心15min后弃去上清液，加0.05 mol/L，pH 7.9的Tris-HCl 缓冲液2mL，混匀洗涤后离心弃去上清液，重复上述操作，反复洗涤3次。
于上述离心管中加入1mol/L NaOH至10 mL处，摇匀，置于90℃中水浴5min，离心后收集上清液。取1mL上述上清液于50mL比色管中，加水至25mL处，加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，定容至50mL，于595nm处检测吸光度。
通过计算，地衣芽孢杆菌TD-4的添加可以将污泥稻壳粉混合堆肥中的蛋白质含量降低，在第21天时，堆肥中的蛋白质降解率为50.51%，如图6所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河北科技大学
<120> 一种地衣芽孢杆菌TD-4及其生产蛋白酶的方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1445
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌TD-4(Bacillus licheniformis)
<400> 1
catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggaccgacgg 60
gagcttgctc ccttaggtca gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta 120
agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgattga accgcatggt 180
tcaatcataa aaggtggctt ttagctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta 240
gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg 300
ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360
gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta 420
aaactctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag ggcggcacct tgacggtacc 480
taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540
gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa 600
gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag 660
agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa 720
ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc gaacaggatt 780
agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc 840
tttagtgctg cagcaaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa 900
actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960
acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac cctagagata gggcttcccc 1020
ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc 1140
taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc 1200
cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tgggcagaac aaagggcagc gaagccgcga 1260
ggctaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg 1320
tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380
ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc 1440
ttttg 1445
Claims (6)
1.一种地衣芽孢杆菌TD-4，其分类名称为地衣芽孢杆菌TD-4（Bacillus licheniformis），于2021年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.24154；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述地衣芽孢杆菌TD-4生产蛋白酶的方法，其特征在于：包括以下步骤，
步骤一：将所述地衣芽孢杆菌TD-4接种到pH 为7.0的LB培养基中进行培养，制成种子液；
步骤二：将生长至对数生长期的地衣芽孢杆菌TD-4种子液，按3%~5%的接种体积接种至发酵培养基中，在40℃~55℃、pH为6.5~8.0、转速为180r/min~220r/min的培养条件下培养48h~72h，得到含蛋白酶的发酵液。
3.根据权利要求2所述地衣芽孢杆菌TD-4生产蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤二中的优化培养条件为培养温度50℃、pH为7.0、转速200r/min。
4.根据权利要求2所述地衣芽孢杆菌TD-4生产蛋白酶的方法，其特征在于：每升所述发酵培养基中包括以下组分：葡萄糖2g，蛋白胨2g，碳酸钙2g，硫酸亚铁0.5g，硫酸铵1g，七水硫酸镁2g，磷酸氢二钾2g，七水磷酸二氢钾0.5g。
5.权利要求1所述地衣芽孢杆菌TD-4在降解蛋白质中的应用。
6.权利要求1所述地衣芽孢杆菌TD-4在污泥、稻壳和/或畜禽粪便堆肥中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210274694.2A CN114395516B (zh) | 2022-03-21 | 2022-03-21 | 一种地衣芽孢杆菌td-4及其生产蛋白酶的方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210274694.2A CN114395516B (zh) | 2022-03-21 | 2022-03-21 | 一种地衣芽孢杆菌td-4及其生产蛋白酶的方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114395516A CN114395516A (zh) | 2022-04-26 |
| CN114395516B true CN114395516B (zh) | 2024-01-26 |
Family
ID=81234229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210274694.2A Active CN114395516B (zh) | 2022-03-21 | 2022-03-21 | 一种地衣芽孢杆菌td-4及其生产蛋白酶的方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114395516B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102409005A (zh) * | 2011-03-25 | 2012-04-11 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一株具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌 |
| CN103451121A (zh) * | 2013-06-03 | 2013-12-18 | 华南理工大学 | 地衣芽孢杆菌及其应用 |
| CN103509739A (zh) * | 2013-08-06 | 2014-01-15 | 安徽工程大学 | 一种生产多酶系的地衣芽孢杆菌及其制备方法和应用 |
| CN108004169A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-05-08 | 广州王道生物科技有限公司 | 地衣芽孢杆菌zl-1及其应用 |
-
2022
- 2022-03-21 CN CN202210274694.2A patent/CN114395516B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102409005A (zh) * | 2011-03-25 | 2012-04-11 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 一株具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌 |
| CN103451121A (zh) * | 2013-06-03 | 2013-12-18 | 华南理工大学 | 地衣芽孢杆菌及其应用 |
| CN103509739A (zh) * | 2013-08-06 | 2014-01-15 | 安徽工程大学 | 一种生产多酶系的地衣芽孢杆菌及其制备方法和应用 |
| CN108004169A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-05-08 | 广州王道生物科技有限公司 | 地衣芽孢杆菌zl-1及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114395516A (zh) | 2022-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110452837B (zh) | 一株降解氨氮的漳州芽孢杆菌及其应用 | |
| CN111454865B (zh) | 微小杆菌及其应用 | |
| CN113481118B (zh) | 一株耐酸、耐盐、耐热、降解有机物的枯草芽孢杆菌及其在餐厨垃圾资源化中的应用 | |
| CN104164395A (zh) | 一种用于发酵产氢的拜氏梭菌及其发酵方法和应用 | |
| CN108504585B (zh) | 一种治理大气污染的苯降解菌及其制备方法和应用 | |
| CN114908014B (zh) | 促进溶解磷酸铁的油茶内生放线菌及其应用 | |
| CN104726366A (zh) | 一株高效脱氮除磷的反硝化聚磷菌及其应用 | |
| CN111961609A (zh) | 一种异养硝化-好氧反硝化菌剂及其应用 | |
| CN114164133B (zh) | 一种热反硝化地芽孢杆菌dc8菌株及其应用 | |
| CN109182181B (zh) | 一种降低畜禽粪便堆肥氨挥发的高温微好氧堆肥保氮菌及其应用 | |
| CN110452836B (zh) | 一株降解氨氮的养料嗜冷杆菌及其应用 | |
| CN110499264B (zh) | 一株降解油脂的蒙氏假单胞菌及其应用 | |
| CN114395516B (zh) | 一种地衣芽孢杆菌td-4及其生产蛋白酶的方法和应用 | |
| CN113913347B (zh) | 一种巴伦氏类芽孢杆菌tz-1及其应用 | |
| CN116200286B (zh) | 一株高效糖化纤维素的热纤梭菌及其应用 | |
| CN111621437B (zh) | 分离自猪场氧化塘的旱獭埃希氏菌lm-dk及其应用 | |
| CN103343097A (zh) | 一株固氮微球菌及其用途 | |
| CN114480223B (zh) | 一种热反硝化地芽孢杆菌hx-4及其生产纤维素酶的方法和应用 | |
| CN110791446B (zh) | 一种生态厕所处理菌种及其应用 | |
| CN116574644B (zh) | 一株Parageobacillus toebii PMBT002及其应用 | |
| CN116676212B (zh) | 一株Brevibacillus aydinogluensis PMBT001及其应用 | |
| CN109536412B (zh) | 一株异常球菌h-1及其在产生红色素中的应用 | |
| CN114134077B (zh) | 一株蚕沙来源的纤维素降解菌dc11及其筛选方法和应用 | |
| CN113717882B (zh) | 一种半乳糖地质杆菌bwtgw1.1及其应用 | |
| CN114058554B (zh) | 一种堆肥假单胞菌株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |