CN112662568B - 产黄青霉及其在制备单宁酶和降解单宁中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单宁降解技术，公开了一种产黄青霉及其在制备单宁酶和降解单宁中的应用。具体地，本发明提供一种产黄青霉，所述产黄青霉的保藏编号为GDMCC No.61268。本发明还提供一种菌剂，该菌剂含有上述的产黄青霉。本发明还提供一种降解单宁的方法，该方法包括：将上述产黄青霉和/或上述菌剂与含有单宁的样品接触。本发明提供的产黄青霉能够高效生产单宁酶，且降解条件具有广泛的pH适应性和温度耐受性，酶解效率高，为单宁酶的工业化生产及其下游产物的全线绿色生产、安全生产提供依据。

Description

产黄青霉及其在制备单宁酶和降解单宁中的应用

技术领域

本发明涉及单宁降解技术，具体地，涉及一种产黄青霉及其在制备单宁酶和降解单宁中的应用。

背景技术

单宁酶是一种单宁酰基水解酶，对单宁具有水解作用，主要由真菌属中的霉菌产生，如黑曲霉、米曲霉等。单宁酶的应用广泛，可水解啤酒中的单宁、蛋白质，使酒澄清透明，也可除去柿子、葡萄、核桃等品的涩味，亦可用于制造速溶茶，防止发酵茶混浊等。随着研究的深入，美国食品与药物管理局(FDA)已确认单宁酶为安全产品，可应用于食品或药品的生产过程中。因此，单宁酶常用于对植物中的单宁进行降解，以使得单宁降解成鞣花酸、儿茶素、花青素及其衍生物，提高单宁的利用价值和利用效率。

目前研究发现，黑曲霉、烟曲霉、芽孢杆菌、毕赤酵母等微生物均可生产单宁酶，实现对单宁的不同程度降解，不仅降解过程安全性高、环境友好，还可有效减少后期提纯步骤，与物理降解方法相比，具有更高的商业价值。但受到野生菌株本身单宁酶产量低、酶活低、酶解机制复杂的限制，目前生物降解还仅限于实验应用，未将此技术应用于工业化生产。因此，加大对微生物资源的挖掘，筛选到可高产单宁酶的野生菌株，从源头提高生物酶解的效率仍为研究的重要方向。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种产黄青霉及其在制备单宁酶和降解单宁中的应用。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种产黄青霉，所述产黄青霉(Penicillium chrysogenum)于2020年11月4日送交广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼)进行保藏，保藏编号为GDMCC No.61268。

本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有上述的产黄青霉。

优选地，所述菌剂含有所述产黄青霉的活菌体、死菌体和发酵产物中的至少一种。

本发明第三方面提供上述的产黄青霉、上述的菌剂在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用。

本发明第四方面提供一种降解单宁的方法，该方法包括：将上述的产黄青霉和/或上述的菌剂与含有单宁的样品接触。

作为一种优选的实施方式，该方法包括：将所述菌剂与所述含有单宁的样品接触，所述菌剂为所述产黄青霉的发酵产物；其中，所述产黄青霉的发酵产物的制备方法包括以下步骤：将所述产黄青霉进行发酵培养得到发酵菌体，将所述发酵菌体经细胞破碎后进行固液分离I得到清液；

优选地，所述细胞破碎至少满足以下条件：温度为20-30℃、超声功率为500-650W、时间为20-30min。

优选地，所述发酵菌体与所述含有单宁的样品中单宁的质量比为 5-25：1，所述接触至少满足以下条件：pH为3-6、温度为25-40℃、转速为 120-200rpm、时间为40-60h。

作为另一种优选的实施方式，所述降解单宁的方法包括：将所述含有单宁的样品与所述产黄青霉的发酵培养基混合得到混合培养基，将所述产黄青霉接种至所述混合培养基中进行接触培养。

优选地，所述含有单宁的样品通过将含有单宁的植物原料经提取处理得到；

优选地，所述提取处理包括以下步骤：

(1)将所述含有单宁的植物原料与提取溶剂混合进行提取，经固液分离II得到提取液；

(2)将所述提取液与萃取溶剂混合进行萃取得到萃取液，将所述萃取液进行干燥得到所述含有单宁的样品；

优选地，所述提取溶剂选自丙酮、甲醇和乙醇中的至少一种；所述提取的次数为1-3次；在每次所述提取过程中，所述含有单宁的植物原料与所述提取溶剂的质量比为1：3-8，每次所述提取至少满足以下条件：温度为 20-30℃、超声频率为400-550W、时间为40-80min；

优选地，所述固液分离II采用离心分离，所述固液分离II至少满足以下条件：转速为6000-10000rpm、时间为10-20min；

优选地，所述萃取溶剂为乙酸乙酯和/或乙醇；所述萃取溶剂与所述提取液的体积比为1-2：1。

优选地，所述混合培养基中所述含有单宁的样品的浓度为40-60g/L，所述产黄青霉的接种量为0.1-0.5体积％，所述接触培养至少满足以下条件：温度为25-35℃、时间为20-30h。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：本发明提供的产黄青霉能够高效生产单宁酶，经发酵培养得到的发酵菌体中单宁酶的酶活能够达到245U/g，利用产黄青霉或者含有产黄青霉的菌剂对单宁进行酶解的步骤简便，且降解条件具有广泛的pH适应性和温度耐受性，酶解效率高；

本发明提供的产黄青霉可通过对酶解反应体系的调控，实现该菌株所产单宁酶的多样利用，用于生产多种高价值产品，为单宁酶的工业化生产及其下游产物的全线绿色生产、安全生产提供依据。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明提供的菌株为产黄青霉，并于2020年11月4日被保藏在广东省微生物菌种保藏中心(简称为GDMCC)，保藏编号为GDMCC No.61268，该保藏中心的地址为：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，邮政编码：510070。

附图说明

图1是本发明中的筛选过程中产黄青霉在初筛培养基上形成的透明圈。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种产黄青霉，所述产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)于2020年11月4日送交广东省微生物菌种保藏中心(简称 GDMCC，地址：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼)进行保藏，保藏编号为GDMCC No.61268。

本发明提供的产黄青霉分离自河南新乡金银花树下的土样，所述产黄青霉的筛选方法的分离筛选可以采用本领域常规的用于新菌株分离筛选的方法，可根据实际需要进行选择，例如，在本发明的一种优选的实施方式中，所述筛选方法包括：

S1、采集河南新乡金银花树下的土样(北纬34°53‘，东经114°34 ‘)；

S2、选用PDA培养基作为菌株富集培养基，将土样进行梯度稀释后涂布于富集培养基(PDA培养基)中进行富集培养，对富集培养基中的菌株进行分离得到富集菌株；

S3、选用无机盐培养基外加蛋白胨、单宁酸作为初筛培养基，将富集菌株涂布于初筛培养基中进行初筛，由于初筛培养基颜色较深且不透明，菌株降解单宁后会在培养基上生成透明圈，通过筛选在初筛培养基中形成透明圈的菌株，得到初筛菌株；

S4、选用察氏液体培养基外加单宁酸、葡萄糖及NaCl作为复筛培养基，将初筛菌株接种于复筛培养基中，进行摇瓶发酵，发酵后采用BCA法测定胞外蛋白及胞内蛋白浓度，采用没食子酸丙酯作为酶活测定底物进行酶活检测，并将菌株酶液与石榴皮提取液按一定比例混合，酶解后用HPLC 测定鞣花酸的浓度，以石榴皮提取液原液作为空白对照组，通过对鞣花酸生成率的对比，选定目标菌株，得到所述产黄青霉。

本发明提供的产黄青霉经过培育能够产生大量的产黄青霉活菌体，本发明对培养方法没有特别的限制，只要通过该培养方法可以使所述产黄青霉大量增殖即可，例如，可以将产黄青霉从斜面试管中用生理盐水洗脱，并充分振荡、稀释后得到种子悬浮液，将种子悬浮液接种至发酵培养基中，接种量为占发酵培养基体积的30-40％，接种后用纱布封口置于30℃±5℃、100-180rpm的条件下培养70-100h，得到发酵液。其中，所述发酵培养基可以为察氏液体培养基外加单宁酸、葡萄糖和NaCl，察氏液体培养基、单宁酸、葡萄糖和NaCl的质量比为100：1-3：1-3：0.05-0.2。

本发明可以进一步分离上述培养液中的产黄青霉的菌体，对所述分离的方法没有特别的限制，只要能够从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为本领域的常规条件。

第二方面，本发明提供了一种菌剂，该菌剂含有上述的产黄青霉。在本发明中，对所述菌剂中产黄青霉的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择。

根据本发明，所述菌剂含有所述产黄青霉的活菌体、死菌体和发酵产物中的至少一种。在本发明中，术语“发酵产物”指的是产黄青霉在发酵或培养过程中产生的代谢产物(包括胞内代谢产物和/或胞外代谢产物)。

根据本发明，对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分，例如所述菌剂可以为液态菌剂(例如可以为发酵产物的提取液)和/或固态菌剂(例如可以为冻干后的菌体)。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂可采用本领域技术人员所熟知的常规技术。

第三方面，本发明提供了上述的产黄青霉、上述的菌剂在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用。根据本发明，所述产黄青霉经发酵培养能够高效生产单宁酶，即单宁酶属于所述产黄青霉的发酵产物，制备单宁酶的过程可以采用常规的细胞破碎、单宁酶提取和纯化的方法。

第四方面，本发明提供了一种降解单宁的方法，该方法包括：将上述的产黄青霉和/或上述的菌剂与含有单宁的样品接触。

在本发明中，所述接触后还可以进一步对单宁经降解获得的产物(例如鞣花酸、没食子酸、儿茶素)进行纯化处理，例如，采用萃取、结晶、过滤等方式。所述含有单宁的样品可以为任意一种含有单宁的溶液，例如含有单宁酸的溶液、含有单宁的植物；优选地，所述含有单宁的样品通过将含有单宁的植物原料经提取处理得到。所述含有单宁的植物原料可以是落叶松、石榴皮、芡实壳、月见草或者其他任意一种含有单宁的植物原料。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高产黄青霉或者菌剂中的单宁酶对单宁的降解速率，并能够有效利用单宁的天然资源。

在本发明中，所述接触可以是将产黄青霉的发酵菌体(活菌体或者死菌体)与所述含有单宁的样品混合，使得产黄青霉中的单宁酶对单宁进行降解，也可以是将产黄青霉的发酵产物(含有单宁酶的细胞提取液，或者从产黄青霉的发酵产物中提取、纯化得到的单宁酶)与所述含有单宁的样品混合，以对单宁进行降解，还可以是在含有单宁的样品的存在条件下，对产黄青霉进行发酵，以直接利用产黄青霉发酵生成的单宁酶对单宁进行降解。

根据本发明，所述提取处理包括以下步骤：

(1)将所述含有单宁的植物原料与提取溶剂混合进行提取，经固液分离II得到提取液；

(2)将所述提取液与萃取溶剂混合进行萃取得到萃取液，将所述萃取液进行干燥得到所述含有单宁的样品；

其中，所述含有单宁的植物原料优选为经干燥、粉碎后与所述提取溶剂混合进行提取。

在优选的情况下，所述提取溶剂选自丙酮、甲醇和乙醇中的至少一种，其中丙酮、甲醇和乙醇可以是以水溶液的形式使用，示例性地，所述提取溶剂可以是丙酮体积分数为50-80％的丙酮-水溶液。所述提取的次数为 1-3次，将每次提取得到的液体混合即为所述提取液；在每次所述提取过程中，所述含有单宁的植物原料与所述提取溶剂的质量比为1：3-8，每次所述提取至少满足以下条件：温度为20-30℃、超声频率为400-550W、时间为40-80min；所述固液分离II采用离心分离，所述固液分离II至少满足以下条件：转速为6000-10000rpm、时间为10-20min；所述萃取溶剂为乙酸乙酯和/或乙醇；所述萃取溶剂与所述提取液的体积比为1-2：1；所述萃取液可采用静置分层的方式分离出，其干燥的方式可以采用真空干燥，以得到植物单宁的固体粉末。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高对植物原料中单宁的提取效率和得率。

作为一种优选的实施方式，所述降解单宁的方法包括：将所述菌剂与所述含有单宁的样品接触，所述菌剂为所述产黄青霉的发酵产物；其中，所述产黄青霉的发酵产物的制备方法包括以下步骤：将所述产黄青霉进行发酵培养得到发酵菌体，将所述发酵菌体经细胞破碎后进行固液分离I得到清液。此时，所述产黄青霉的发酵产物即为产黄青霉的发酵菌体的细胞提取液(含有单宁酶)。

优选情况下，所述细胞破碎至少满足以下条件：温度为20-30℃、超声功率为500-650W、时间为20-30min；所述固液分离I采用过滤分离，示例性地，可以采用灭菌后的纱布进行过滤；所述细胞破碎具体可以为将所述发酵菌体利用缓冲液稀释后进行超声破碎，示例性地，所述缓冲液可以为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，细胞破碎时发酵菌体与缓冲液的质量比为1：1-3。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够提高对产黄青霉进行细胞破碎的效率，有利于单宁酶的溶出，从而提高制得的菌剂对单宁降解的效率。

根据本发明，所述发酵菌体的质量指的是发酵获得的湿菌体质量，所述发酵菌体与所述含有单宁的样品中单宁的质量比为5-25：1，所述接触至少满足以下条件：pH为3-6、温度为25-40℃、转速为120-200rpm、时间为 40-60h。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高产黄青霉的发酵产物中单宁酶对单宁的降解效率。

作为另一种优选的实施方式，所述降解单宁的方法包括：将所述含有单宁的样品与所述产黄青霉的发酵培养基混合得到混合培养基，将所述产黄青霉接种至所述混合培养基中进行接触培养。

优选情况下，所述混合培养基中所述含有单宁的样品的浓度为40-60g/L，所述产黄青霉的接种量为0.1-0.5体积％，所述接触培养至少满足以下条件：温度为25-35℃、时间为20-30h。示例性地，所述混合培养基的 pH可利用酸液或碱液调节至4-5，所述产黄青霉以孢子悬浮液的形式接种至所述混合培养基中，其中孢子悬浮液的菌落数为l×l0⁵-2×l0⁵CFU/mL。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高产黄青霉的发酵产物中单宁酶对单宁的降解效率。

上述降解单宁的方法的优选实施方式，提供了不同的产黄青霉和/或菌剂酶解单宁的反应体系，实现该菌株所产单宁酶的多样利用，用于生产多种高价值产品，为单宁酶的工业化生产及其下游产物的全线绿色生产、安全生产提供依据。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，产黄青霉的发酵培养基采用察氏液体培养基外加单宁酸、葡萄糖和NaCl，察氏液体培养基、单宁酸、葡萄糖和NaCl的质量比为 100：2：2：0.1；没食子酸、儿茶素的含量分别通过高效液相色谱法测得；所有原料和试剂均为市售品。

在没有特别说明的情况下，所述室温为25±5℃。

实施例1

S1、采样：样品采自河南新乡金银花树下的土样(北纬34°53‘，东经114°34‘)；

S2、富集：取1g土样于9mL的无菌水中，加玻璃珠将土样打散摇匀，采用梯度稀释的方法将土壤菌悬液稀释至10^-1-10^-5，富集培养基选用PDA培养基，将梯度稀释后的菌液吸取200μL，用涂布棒均匀涂布于PDA培养基中，进行富集培养得到富集菌株；

S3、初筛：选用无机盐培养基外加蛋白胨、单宁酸(蛋白胨含量为2％、单宁酸含量为2％)作为初筛培养基，将S2得到的富集菌株用接种环挑取接种于初筛培养基，30℃下培养3d，筛选出在初筛培养基上有透明圈产生的菌株即为初筛菌株，具体可参见图1所示；

S4、复筛：选用察氏液体培养基外加单宁酸、葡萄糖及NaCl作为发酵培养基(察氏液体培养基、单宁酸、葡萄糖和NaCl的质量比为100：2：2： 0.1)，将S3得到的初筛菌株的孢子进行洗脱，孢子计数后将接种量控制在 10⁵，接种于发酵培养基，将pH调节至5，在温度为30℃、转速为160rpm 条件下进行液体摇瓶发酵，发酵时间为3d；发酵3d后，取发酵液用无菌纱布8层过滤，并用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤菌体3次以上，将菌体置于 50mL离心管中，加入30mL缓冲液，将菌体悬液进行超声破碎，破碎后离心取上清液，此即为菌体粗酶液；采样BCA法测定粗酶液中的蛋白含量，并用甲醇绕单宁法，以没食子酸丙酯作为底物测定单宁酶酶活，将粗酶液与石榴皮提取液以体积比1：1混合，于35℃、180rpm条件下液态发酵48h，测定鞣花酸的生成率；根据鞣花酸的得率及单宁酶的酶活选定目标菌株，即为复筛菌株；

S5、将S4得到的复筛菌株接种于PDA培养基，送至擎科生物公司进行 18s测序，将菌株的全基因组与NCBI数据库中进行比对，最终确定菌株为产黄青霉，并于2020年11月4日被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61268。

实施例2

(1)利用10mL生理盐水将实施例1得到的产黄青霉从斜面试管上洗脱得到洗脱液，将洗脱液充分振荡、稀释后获得菌落浓度为10⁸CFU/mL的孢子悬浮液，将360mL孢子悬浮液接种至1L发酵培养基中，摇匀后用四层纱布封口，在转速为140r/min、温度为30℃的摇床中培养84h，得到发酵液；

(2)将步骤(1)得到的发酵液采用灭菌后的纱布进行过滤得到发酵菌体，将15g发酵菌体与30g柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合后，在温度为 25℃、功率为550W的条件下超声25min，经离心分离后上清液即为菌剂，测定发酵菌体中的单宁酶活性为230U/g；

(3)将步骤(2)得到的菌剂与30mL单宁酸溶液(没食子单宁的含量为50g/L)混合，在温度为30℃、pH为4.0、转速为160r/min的条件下酶解 48h得到酶解液，测定酶解液中的没食子酸含量，测得没食子酸的转化率为 80％。

实施例3

(1)利用10mL生理盐水将实施例1得到的产黄青霉从斜面试管上洗脱得到洗脱液，将洗脱液充分振荡、稀释后获得菌落浓度为10⁸CFU/mL的孢子悬浮液，将300mL孢子悬浮液接种至1L发酵培养基中，摇匀后用四层纱布封口，在转速为100r/min、温度为35℃的摇床中培养70h，得到发酵液；

(2)将步骤(1)得到的发酵液采用灭菌后的纱布进行过滤得到发酵菌体，将30g发酵菌体与30g柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合后，在温度为20℃、功率为650W的条件下超声20min，经离心分离后上清液即为菌剂，测定发酵菌体中的单宁酶活性为245U/g；

(3)将步骤(2)得到的菌剂与30mL单宁酸溶液(没食子单宁的含量为60g/L)混合，在温度为40℃、pH为6、转速为200r/min的条件下酶解 40h得到酶解液，测定酶解液中的没食子酸含量，测得没食子酸的转化率为 83％。

实施例4

(1)利用10mL生理盐水将实施例1得到的产黄青霉从斜面试管上洗脱得到洗脱液，将洗脱液充分振荡、稀释后获得菌落浓度为10⁸CFU/mL的孢子悬浮液，将400mL孢子悬浮液接种至1L发酵培养基中，摇匀后用四层纱布封口，在转速为180r/min、温度为25℃的摇床中培养100h，得到发酵液；

(2)将步骤(1)得到的发酵液采用灭菌后的纱布进行过滤得到发酵菌体，将10g发酵菌体与30g柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合后，在温度为 30℃、功率为500W的条件下超声30min，经离心分离后上清液即为菌剂，测定发酵菌体中的单宁酶活性为210U/g；

(3)将步骤(2)得到的菌剂与30mL单宁酸溶液(没食子单宁的含量为40g/L)混合，在温度为25℃、pH为3、转速为120r/min的条件下酶解 60h得到酶解液，测定酶解液中的没食子酸含量，测得没食子酸的转化率为 75％。

实施例5

(1)将1kg落叶松栲胶溶于5L体积分数为70％的丙酮-水溶液中，在温度为25℃、超声功率为450W的条件下超声提取60min，再以转速为 8000rpm离心15min得上层清液和残渣；将残渣再用5L体积分数为70％的丙酮-水溶液进行二次提取，离心后合并两次的上层清液得到提取液；

(2)将步骤(1)得到的提取液与乙酸乙酯以体积比1:1混合进行萃取，经分层后将上层的乙酸乙酯相进行真空浓缩干燥，得到落叶松单宁的固体粉末，即为含有单宁的样品(儿茶素单宁)；

(3)将步骤(2)得到的含有单宁的样品与产黄青霉的发酵培养基以质量比为1：20进行混合，并调节pH为4.5得到混合培养基；

(4)利用10mL生理盐水将实施例1得到的产黄青霉从斜面试管上洗脱得到洗脱液，将洗脱液充分振荡、稀释后获得菌落浓度为 1.6×10⁵CFU/mL的孢子悬浮液，将孢子悬浮液以接种量为1mL/L接种至步骤(3)得到的混合培养基中，在温度为31℃的条件下培养24h，得到发酵产物。

将发酵产物加入6倍体积甲醇，混匀后过液相小瓶，用HPLC测定发酵产物中儿茶素的含量为4.5mg/mL，落叶松单宁降解为儿茶素的转化率为 78％。

实施例6

(1)将1kg落叶松栲胶溶于3L体积分数为80％的丙酮-水溶液中，在温度为30℃、超声功率为400W的条件下超声提取80min，再以转速为 10000rpm离心10min得上层清液和残渣；将残渣再用体积分数为70％的丙酮-水溶液进行两次重复提取，离心后合并三次的上层清液得到提取液；

(2)将步骤(1)得到的提取液与乙醇以体积比1：1混合进行萃取，经分层后将上层的乙醇相进行真空浓缩干燥，得到落叶松单宁的固体粉末，即为含有单宁的样品(儿茶素单宁)；

(3)将步骤(2)得到的含有单宁的样品与产黄青霉的发酵培养基以质量比为1：25进行混合，并调节pH为4得到混合培养基；

(4)利用10mL生理盐水将实施例1得到的产黄青霉从斜面试管上洗脱得到洗脱液，将洗脱液充分振荡、稀释后获得菌落浓度为2×10⁵CFU/mL 的孢子悬浮液，将孢子悬浮液以接种量为2mL/L接种至步骤(3)得到的混合培养基中，在温度为25℃的条件下培养30h，得到发酵产物。

将发酵产物加入7倍体积甲醇，混匀后过液相小瓶，用HPLC测定发酵产物中儿茶素的含量为5.3mg/mL，落叶松单宁降解为儿茶素的转化率为 47％。

实施例7

(1)将1kg落叶松栲胶溶于8L体积分数为50％的丙酮-水溶液中，在温度为20℃、超声功率为550W的条件下超声提取40min，再以转速为 6000rpm离心20min，取上层清液即为提取液；

(2)将步骤(1)得到的提取液与乙酸乙酯以体积比1：2混合进行萃取，经分层后将上层乙酸乙酯酯相进行真空浓缩干燥，得到落叶松单宁的固体粉末，即为含有单宁的样品(儿茶素单宁)；

(3)将步骤(2)得到的含有单宁的样品与产黄青霉的发酵培养基以质量比为1：17进行混合，并调节pH为5得到混合培养基；

(4)利用10mL生理盐水将实施例1得到的产黄青霉从斜面试管上洗脱得到洗脱液，将洗脱液充分振荡、稀释后获得菌落浓度为1×10⁵CFU/mL 的孢子悬浮液，将孢子悬浮液以接种量为3mL/L接种至步骤(3)得到的混合培养基中，在温度为35℃的条件下培养20h，得到发酵产物。

将发酵产物加入5倍体积甲醇混匀后过液相小瓶，用HPLC测定发酵产物中儿茶素的含量为3.9mg/mL，即落叶松单宁降解为儿茶素的转化率为 65％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (14)

1.一种产黄青霉，其特征在于，所述产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的保藏编号为GDMCC No.61268。

2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的产黄青霉。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂含有所述产黄青霉的活菌体。

4.权利要求1所述的产黄青霉、权利要求2或3所述的菌剂在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用。

5.一种降解单宁的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的产黄青霉和/或权利要求2或3所述的菌剂与含有单宁的样品接触。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法包括：将所述菌剂与所述含有单宁的样品接触，所述菌剂为所述产黄青霉的发酵产物；

其中，所述产黄青霉的发酵产物的制备方法包括以下步骤：将所述产黄青霉进行发酵培养得到发酵菌体，将所述发酵菌体经细胞破碎后进行固液分离I得到清液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞破碎至少满足以下条件：温度为20-30℃、超声功率为500-650W、时间为20-30min。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵菌体与所述含有单宁的样品中单宁的质量比为5-25：1，所述接触至少满足以下条件：pH为3-6、温度为25-40℃、转速为120-200rpm、时间为40-60h。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法包括：将所述含有单宁的样品与所述产黄青霉的发酵培养基混合得到混合培养基，将所述产黄青霉接种至所述混合培养基中进行接触培养。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述含有单宁的样品通过将含有单宁的植物原料经提取处理得到。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述提取处理包括以下步骤：

(1)将所述含有单宁的植物原料与提取溶剂混合进行提取，经固液分离II得到提取液；

(2)将所述提取液与萃取溶剂混合进行萃取得到萃取液，将所述萃取液进行干燥得到所述含有单宁的样品。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂选自丙酮、甲醇和乙醇中的至少一种；所述提取的次数为1-3次；在每次所述提取过程中，所述含有单宁的植物原料与所述提取溶剂的质量比为1：3-8，每次所述提取至少满足以下条件：温度为20-30℃、超声频率为400-550W、时间为40-80min。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述固液分离II采用离心分离，所述固液分离II至少满足以下条件：转速为6000-10000rpm、时间为10-20min；

所述萃取溶剂为乙酸乙酯和/乙醇；所述萃取溶剂与所述提取液的体积比为1-2：1。

14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述混合培养基中所述含有单宁的样品的浓度为40-60g/L，所述产黄青霉的接种量为0.1-0.5体积％，所述接触培养至少满足以下条件：温度为25-35℃、时间为20-30h。

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