CN103509739A - 一种生产多酶系的地衣芽孢杆菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生产多酶系的地衣芽孢杆菌，应用该地衣芽孢杆菌能够在酸性环境下正常生长，且能够合成酯类物质，分解淀粉及蛋白质类物质。其保藏编号为：CGMCCNO.7484。本发明还提供上述地衣芽孢杆菌在产生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶中的应用；同时提供上述地衣芽孢杆菌在酯的合成和蛋白质水解制肽中的应用。本发明筛选到的地衣芽孢杆菌CGMCCNO.7484，能在酸性环境下培养产生酯酶、蛋白酶和淀粉酶，应用产生的酯酶能够制备增香酯类如：己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯等，应用蛋白酶能够制备蛋白水解肽。本发明的地衣芽孢杆菌CGMCCNO.7484可以作为大曲酒发酵过程中所使用的产酶微生物的备选。

Description

一种生产多酶系的地衣芽孢杆菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程中酶工程发酵技术领域，具体地，涉及一种生产多酶系的地衣芽孢杆菌。
背景技术
酯酶能水解酯类产生相应的酸和醇，也可以完成酯化、转酯、酯交换等反应，合成食品工业中很多重要的香味物质。在酒类、食醋、酱油和其他酿制食品的酿造中均可以利用酯酶催化产生的酯类来增进香味。我国是世界上重要的白酒生产大国，目前在利用红曲霉、根霉和球拟酵母等产生的酯酶，来增加白酒中的己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等4大类酯的含量，提高白酒优级率均取得较好进展，但对产酯酶细菌的筛选和应用的研究还鲜有报到。而且在大曲酒发酵过程中酒醅的酸度逐渐增大从而抑制了产酶微生物的正常代谢，造成酒醅中的淀粉和蛋白质残存较高。因此筛选在酸性条件下能正常生长同时能产生酸性酶系的微生物对提高酒醅原料中淀粉和蛋白质的利用率，增加酒的产出率，具有重要实际意义。
发明内容
本发明提供了一种生产多酶系的地衣芽孢杆菌，应用该地衣芽孢杆菌能够在酸性环境下正常生长，且能够合成酯类物质，分解淀粉及蛋白质类物质。
    本发明提供一种生产多酶系的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），将其于2013年4月18日送至位于北京市朝阳区北辰西路1号院的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.7484。
    进一步地，所述生产多酶系是所述地衣芽孢杆菌在同一培养条件下能同时产生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶。
    本发明所述地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484的酯酶酶活为11.5 U/ml。
    本发明所述地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484的酸性蛋白酶酶活为768 U/ml。
    本发明所述地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484的酸性淀粉酶酶活为11.995 U/ml。
    进一步地，所述培养条件为在酸性环境下培养。
    本发明的第二个目的是提供一种生产多酶系的地衣芽孢杆菌的筛选方法，是高温大曲在以三丁酸甘油酯为诱导底物、pH 5.0-6.0的平板上培养筛选获得；优选地，所述pH为 6.0，所述生产多酶系是所述地衣芽孢杆菌在同一培养条件下能同时产生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶。pH 5.0-6.0时，均能筛选得到产生酯酶、酸性蛋白酶和酸性淀粉酶的地衣芽孢杆菌，在pH为6.0时筛选得到的地衣芽孢杆菌产生酯酶、酸性蛋白酶和酸性淀粉酶的量最多。
本发明的第三个目的是提供上述地衣芽孢杆菌的扩大培养方法，是用培养基在pH为5.0-6.0的条件下培养的，优选地，所述pH为 6.0。pH为5.0-6.0之间时，均能完成对本发明的地衣芽孢杆菌的扩大培养，当pH为6.0时，扩大培养的效果最好。
    本发明的第四个目的是提供上述地衣芽孢杆菌在产生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶中的应用；优选地，所述应用是用培养基在pH为5.0-6.0的条件下培养所述地衣芽孢杆菌，优选地，所述pH为 6.0。
    本发明的第五个目的是提供上述地衣芽孢杆菌在酯的合成和蛋白质水解制肽中的应用。
本发明筛选到的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.7484，能在酸性环境下培养产生酯酶、蛋白酶和淀粉酶，应用产生的酯酶可以制备增香酯类如：己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯等，同时可以应用蛋白酶制备蛋白水解肽。可以作为大曲酒发酵过程中所使用的产酶微生物的备选。
附图说明
图1 为本发明的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）菌株的革兰氏染色照片；
图2 为本发明的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）菌株的芽孢染色照片；
图3 为本发明的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）菌株的酯酶筛选平板照片；
图4 为本发明的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）菌株的酸性淀粉酶筛选照片；
图5为本发明的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）菌株的酸性蛋白酶筛选照片。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。
一、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.7484的获得。
将高温大曲（取自安徽双轮酒业有限责任公司）研磨成粉状，准确称取25 g加入到含有200 ml的无菌生理盐水的锥形瓶中。加入灭菌的玻璃珠放入摇床（180r/min）室温下震荡打散30min后取出静置30min。取1 mL上清液并加入9mL无菌生理盐水，配制成10- 1菌悬液。依次类推，配制成10- 3、10- 4 ……10-7 的菌悬液，均匀涂布于已隔夜冷却的分离培养基（分离培养基的制备方法为：将牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂条20g，三丁酸甘油酯4ml，制霉菌素0.01g混合，加蒸馏水至1000mL，调pH为6.0，121℃，灭菌20min，得到分离培养基）平板上，将接种好的平板置于37℃恒温培养箱中培养48h。观察菌落周围有无透明圈出现，将有透明圈产生的菌落挑出并纯化至纯种4℃冰箱斜面保存。
将应用上述方法筛选到的最优菌株（透明圈最大）通过镜检和16SrDNA鉴定，证实与GenBank中公布的各种地衣芽孢杆菌的16SrDNA的同源性为99%，从而确定该菌株为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，将其于2013年4月18日送至位于北京市朝阳区北辰西路1号院的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.7484。 
二、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.7484的发酵培养。
从斜面上挑取地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.7484菌株到种子培养基（种子培养基的配方为：牛肉膏20.0g/L，葡萄糖20.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，( NH4)2SO4 1.0g/L，MgSO4.7H2O 1.0g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4.7H2O 0.01g/L，其余为蒸馏水，将以上配方混合，调pH至6.0，121℃，灭菌20min，制得种子培养基。）中培养，将用种子培养基培养到对数期的种子，按5%接种量加入到发酵培养基（发酵培养基的配方为：牛肉膏20.0g/ L，葡萄糖20.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，( NH4) 2SO4 1.0g/L，MgSO4.7H2O 1.0g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4.7H2O 0.01g/L，其余为蒸馏水，将以上配方混合，调pH至6.0，121℃，灭菌20min，制得发酵培养基。）中，然后置于37℃、150r/min条件下振荡培养72h。收集发酵液离心10min（12000r/min，4℃），取上清液及菌体以备检测。
三、 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.7484的酯酶酶活测定：
将步骤二中得到的的菌体用无菌生理盐水洗涤3次，并加灭菌后的玻璃珠震荡，利用显微计数法将菌体浓度调整为108个/L得到粗酶液，取粗酶液5ml加入到25ml的酯化液（酯化液由以下质量浓度的各组分混合制成：无水乙醇2%，己酸1.5%，酵母提取物0.1%）中30℃静置反应24h后，测定总酯的生成量，以己酸乙酯计。以加入5ml沸水灭活的粗酶液作对照。测得地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.7484的酯酶酶活为11.5 U/ml。酯酶酶活力单位定义：在此实验条件下，每小时生成1μmol己酸乙酯所需要的酶量为1个酶活力单位。
  将地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484涂在含有三丁酸甘油酯的培养基（培养基的配方：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂条20g/L，三丁酸甘油酯4ml/L，其余为蒸馏水；调pH为6.0，121℃，灭菌20min。）平板上，37℃恒温培养48h，长出的菌落见图3，因地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484能产生酯酶而分解其周围的三丁酸甘油酯形成水解透明圈。
四、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.7484的酸性淀粉酶测定：
用pH4.0的磷酸缓冲液配制质量百分比为1%的可溶性淀粉，取25ml的比色管加入3ml上述可溶性淀粉溶液37℃预热10min，加入同样预热的酶液0.5ml（步骤二中离心收集的上清液，即为酶液），准确反应10min后加入5ml HCL(0.01mol/L)终止反应。加入1.5mlDNS（3，5－二硝基水杨酸，3,5-Dinitrosalicylicacid ），沸水浴5min后，用蒸馏水定容至25ml，在A540nm处测定吸光度。每次试验做3个平行，以沸水浴灭活的等量酶液做对照。测得地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484的酸性淀粉酶酶活为11.995 U/ml。
酸性淀粉酶酶活定义：在本发明实验条件下，每分钟水解可溶性淀粉生成1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
将地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484涂在含有可溶性淀粉的培养基（培养基的配方为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂条20g/L，可溶性淀粉20g/L，其余为蒸馏水；调pH为5.0，121℃，灭菌20min）平板上，37℃恒温培养48h后，再在平板中加入1.0mL 1%I-KI溶液，并摇匀，产生的显色圈见图4。因地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484能产生淀粉酶而分解其周围的淀粉而呈现出碘色圈。
五、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.7484的酸性蛋白酶测定：
用pH4.0的磷酸缓冲液配制质量百分比为2.0%的酪蛋白溶液，取2ml酪蛋白溶液置于试管中30℃水浴10min，加入同样预热的酶液0.5ml（步骤二中离心收集的上清液，即为酶液）。准确反应10min后，从水浴中取出，立即加入质量百分比为10%三氯乙酸溶液3ml，静置15min，用滤纸过滤得到滤液。另取一支试管加入滤液和水各1ml，并加入碳酸钠（0.55mol/L）溶液5ml混合均匀后再加入福林试剂1ml，在30℃显色15min在A680nm测其吸光度，每个实验做3个平行，以沸水灭活的等量酶液做对照。测得地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484的酸性蛋白酶酶活为768 U/ml。
酸性蛋白酶酶活定义：在本发明实验条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为一个酶活力单位。
将地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484涂在含有酪蛋白的培养基（培养基的配方为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂条20g/L，酪蛋白20g/L，其余为蒸馏水；调pH为5.0，121℃，灭菌20min）平板上，37℃恒温培养48h，长出的菌落见图5，因地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484能产生蛋白酶而分解其周围的酪蛋白形成水解晕圈。
六、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.7484产生的酯酶合成酯性能实验
分别取步骤三中制备的粗酶液5ml加入到25ml的酯化液1、酯化液2和酯化液3（酯化液1由以下质量浓度的各组分混合制成：无水乙醇2%，己酸1.5%，酵母提取物0.1%；酯化液2由以下质量浓度的各组分混合制成：无水乙醇2%，乙酸1.5%，酵母提取物0.1%；酯化液3由以下质量浓度的各组分混合制成：无水乙醇2%，乳酸1.5%，酵母提取物0.1%）中，30℃静置反应24h后，测定总酯的生成量分别为6.63g/L、3.45g/L、6.00g/L。实验说明了可以用本发明的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.7484产的酯酶制备增香酯类。
七、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.7484产生的蛋白酶水解大米蛋白实验：
在50ml用pH4.0的磷酸缓冲液配制的质量百分浓度为10%的大米蛋白溶液中，加入10mL按步骤二制备的上清液，混匀，置于40℃水浴中进行水解，水解5h，反应中每隔20min滴加0.5mol/L的NaOH维持pH值，待反应结束后，将反应体系加热到100℃灭酶，保持5min，终止反应，得到水解蛋白液。
用甲醛法测定水解度：取水解蛋白液10ml于小烧杯中，加入30ml去CO2蒸馏水并磁力搅拌，用精密pH计指示其pH值，用0.5mol/L NaOH滴至pH=8.2，并加入已中和好的甲醛溶液（pH=8.2）10ml，记录将其pH值滴至8.2时所耗0.5mol/L NaOH的ml数，并作空白试验。实验测得蛋白水解度为24.33%。实验证明，可以用本发明的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.7484产的酸性蛋白酶制备蛋白水解肽。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生产多酶系的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），其保藏编号为：CGMCC NO.7484。
2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述生产多酶系是所述地衣芽孢杆菌在同一培养条件下能同时产生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶。
3.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484的酯酶酶活为11.5 U/ml。
4.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484的酸性蛋白酶酶活为768 U/ml。
5.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌CGMCC NO.7484的酸性淀粉酶酶活为11.995 U/ml。
6.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌，其特征在于：所述培养条件为在酸性环境下培养。
7.一种生产多酶系的地衣芽孢杆菌的筛选方法，是高温大曲在以三丁酸甘油酯为诱导底物、pH 5.0-6.0的平板上培养筛选获得；优选地，所述pH为 6.0，所述生产多酶系是所述地衣芽孢杆菌在同一培养条件下能同时产生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶。
8.权利要求1-6任一所述的地衣芽孢杆菌的扩大培养方法，是用培养基在pH为5.0-6.0的条件下培养的；优选地，所述pH为 6.0。
9.权利要求1-6任一所述的地衣芽孢杆菌在产生酯酶，酸性蛋白酶和酸性淀粉酶中的应用；优选地，所述应用是用培养基在pH为5.0-6.0的条件下培养所述地衣芽孢杆菌；更优选地，所述pH为 6.0。
10.权利要求1-6任一所述的地衣芽孢杆菌在酯的合成和蛋白质水解制肽中的应用。
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