CN116083307A - 一种生产酯酶和酯类化合物的格氏乳球菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种生产酯酶和酯类化合物的格氏乳球菌及其应用。本发明提供了一种格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)S5‑4，其保藏编号为GDMCCNo：63054。该格氏乳球菌S5‑4菌株耐温性和葡萄糖耐受性佳，能应用于高温和高碳源的发酵体系，不仅可以产酯酶，也具有产乙酸乙酯和乳酸乙酯的功能，产量高，发酵时间短，在产酯酶和酯类化合物的微生物发酵合成以及大曲的高效应用上具备较好的应用前景。

Description

一种生产酯酶和酯类化合物的格氏乳球菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种生产酯酶和酯类化合物的格氏乳球菌及其应用。
背景技术
酯酶(EC 3.1.1.1)，也称酯化酶，是脂肪酶、酯合成酶、酯分解酶、磷酸酯酶的统称，具有催化多种底物的裂解和酯键形成的功能。酯酶一般被用于提升白酒品质，以及作为食品工业的催化剂，比如黄油制造、奶酪增香剂和合成风味酯，同时还可以应用于化妆品、制药和造纸等领域。在白酒的酿造过程中，酯酶可以促进己酸乙酯等酯类物质的生成，增强白酒风味，提升白酒品质。
中国白酒是世界六大蒸馏酒之一，其中的浓香型白酒在市场上极受欢迎。浓香型白酒的生产是一个涉及复杂微生物群落的自发过程，浓香型白酒的独特之处来源于酯类、醇类化合物的作用，包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等。在白酒酿造过程中，酯类化合物的生成主要是通过微生物分泌的胞外酶将周围环境中的有机酸和醇类物质催化途径。
目前，有化学合成和微生物发酵法两种生产方式来获得酯类化合物。相比较而言，微生物发酵法对环境影响较小，成本低廉，符合当下绿色发展的主题。并且，微生物群落之间的相互作用是发酵的主要驱动力，研究微生物群落之间的相互作用，不仅有助于了解浓香型白酒酿造过程中微生物群落间的相互作用，而且复合培养时也会产生各种风味化合物，尤其是乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯等酯类化合物。但目前利用微生物发酵生产酯酶和酯类化合物的产量都不高，发酵时间较长，且用曲量较大，生产效率较低。
发明内容
本发明提供一种生产酯酶和酯类化合物的格氏乳球菌及其应用。本发明的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4不仅自身可以产生酯酶，而且在短期内发酵还可以自身合成酯类化合物，为酯类物质的微生物发酵生产提供思路；该格氏乳球菌(Lactococcusgarv i eae)S5-4的产酯酶能力强，且酯酶的活性高，可有效的缩短白酒的发酵时间，减少用曲量，提高白酒生产效率。
本发明的目的是提供一株酯酶产量高的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4，经鉴定为格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)，菌株名为S5-4，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63054，保藏日期为2022年12月16日。
该格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4菌株从四川省某浓香型白酒厂大曲中筛选分离得到，对其菌落生长特征、光学显微镜细胞形态特征和电子显微镜形态进行分析，随后进行16S rDNA测序，将拼接结果提交至美国国家生物信息中心(Nat i ona lCenter for Bi otechno l ogy I nformat i on，NCBI)的GenBank数据库中进行B l ast同源性比对搜索，选择同源性较高的模式菌株的16S rDNA基因序列使用MEGA11.0软件，选择邻接(Ne i ghbor－jo i n i ng,NJ)法构建系统进化树。经以上分析，鉴定该菌株为格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)，且命名为格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4。
格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的形态：
将该格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4接种在种子培养基琼脂平板中，35℃培养24h，观察菌株菌落形态，可见格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4菌落为乳白色，表面光滑，菌落规则，表面光滑，边缘整齐，中间低凸起，菌落周围与边缘颜色一致，不透明，质地湿润粘稠；在光学显微镜下，放大100×10倍观察格氏乳球菌(Lactococcusgarv i eae)S5-4的细胞形态，菌体呈圆状，无芽孢，为革兰氏阳性菌；在扫描电子显微镜下，放大15000倍观察格氏乳球菌S5-4，单个菌体呈球状，无芽孢，以二分裂方式增殖。
本发明还提供了一种微生物菌剂，优选的，所述微生物菌剂中含有上述的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4；进一步优选的，微生物菌剂包括格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的发酵液、或格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的裂解物、或格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的冻干粉。
在本发明的一种实施方式中，优选的，上述微生物菌剂为固态制剂或液态制剂。
本发明还提供了一种组合物，优选的，所述组合物中含有上述的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4活菌株、格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4干菌株、格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4代谢物、灭活的格氏乳球菌(Lactococcusgarv i eae)S5-4中的任意一种或任意几种。
在本发明的一种实施方式中，所述格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4在微生物菌剂的OD600nm值≥1.2。
本发明还提供了上述的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4或上述的微生物菌剂在生产酯酶和制备酯类化合物中的应用。
本发明还提供了一种用于上述的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4生产酯酶的培养基，优选的，所述培养基由以下原料制成：
葡萄糖10～30g/L、牛肉膏10～30g/L、氯化钠2～8g/L、K2HPO40.1～2g/L、(NH4)2SO40.1～2g/L，MgSO4·7H2O 0.1～2g/L，FeSO4·7H2O 0.001～0.02g/L，所述酯酶培养基的pH＝7.0。
本发明还提供了一种生产酯酶的方法，优选的，将上述的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4种子液添加至上述的用于上述的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4生产酯酶的培养基中发酵制备得到含有酯酶的发酵液。
在本发明的一种实施方式中，含有酯酶的发酵液发酵制备过程，发酵条件为：28℃下有氧发酵3d。
在本发明的一种实施方式中，含有酯酶的发酵液中含有且不限于酯化酶。
在本发明的一种实施方式中，含有酯酶的发酵液发酵制备过程，所用水均为去离子水。
在本发明的一种实施方式中，含有酯酶的发酵液发酵制备过程，培养基的初始pH＝7.0.
在本发明的一种实施方式中，含有酯酶的发酵液发酵制备过程，格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的添加量为5％，菌体OD600nm≥1.2。
本发明还提供了一种用于上述格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4生产酯类化合物的培养基，优选的，所述培养基由以下质量浓度的原料制成：
葡萄糖10～30g/L、氯化钠2～8g/L、酵母膏2～8g/L、蛋白陈5～15g/L、牛肉膏5～15g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.2～0.8g/L、乙酸钠1～5g/L、淀粉0.1～2g/L、1％生物素20～30g/L和乙醇20～70g/L。
本发明还提供了一种生产酯类化合物的方法，优选的，将上述的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4种子液添加至上述的用于上述格氏乳球菌(Lactococcusgarv i eae)S5-4生产酯类化合物的培养基中发酵制备得到含有酯类化合物的发酵液。
在本发明的一种实施方式中，含有酯类化合物的发酵液发酵制备过程，发酵条件为：35℃下厌氧发酵15d。
在本发明的一种实施方式中，含有酯类化合物的发酵液中含有且不限于乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯的酯类化合物中。
在本发明的一种实施方式中，含有酯类化合物的发酵液发酵制备过程，所用水均为去离子水。
在本发明的一种实施方式中，含有酯类化合物的发酵液发酵制备过程，培养基的初始pH＝6.8。
在本发明的一种实施方式中，含有酯类化合物的发酵液发酵制备过程，格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的添加量为5％，菌体OD600nm≥1.2。
在本发明的一种实施方式中，上述含有酯类化合物的发酵液中酯类化合物的含量通过GC-MS法进行检测。
在本发明的一种实施方式中，优选的，GC-MS法检测的条件：
气相色谱条件：DB-WAX U I谱柱(30mm×0.25mm，0.25μm)，程序升温40℃保持1min，以20℃/mi n升高至150℃，再以10℃升高至250℃保持2mi n。分流比30:1，载气为氦气(He)，流速1mL/mi n，氢气(H2)40mL/mi n，氧气(O2)300mL/mi n，检测器为火焰离子检测器；
质谱条件：电子电离源，传输线温度250℃，电子能量为70eV，光电倍增管电压为350V，质量扫描范围为30～350amu。
本发明还提供了一种产品，优选的，所述产品中含有上述的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包括但不限于含有格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的食品添加剂、含有格氏乳球菌(Lactococcus garv ieae)S5-4的乳制品、含有格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的窖泥强化剂、含有格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的白酒风味调和剂、含有格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的生物燃料和含有格氏乳球菌(Lactococcus garv ieae)S5-4的药物中的任意一种。
本发明的有益效果是：
1、本发明从大曲中筛选得到一株格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4，其在液态发酵下生产的酯酶活性好，酯酶的酶活力为15.74±0.03U/mL。
2、本发明将格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的种子液接种至生产酯类化合物的培养基，厌氧发酵15d后，乙酸乙酯的产量可达到0.345±0.16g/L、乳酸乙酯可达到0.2983±0.23g/L，具有优异的生产酯类化合物的能力。
3、利用微生物发酵法生产酯类化合物，避免化学合成造成的污染，秉承了可持续发展的原则，有良好的运用前景。
生物材料保藏
一株格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4，分类学命名为：Lactococcusgarv i eae，已于2022年12月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：63054。
附图说明
图1为本发明格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的菌落形态图；
图2为本发明格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4在光学显微镜下的细胞形态图；
图3为本发明格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4在扫描点子显微镜下的个体形态图；
图4为本发明格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的系统进化图；
图5为本发明格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的温度耐受性图；
图6为本发明格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的pH耐受性图；
图7为本发明格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的葡萄糖耐受性图；
图8为为本发明格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的乙醇耐受性图；
图9为本发明格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的丁酸耐受性图；
图10为本发明格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的己酸耐受性图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并未旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯含量的检测：
将格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4接种到用于格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4生产酯类化合物的培养基中，在35℃厌氧的条件下培养发酵得到含有酯类化合物的发酵液；发酵结束后，用一次性的注射器吸取适量发酵液过0.2μm滤膜，过滤；取1mL滤液装于进样瓶中，加入10μL的2-乙基丁酸，采用内标法通过GC-MS进行定性定量分析。测定含有酯类化合物的发酵液中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯的情况。每个样品做三组平行。
气相色谱条件：DB-WAX UI谱柱(30×0.25mm，0.25μm)，程序升温40℃保持1mi n，以20℃/mi n升高至150℃，再以10℃升高至250℃保持2mi n。分流比30:1，载气为氦气(He)，流速1mL/mi n，氢气(H2)40mL/mi n，氧气(O2)300mL/mi n，检测器为火焰离子检测器。
质谱条件：电子电离源，传输线温度250℃，电子能量为70eV，光电倍增管电压为350V，质量扫描范围为30～350amu。
实施例1：菌种筛选
1、格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)S5-4菌株的分离筛选
菌种原料：四川某浓香型酒厂大曲不同层次的样品，封装并冷藏；
筛选培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，乳化液20％，制霉菌素工作浓度25μg/mL，自然pH；其中，乳化液为3％聚乙烯烯醇和三丁酸甘油酯按体积比4:1制成。
筛选方法：将大曲样品混匀并研磨成细粉，称取5g样品与45mL无菌水中，振荡2h，静置30mi n；吸取上清液并稀释为10-1～10-7菌悬液，移取100μL凸部于筛选培养基平板上，每个梯度涂布3个平行，在37℃恒温培养箱中培养3-5d，同时观察菌落周围产生透明圈的情况并记录，将透明圈较大的菌落在筛选培养基上划线分离至纯种。
由于菌株的酯酶酶活力可以通过透明圈菌落直径(D/d)的大小来反应，通过比较不同透明圈的菌落直径大小；本实施例中，筛选出一株产酯酶酶活力较高的菌株，将其命名为S5-4,其D/d值为2.27。
2、菌落形态及菌株分子生物学鉴定
(1)菌落形态、特征观察
将筛选出的产酯酶酶活力最高的菌株S5-4进行形态学鉴定，观察菌落大小、表面形态、边缘形状、质地等并记录。
菌株S5-4经固体培养基培养1d后，其菌落形态如图1所示，可见菌株S5-4的菌落为乳白色，表面光滑，菌落规则，边缘整齐，中间低凸起，菌落周围与边缘颜色一致，不透明，质地湿润粘稠。
(2)光学显微镜观察菌株S5-4的细胞形态
挑取平板培养至对数期的菌株S5-4的纯菌落，采用革兰式染色法染色，在光学显微镜下观察细胞形态，如图2所示。
图2中，可见经革兰式染色后，在100×10倍油镜下观察细胞形态为蓝紫色，表明菌株S5-4为革兰式阳性菌，呈圆状，无芽孢。
(3)在扫描电子显微镜下观察菌株S5-4的个体形态
菌株S5-4的种子液培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，自然pH。
采用种子液培养基培养菌株S5-4至对数期，取培养至对数期的菌株S5-4的种子液于5000rmp条件下离心5mi n、弃上清液、收集足量的菌体；以40倍体积加入2.5％的戊二醛溶液在4℃下固定4～12h。离心，用已提前4"C冷藏的0.1mo l/L磷酸缓冲液清混匀，清洗2～3次，5mi n/次；再次离心，保留菌体；分别用30％、40％、50％、70％、80％、90％、100％的乙醇溶液逐级脱水，各一次15mi n，随后5000rmp下离心5mi n，保留菌体；最后用1:1的乙醇-叔丁醇置换2次，每次20mi n，离心后保留菌体，最后加入等体积的叔丁醇混匀，放入-80℃冰箱中预冷冻20mi n以上，再放入真空冷冻干燥器内干燥8h以上，直至完全干燥，取出备用；取适量样品喷金，进行扫描电子显微镜(Scann i ng E l ectron Microscope，SEM)观察，记录菌株S5-4在放大15000倍的个体形态，如图3所示。
图3中，可见菌株S5-4呈圆球形，无芽孢，以二分裂方式增殖。
(4)菌株S5-4的分子生物学鉴定
将目的菌株S5-4在固体培养基上划线至培养出单菌落，培养1d后送至南京派森诺有限公司进行菌种鉴定。菌种鉴定采用采用16SrDNA测序，步骤如下：采用细菌通用引物27F、1492R对目的菌株S5-4的16SrDNA基因序列进行PCR扩增，将拼接结果提交至美国国家生物信息中心(Nat i ona l Center for B i otechno l ogy I nformat i on，NCBI)的GenBank数据库中进行B l ast同源性比对搜索，选择同源性较高的模式菌株的16S rDNA基因序列使用MEGA11.0软件，选择邻接(Ne i ghbor－jo i n i ng,NJ)法构建系统进化树。
提取菌株S5-4的DNA进行PCR扩增，扩增得到的电泳图无拖尾，分子量大小为2000bp。上机测序后，其基因序列为：
CGGGTTTAGGGGGGCTGCTATACATGCAGTCGAGCGATGATTAAAGATAGCTTGCTATTTTTATGAAGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAATCTGCCGAGTAGCGGGGGACAACGTTTGGAAACGAACGCTAATACCGCATAACAATGAGAATCGCATGATTCTTATTTAAAAGAAGCAATTGCTTCACTACTTGATGATCCCGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAGTGTAAAGGACTACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACGTTAAGTAGAGTGGAAAATTACTTAAGTGACGGTATCTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTAAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGAGGCGAAAGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTAGGGAGCTATAAGTTCTCTGTAGCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCGTGCTATCCTTAGAGATAAGGAGTTCCTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCCAACCCGCGAGGGTGCGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGAAGTTGGGAGTACCCAAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTCCTAAGTAGACCCCATGCGG。
将以上基因序列在NCBI当中进行比对，将同源性较高的序列下载后利用MEGA11.0进行分析，采用NJ法构建系统发育树，菌株S5-4的系统发育树如图4所示。
经以上鉴定，确定菌株S5-4为格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)，菌株名为S5-4，命名为格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4，该格氏乳球菌(Lactococcusgarv i eae)S5-4保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63054，保藏日期为2022年12月16日。
实施例2：格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的耐受性试验
发酵培养基：葡萄糖20g/L，牛肉膏20g/L，氯化钠5g/L，K2HPO41 g/L，(NH4)2SO41 g/L,MgSO4·7H2O 1g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH＝7.0。
1、格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的温度耐受性试验
将实施例1得到的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的种子液接种至发酵培养基上，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃培养箱中，于180r/mi n培养3d，分别测定OD600nm值(以波长600nm处的OD值作为指标)，考察格氏乳球菌(Lactococcusgarv i eae)S5-4的温度耐受性。
格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的温度耐受性结果如图5所示。根据图5，可见随着温度的升高，菌体浓度先略微上升；在温度为35℃时，OD600nm值为8.1左右，此时菌株生长良好；温度升高至50℃时，OD600nm值有所下降，但依然稳定在7.5左右。结果表明，格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的温度耐受性良好，可以适应不同季节和环境下大曲在浓香型白酒生产上的应用。
2、格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的pH耐受性
将实施例1得到的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的种子液接种至发酵培养基中，调整pH值至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在180r/mi n、28℃摇床下培养3d，分别测定OD600nm值(以波长600nm处的OD值作为指标)，判断格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的pH耐受性。
格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的pH耐受性结果如图6所示。根据图6，可见随着pH的不断升高，格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的OD600nm值先升高后下降；在pH＝1.0时，OD600nm值为0.2；在pH＝6.0时，OD600nm值最高，OD600nm值为5.8；在pH＝10.0时，OD600nm值为2.8；表明，格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4在强酸性环境下难以较好的生长，但在弱酸性的环境下，生长情况良好。
3、格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的葡萄糖耐受性
将实施例1得到的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的种子液分别接种至葡萄糖浓度为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L的发酵培养基(除葡萄糖外，其余原料的浓度不变)中，在180r/mi n、28℃下培养3d，分别测定OD600nm值(以波长600nm处的OD值作为指标)，判断格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的葡萄糖耐受性。
格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的葡萄糖耐受性结果如图7所示。根据图6，可见葡萄糖含量为10-40g/L时的OD600nm值随葡萄糖含量增长，OD600nm值最大为8.1；随后随着葡萄糖含量增长，OD600nm值逐渐下降，在葡萄糖含量上升到80g/L，OD600nm为7.4，格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4依然可以良好的生长；表明，格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4对葡萄糖含量有着极好的耐受性。
4、格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的乙醇耐受性
将实施例1得到的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的种子液接种至发酵培养基上，以发酵培养基质量(100％)计，向发酵培养基中分别加入乙醇，不同发酵培养基的乙醇浓度分别为:0％(空白)、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％，乙醇使用前过0.22μm的滤膜除菌，每组3个平行；在180r/mi n、28℃下培养3d，取OD600nm值(以波长600nm处的OD值作为指标)的平均值。
格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的乙醇耐受性结果如图8所示。图8中，可见在乙醇浓度为0％时，OD600nm值为4.0；随着乙醇浓度的提高，OD600nm值有所下降；在乙醇浓度为10％时，OD600nm值接近为0；表明，格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4对乙醇具有较好的耐受性。
5、格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的丁酸耐受性
将实施例1得到的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的种子液接种至不同丁酸浓度的发酵培养基中，不同发酵培养基的丁酸浓度分别为0g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L，在180r/mi n、28℃下培养3d，测定其发酵液的OD600nm值，确定其在不同丁酸浓度的发酵培养基中的生长情况。
格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的丁酸耐受性结果如图9所示。图9中，可见格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4在丁酸浓度为0时，生长情况最好，OD600nm值4.9；当丁酸浓度增加到5g/L时，OD600nm值急剧下降到1.0；但此后，格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的生长情况缓慢下降，直至丁酸浓度为15g/L时，其OD600nm值依然在0.5。
6、格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的己酸耐受性
将实施例1得到的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的种子液接种至不同己酸浓度的发酵培养基中，不同发酵培养基的己酸浓度分别为0g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L，在180r/mi n、28℃下培养3d，测定发酵液的OD600nm值。
格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的己酸耐受性结果如图10所示。图10中，可见格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4对己酸浓度较为敏感；在己酸浓度上升至1g/L后，OD600nm值下降到0.5左右，但在己酸含量为5g/L时，格氏乳球菌(Lactococcusgarv i eae)S5-4依然在生长。
实施例3：格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的产酯酶能力
1、粗酶液的制备
种子液培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，自然pH
勾取一环已保存的纯种菌株接种于25mL种子液培养基中，在180r/mi n、37℃摇床培养24h，同上条件连续活化三次，得到菌悬液；吸取0.8mL菌悬液于装有1mL50％甘油的甘油管中，置于-80℃冰箱中保存菌种，并做好斜面保藏；同时，转接5mL菌悬液于50mL发酵培养基中，在180r/mi n、37℃下培养培养2d发酵后，吸取4mL发酵液，在5000r/mi n离心10min，将上清液作为粗酶液保存在4℃条件下，备用。
2、酯酶酶活力测定
取4mL的3％聚乙烯醇-三丁酸甘油酯乳化液与5mL磷酸缓冲溶液(0.025mo l/L，pH＝7.5)于锥形瓶中混匀，将锥形瓶置于40℃水浴锅中预热5mi n，加入1mL提前制备好的粗酶液，反应15mi n后取出锥形瓶，再加入15mL的95％乙醇，滴加2～3滴5g/L酚酞指示剂，最后用NaOH标准溶液(0.05mo l/L)滴定，空白组加入等量灭菌后的无菌水。
酶活力计算公式为：
Figure BDA0004047621670000151
其中，V1表示滴定消耗的NaOH溶液体积；V2表示空白对照消耗的NaOH溶液体积；n表示粗酶液的稀释倍数；t表示反应时间。
依据上述酶活力计算公式，得到格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4产酯酯酶的酶活力结果为：15.74±0.03U/mL。
实施例4：格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的发酵制备酯类化合物
1、格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4的活化
将实施例3中甘油管保存的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4接种于装有10mL种子液培养基的的试管中，在180r/mi n、28℃的摇床中活化12h后，再转接于装有100mL种子液培养基的150mL摇瓶中，在180r/mi n、28℃条件下二次活化12h，得到格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4种子液，备用。
2、生产酯类化合物的产酯培养基配置
产酯培养基：葡萄糖20g，氯化钠5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，乙酸钠3g，淀粉1g，1％生物素20g
其他原料：乙醇50g，蒸馏水1000mL；
其中，产酯培养基的pH＝6.8，并在121℃灭菌20mi n；乙醇和1％生物素需要过0.22μm滤膜除菌。
3、酯类化合物的制备
将上述种子液接种5％于含有100mL产酯培养基的厌氧发酵瓶中，在35℃下厌氧静置发酵10d；此后，取出发酵瓶，向其中加入2mL已过滤除菌的乙醇和2mL1％的生物素，继续发酵5d；
将上述发酵15d的厌氧瓶终止发酵，用5mL注射器吸取适量发酵液过0.22μm滤膜，然后移取1mL装入气相色谱瓶，加入10μL的2-乙基丁酸，混匀后，利用GC-MS测定发酵液酯类化合物的含量，结果如表1所示。
表1
酯类化合物 乙酸乙酯 乳酸乙酯
产量(g/L) 0.3450±0.16 0.2983±0.23
结果显示，本发明的格氏乳球菌(Lactococcus garv i eae)S5-4在液态发酵时能够高产酯类化合物，尤其是乙酸乙酯和乳酸乙酯。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)S5-4，其保藏编号为GDMCCNo：63054。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)S5-4、或格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)S5-4裂解物。
3.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的格氏乳球菌S5-4活菌株、格氏乳球菌S5-4干菌株、格氏乳球菌S5-4代谢物、灭活的格氏乳球菌S5-4中的任意一种或任意几种。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物中格氏乳球菌S5-4的OD600nm值≥1.2。
5.一种权利要求1所述的格氏乳球菌S5-4或权利要求2所述的微生物菌剂在生产酯酶和制备酯类化合物中的应用。
6.一种用于权利要求1所述的格氏乳球菌S5-4生产酯酶的培养基，其特征在于，所述培养基由以下原料制成：葡萄糖10～30g/L、牛肉膏10～30g/L、氯化钠2～8g/L、K2HPO40.1～2g/L、(NH4)2SO40.1～2g/L，MgSO4·7H2O0.1～2g/L，FeSO4·7H2O0.001～0.02g/L，所述酯酶培养基的pH＝7.0。
7.一种生产酯酶的方法，其特征在于，将格氏乳球菌S5-4种子液添加至权利要求6所述的培养基中发酵制备得到含有酯酶的发酵液。
8.一种用于权利要求1所述的格氏乳球菌S5-4生产酯类化合物的培养基，其特征在于，所述培养基由以下质量浓度的原料制成：
葡萄糖10～30g/L、氯化钠2～8g/L、酵母膏2～8g/L、蛋白陈5～15g/L、牛肉膏5～15g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.2～0.8g/L、乙酸钠1～5g/L、淀粉0.1～2g/L、1％生物素20～30g/L和乙醇20～70g/L。
9.一种生产酯类化合物的方法，其特征在于，将格氏乳球菌S5-4种子液添加至权利要求8所述的培养基中发酵制备得到含有酯类化合物的发酵液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述酯类化合物包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯中的任意一种或任意几种。
11.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的格氏乳球菌S5-4；所述产品包括食品添加剂、乳制品、窖泥强化剂、白酒风味调和剂、生物燃料和药物。
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