JP2005516585A - 共培養による没食子酸の調製法 - Google Patents
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Abstract
Description
糸状菌であるリゾプス・オリーゼ(RO IIT RB 13,NRRL−21498)およびアスペルギルス・フェティドゥス(GMRB013)の2つの株を、カラグブールキャンパス(Kharagpur Campus)のI.I.Tの土壌から、釣餌(baiting)技術によって分離した。これらの微生物を、2%麦芽エキス寒天斜面に維持した。
麦芽エキス寒天(MEA)培地100mlを滅菌した。滅菌後、これの5mlを、滅菌した試験管に移し、斜めにして冷却させた。凝固した後、滅菌した斜面に1:1の比のリゾプス・オリーゼ(RO IIT RB 13,NRRL−21498)とアスペルギルス・フェティドゥス(GMRB013)の純粋培養株を画線培養によって接種し、30℃で72〜96時間インキュベータ内に保持した。
タンナーゼは適応酵素であるので、あらかじめ誘導された種菌を調製する必要がある。2%タンニン酸の入ったCzapekdox培地50mlを、100mlのコニカルフラスコに入れた。次いで、これを121℃で15分間滅菌し、培養斜面からの胞子懸濁液2mlを接種した。その後、これを、振盪条件下で、30℃で72時間、BODインキュベータ内に保持した。その後のSSFの研究のために、この誘導された種菌を使用した。
発酵は、改良されたトレータイプのリアクター内で、改良固体発酵の回分プロセスで実施した。
有機溶媒である酢酸エチルを用いて、没食子酸を単離した。発酵した材料を取り出し、水を加え、約60〜70℃に加熱した(没食子酸は、この温度で可溶性であり、冷水には可溶性でないため)。次いで、これを、室温に冷却した。その後、これに有機溶媒を加え、この混合物全体を、分液漏斗に入れた。この混合物を、勢い良く振ることによって直ちに完全に混合した。没食子酸は、有機溶媒に可溶であるので、有機相に移り、残りの物質は、水相に残る。水相を捨て、有機層を収集した。没食子酸が完全に有機層に移動するまでこのプロセスを続けた。次に、収集された量の有機層を、酢酸エチルからの没食子酸の分離のために、真空ロータリーエバポレータに入れた。この分離を行った圧力および温度は、200mbarおよび70℃であった。あるいは、ジエチルエーテルを用いて酢酸エチル層を抽出し、エーテル層を、ロータリーエバポレータで蒸発させて、純粋な没食子酸を得た。得られた没食子酸の収率は、65.4〜94.8%であることが判明した。最大量の没食子酸を生成するため、様々な環境パラメータを最適化するために研究を行った。
混合基質を用いる、両微生物によるMSSFを、純粋培養と共培養の両条件下で実施する場合の、タンナーゼおよび没食子酸の生成に対する様々な環境パラメータの影響を研究した:
Claims (15)
- 互いに流体中で接触しているタンニンが豊富な混合基質と培養培地を準備し、真菌リゾプス・オリーゼおよびアスペルギルス・フェティドゥスを含む誘導された種菌を基質に加えて発酵塊および没食子酸を得、有機溶媒を用いて培養培地および発酵塊から没食子酸を抽出し、続いて有機溶媒を蒸発させて没食子酸を得ることを含む、共培養を使用して没食子酸を調製するための方法。
- 前記タンニンが豊富な混合基質が、ミロバランの実粉末(Terminalia chebula)と没食子種皮粉末(Caesalpinia digyna)を1:3〜3:1の割合で含む請求項1記載の方法。
- 前記培養培地が、改良されたシザペクドックス(Czapekdox)培地である請求項1記載の方法。
- 改良されたシザペクドックス(Czapekdox)である請求項1記載の方法。
- 炭水化物源としてタンニン酸を含む培地。
- 基質と培養培地が、0.2:1〜0.8:1の比で存在する請求項1記載の方法。
- 真菌が、2%麦芽エキス寒天斜面上に維持される請求項1記載の方法。
- タンニン酸基質の入ったシザペクドックス(Czapekdox)培地を準備し、それを既知の方式で滅菌し、続いて、真菌であるリゾプス・オリーゼおよびアスペルギルス・フェティドゥスの胞子懸濁液を基質に接種して、接種された基質を得、この接種された基質をインキュベートして誘導された種菌を得ることによって、誘導された種菌が得られる請求項1記載の方法。
- 1×105胞子/ml〜2×108胞子/mlを含有する誘導された種菌が、混合基質20グラムに加えられる請求項1記載の方法。
- 没食子酸が、液体培地から酢酸エチルなどの有機溶媒を用いて抽出される請求項1記載の方法。
- これに水を加え、続いて60〜70°の範囲の温度で加熱して没食子酸の水溶液を得、有機溶媒を用いて没食子酸の水溶液を抽出して没食子酸の有機溶媒溶液を得、続いて溶媒を蒸発させて没食子酸を得ることによって、没食子酸が発酵したバイオマスから得られる請求項1記載の方法。
- 使用される有機溶媒が酢酸エチル等である請求項10記載の方法。
- 没食子酸の有機溶媒溶液をジエチルエーテルなどの溶媒を用いてさらに抽出して没食子酸のエーテル溶媒を得、続いてエーテルを蒸発させて純粋な没食子酸を得る請求項10記載の方法。
- 真菌であるリゾプス・オリーゼとアスペルギルス・フェティドゥスの比が、0.5:2と1:1の間で変化した請求項1記載の方法。
- 実質上本明細書で述べる通りの共培養を使用して没食子酸を調製するための方法。
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