CN116836818B - 一株青霉菌f8816及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株青霉菌F8816，涉及微生物筛选及稀有人参皂苷转化技术领域，青霉菌(Penicillium murcianum)F8816于2023年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40638，分类命名为Penicillium murcianum，该菌株可发酵产β‑糖苷酶，得到的β‑糖苷酶能够耐受0～10％的有机溶剂，并且可以将人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd转化为稀有人参皂苷Compound K，转化特异性强，在大量发酵生产人参皂苷Compound K的过程中存在明显的优势。
Description
技术领域
本发明涉及微生物筛选及稀有人参皂苷转化技术领域，更具体的说是涉及一株青霉菌F8816及其应用。
背景技术
人参皂苷是参属名贵药用植物的主要活性成分，在医药、保健品、营养品和化妆品开发领域有着广泛的应用前景，特别是稀有人参皂苷具有显著的抗肿瘤、保护神经系统、保肝护肝等药理活性。而稀有人参皂苷是指在人参中含量极低或者不存在的皂苷，但其药理活性优于上述高含量人参皂苷。例如，稀有人参皂苷Compound K具有很好的抗细胞突变、抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤细胞耐药性、抗过敏和抗炎活性。
稀有人参皂苷Compound K属二醇组人参皂苷，尽管大量的实验已经表明稀有人参皂苷Compound K具有很高的药用价值，但由于它们在自然界中含量极其稀少，很难通过传统的方法从人参等植物中分离得到，这对稀有人参皂苷的生产造成很大限制。目前，制备稀有人参皂苷的方法主要是直接酸水解法和微生物/酶转化法。直接酸水解法通常选择性较差、产率低、同时容易造成环境污染。微生物/酶转化法则具备区域选择性、立体选择性和基团选择性高、靶向性好、得率高、副产物少、无污染和容易工业化生产等优点，能完成一些用化学方法难以进行的反应，获得化学法难以得到的稀有人参皂苷Compound K，被认为是生产稀有人参皂苷最具有潜力的方法。
现有关于人参皂苷Compound K生物法制备的专利主要集中在对人参皂苷Rb1的转化，例如，CN 115449536 B中提出利用黑曲霉发酵液转化人参皂苷Rb1为Compound K的方法；CN109536561A中介绍了一种人参内生菌催化人参皂苷Rb1制备稀有人参皂苷CompoundK，人参皂苷Rb1底物浓度为0.25mg/mL，继续振荡培养5～10天，得到稀有人参皂苷CompoundK；CN105296587A介绍了一种来自Bifidobacterium breve ATCC 15700双歧杆菌的β-葡萄糖苷酶，人参皂苷Rb1浓度10g/L，CK转化率62～68％，但中间涉及到β-葡萄糖苷酶的纯化步骤，较为繁琐。尽管也有专利报道微生物将二醇组人参皂苷转化为稀有人参皂苷CompoundK，例如，CN107746871B报道了一种裂褶菌生物转化人参皂苷制备人参稀有皂苷F2、Compound K、Compound O、Compound Y、Compound Mc1、CompoundMc、C-Mx1和C-Mx的方法；然而，关于青霉菌转化二醇组大量人参皂苷转化稀有人参皂苷CompoundK，目前仍然未有文献报道。
青霉菌广泛存在于自然界，环境适应性极强，因此，从青霉菌中获得的生物酶理论上也应该具有极强的环境适应性。人参皂苷在转化过程中因为溶解性的问题，在转化中引入有机溶剂能够提高转化效率，但是有机溶剂对酶是具有抑制作用的，因此，寻找能发酵生产高效、酶学特性稳定、特异性降解人参皂苷提取物生产人参皂苷Compound K的糖苷水解酶的菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种青霉菌F8816及其应用，该菌株能够将人参皂苷提取物转化为稀有人参皂苷CompoundK，酶学特性稳定。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株青霉菌F8816，所述青霉菌(Penicillium murcianum)F8816于2023年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40638，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为Penicillium murcianum。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的青霉菌F8816在发酵产β-糖苷酶中的应用。
优选地，β-糖苷酶能够耐受0～10％的有机溶剂。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的青霉菌F8816在对人参皂苷Rb1、Rb2，Rc，Rd转化为稀有人参皂苷Compound K中的应用。
优选地，人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd转化为稀有人参皂苷Compound K的转化途径分别为：Rb1→Rd→F2→Compound K；Rb2→CY→Compound K；Rc→C-Mc→Compound K；Rd→Compound K。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种生产稀有人参皂苷Compound K的方法，具体过程包括：
1)将青霉菌F8816菌株进行发酵，得到发酵液；
2)对步骤1)所得发酵液离心，去菌体，盐析获得粗蛋白、纯化、获得酶；
3)用pH 5.0的磷酸缓冲盐分别溶解酶样品和人参皂苷提取物，配制成200mg/L的酶溶液和1g/L的人参皂苷提取物溶液，然后将酶溶液与人参皂苷提取物溶液等体积混匀，置于温度为55℃的水浴锅中反应6h，反应结束后，用2倍体积的正丁醇对反应液进行萃取，将上层的正丁醇相移出到新的培养皿，然后将培养皿放置到通风橱进行挥干至恒重，得稀有人参皂苷Compound K。
优选地，步骤1)中，将青霉菌F8816菌株进行培养发酵的过程为：
将青霉菌F8816菌株接种在PDA培养基中，28℃培养5d，然后将菌块接种到液体培养液中，液体培养液的成分为：20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、0.5g/L NaNO3、1g/L KH2PO4、2g/L Na2HPO4、0.2g/L FeSO4、0.1g/L ZnSO4、0.2g/LCuSO4、1g/L CaCl2、0.5g/L MgSO4·7H2O，初始pH6.5，在培养温度28℃，转速180rpm的条件下培养96h。
优选地，步骤2)中，所述离心为8000rpm/mim；所述盐析为70％的硫酸铵进行盐析，4℃过夜，离心获得粗蛋白；所述纯化为将粗蛋白溶于水，透析袋进行脱盐。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株青霉菌F8816菌株，该菌株能够将人参皂苷提取物转化至已商品化且附加值高的稀有人参皂苷CompoundK，酶学特性稳定，目标产物明确，转化的特异性强，在大量发酵生产人参皂苷Compound K的过程中存在明显的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为青霉菌F8816菌株菌落形态特征图；
图2附图为产β-糖苷酶青霉菌F8816初筛结果图；
图3附图为青霉菌F8816菌株系统发育树图；
图4附图为青霉菌F8816菌株的发酵转化前后发酵液中人参皂苷Rb1和转化产物的HPLC检测图；
图5附图人参皂苷Rb1转化为稀有人参皂苷CompoundK的转化途径；
图6附图为青霉菌F8816发酵人参皂苷提取物，将人参提取物中的二醇组人参皂苷转化为稀有人参皂苷CompoundK；
图7附图为主要二醇组人参皂苷转化稀有人参皂苷Compound K的中间产物检测；
图8附图为不同有机溶剂浓度下获得的β糖苷酶的活性比较图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1青霉菌P.murcianum F8816的筛选与鉴定
1)菌株的分离与培养
该菌株为分离自秦岭扣子七植物的内生真菌，分离方法如下：野生扣子七的根组织→切小块→75％乙醇表面消毒1min→2.5％的次氯酸钠表面消毒2min→75％乙醇表面消毒1min→无菌水清洗3-5次→无菌镊子将组织块插入到含有100U/mL硫酸阿卡米星的PDA培养基平板上→28℃恒温培养箱中倒置培养5～7d，直至长出菌丝体。
2)β糖苷酶产生菌的筛选与分子鉴定
分离获得的菌株接种到含有七叶苷的R2A培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养5～7d，七叶苷R2A琼脂培养基的组成为：1g/L七叶苷，0.5g/L柠檬酸铁，15.2g/L R2A商品培养基，培养基121℃灭菌20min。
在此培养基上筛选获得一株能够产生β-糖苷酶的菌株，将其命名为F8816菌株，其菌落特征见图1，产生β-糖苷酶的菌株能够将七叶苷水解，在菌株生长周围会产生红色的光圈(见图2)。
将该菌株送华大生物技术有限公司测序，测序结果在NCBI核酸数据库中进行Blast相似性分析，经Blast序列比对及进化树分析(见图3)，确定其为青霉菌P.murcianum；命名为F8816，该菌株于2023年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.40638，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为Penicillium murcianum。
实施例2青霉菌P.murcianum F8816对Rb1的发酵性能鉴定
预先在PDA培养基上培养5d的青霉菌P.murcianum F8816菌株，用无菌吸管打孔，用无菌牙签接种于液体培养液中，液体培养液的成分为：20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L NaNO3，1g/L KH2PO4，2g/L Na2HPO4，0.2g/LFeSO4，0.1g/L ZnSO4，0.2g/L CuSO4，1g/LCaCl2，0.5g/L MgSO4·7H2O，初始pH6.5，在培养温度28℃，转速180rpm的条件下培养72h。
用2％的甲醇水溶液溶解人参皂苷Rb1，配制成浓度为200mg/L的人参皂苷Rb1母液，过滤除菌之后，等体积加入到上述青霉菌P.murcianum F8816发酵72h后的发酵液中继续培养6h；取上清液2mL加入2倍体积的正丁醇进行萃取，然后将上层的正丁醇相移出到新的培养皿，将培养皿放置到通风橱进行挥干至恒重，得干燥物。
用甲醇溶解干燥物，然后进行液相HPLC检测，色谱条件为：色谱柱采用YMC-PackODS-AQ，规格为250mm×4.6mm，5μm；流动相采用A相-B相，A相为水，B相为23wt％乙腈，梯度洗脱方式为：0～12min，采用77wt％～48wt％A；12～35min，采用48wt％～25wt％A；35～36min，采用25wt％A；36～42min，采用25wt％～77wt％A。梯度洗脱过程的体积流量1mL/min，柱温30℃，进样量为10μL。所有样品均在203nm处进行吸收检测。
对菌株发酵Rb1产物进行HPLC检测，将其与标准品系列人参皂苷的HPLC谱图和数据进行比对(见图4)，在转化产物中，Rb1的含量降低，出现了人参皂苷Rd，F2，和CompoundK，确定菌株能够将人参皂苷Rb1转化为稀有皂苷Compound K，其转化的途径如图5所示，为Rb1→Rd→F2→Compound K。
实施例3青霉菌P.murcianum F8816对人参皂苷提取物发酵及发酵产物检测
将青霉菌P.murcianum F8816菌株培养在PDA培养基中，28℃培养5d，然后将菌块接种到液体培养液中，液体培养液的成分为：20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，0.5g/L NaNO3，1g/L KH2PO4，2g/L Na2HPO4，0.2g/L FeSO4，0.1g/LZnSO4，0.2g/L CuSO4，1g/L CaCl2，0.5g/LMgSO4·7H2O，初始pH6.5，在培养温度28℃，转速180rpm的条件下培养96h。
将上述培养结束后的发酵液8000rpm/mim离心去除菌体，上清中加入70％的硫酸铵进行盐析，4℃过夜，离心获得粗蛋白，将粗蛋白溶于水，透析袋进行脱盐，脱盐的酶液进行冻干获得酶样品；用pH 5.0的磷酸缓冲盐分别溶解酶样品和人参皂苷提取物，配制成200mg/L的酶溶液和1g/L的人参皂苷提取物溶液，然后将酶溶液与人参皂苷提取物溶液等体积混匀，置于温度为55℃的水浴锅中反应6h。反应结束后，用2倍体积的正丁醇对反应液进行萃取，将上层的正丁醇相移出到新的培养皿，然后将培养皿放置到通风橱进行挥干至恒重，得干燥物。
用甲醇溶解干燥物，然后进行液相HPLC检测，色谱条件为：色谱柱采用YMC-PackODS-AQ，规格为250mm×4.6mm，5μm；流动相采用A相-B相，A相为水，B相为23wt％乙腈，梯度洗脱方式为：0～12min，采用77wt％～48wt％A；12～35min，采用48wt％～25wt％A；35～36min，采用25wt％A；36～42min，采用25wt％～77wt％A。梯度洗脱过程的体积流量1mL/min，柱温30℃，进样量为10μL。所有样品均在203nm处进行吸收检测。
对菌株发酵人参皂苷提取物产物进行HPLC检测，将其与标准品系列人参皂苷的HPLC谱图和数据进行比对(见图6)，在转化产物中，大量二醇组人参皂苷完全被降解，仅检测出稀有人参皂苷CompoundK。
实施例4青霉菌P.murcianum F8816对二醇组大量人参皂苷Rb2，Rc，Rd转化特性的研究
为了研究该菌株对二醇组人参皂苷的转化途径，将上述实施例3获得酶样品用pH5.0的磷酸缓冲盐溶解配成200mg/L，人参皂苷Rb2，Rc，Rd等被配制成200mg/L，然后将酶溶液与人参皂苷提取物溶液等体积混匀，置于温度为55℃的水浴锅中反应1h。反应结束后，用2倍体积的正丁醇对反应液进行萃取，将上层的正丁醇相移出到新的培养皿，然后将培养皿放置到通风橱进行挥干至恒重，得干燥物。
用上述实施例3中的HPLC检测方法进行检测，并与标准品系列人参皂苷的HPLC谱图和数据进行比对(见图7)，在转化产物中，人参皂苷Rb2，Rc，Rd被逐步转化，其最终转化途径为，Rb2→CY→Compound K；Rc→C-Mc→CompoundK；Rd→CompoundK。
实施例5有机溶剂对P.murcianum F8816发酵产β-糖苷酶酶活的影响
分别使用浓度为0％、1％、2％、5％、10％的有机溶剂甲醇、乙醇、DMSO在60℃、pH5.00的条件下溶解上述实施例3获得酶样品，使用PNPG法测定酶活。
取1mL离心管，加入60uL粗酶液和60uL 50mg/mL的PNPG，于水浴锅内60℃反应10min，加入1M的碳酸钠溶液120uL终止反应。反应终止后取200uL混合液放置到96孔板内，在多功能微孔板检测仪中测OD405，每组重复3次。可根据实际情况对粗酶液进行适度稀释。
以有机溶剂0％的作为空白进行比较，有机溶剂对PNPG酶活的影响如图8所示。在有机溶剂浓度为10％时，该菌株产生的β糖苷酶仍保留50％以上的酶活力，展示出良好的有机溶剂耐受特性。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一株青霉菌F8816，其特征在于，所述青霉菌（Penicillium murcianum）F8816于2023年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.40638，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为Penicillium murcianum。
2.权利要求1所述的青霉菌F8816在发酵产β-糖苷酶中的应用。
3.权利要求1所述的青霉菌F8816在对人参皂苷Rb1、Rb2，Rc，Rd转化为稀有人参皂苷Compound K中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd转化为稀有人参皂苷Compound K的转化途径分别为：Rb1→Rd→F2→Compound K；Rb2→CY→Compound K；Rc→C-Mc→Compound K；Rd→Compound K。
5.一种生产稀有人参皂苷Compound K的方法，其特征在于，具体过程包括：
1）将权利要求1所述的青霉菌F8816菌株进行发酵，得到发酵液；
2）对步骤1）所得发酵液离心，去菌体，盐析获得粗蛋白、纯化、获得酶；
3）用pH 5.0的磷酸缓冲盐分别溶解酶样品和人参皂苷提取物，配制成200mg/L的酶溶液和1g/L的人参皂苷提取物溶液，然后将酶溶液与人参皂苷提取物溶液等体积混匀，置于温度为55℃的水浴锅中反应6h，反应结束后，用2倍体积的正丁醇对反应液进行萃取，将上层的正丁醇相移出到新的培养皿，然后将培养皿放置到通风橱进行挥干至恒重，得稀有人参皂苷Compound K。
6.根据权利要求5所述的一种生产稀有人参皂苷Compound K的方法，其特征在于，步骤1）中，将青霉菌F8816菌株进行培养发酵的过程为：
将青霉菌F8816菌株接种在PDA培养基中，28℃培养5d，然后将菌块接种到液体培养液中，液体培养液的成分为：20g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、0.5 g/L NaNO3、1 g/L KH2PO4、2 g/L Na2HPO4、0.2g/L FeSO4、0.1g/L ZnSO4、0.2g/L CuSO4、1g/L CaCl2、0.5g/L MgSO4·7H2O，初始pH6.5，在培养温度28℃，转速180 rpm的条件下培养96h。
7.根据权利要求5所述的一种生产稀有人参皂苷Compound K的方法，其特征在于，步骤2）中，所述离心为8000rpm/mim；所述盐析为70%的硫酸铵进行盐析，4℃过夜，离心获得粗蛋白；所述纯化为将粗蛋白溶于水，透析袋进行脱盐。
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