KR20130134930A - 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 이용한 진세노사이드 ｆ2의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD(protopanaxadiol) 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 F2를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 패니바실러스 무실라지노서스(paenibacillus mucilaginosus) 유래의 단백질을 이용한 것으로, 상기 단백질, 형질전환체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌인 진세노사이드 F2로의 전환용 조성물, 신규한 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질 전환체에 관한 것이다.

Description

신규한 진세노사이드 글리코시다제를 이용한 진세노사이드 Ｆ2의 제조방법{Production of ginsenoside F2 using novel ginsenoside glycosidase}

본 발명은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 F2를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus) 유래의 단백질을 이용한 것으로, 상기 단백질, 형질전환체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌인 진세노사이드 F2로의 전환용 조성물, 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질 전환체에 관한 것이다.

사포닌은 식물계에 널리 존재하는 배당체에서 당이 아닌 부분이 여러 고리 화합물로 이루어진 물질을 의미한다. 인삼 또는 홍삼에 주요 생리활성 성분으로 포함된 사포닌 성분인, 트리테르펜사포닌(triterpene saponin)은 타 식물에서 발견되는 사포닌과는 화학 구조가 상이하므로 이러한 인삼 사포닌을 타 식물계 사포닌과 구별하기 위해서 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 진세노사이드(Ginsenoside)라고 부른다.

진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계(Protopanaxadiol-type, PPD 타입) 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올계(Protopanaxatriol-type, PPT 타입) 진세노사이드 및 올레아놀린산계(Oleanolic acid 타입) 진세노사이드의 세 가지로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 다시, 화합물 구조 중 고리의 3번 탄소, 6번 탄소 및 20번 탄소 위치에 글리코시딕 결합(glycosicid bond)에 의해 부착되는 당 부위(아글리콘)(sugar moieties(aglycones))의 위치 및 수에 따라 분류된다. 올레아놀린산계 진세노사이드의 기본골격은 5환상이고, 여기에는 유일하게 진세노사이드 Ro가 있고, 그 아글리콘은 올레아놀릭산(oleanolic acid)이다. 현재, 40여종 이상의 진세노사이드들이 분리되었고, 이들 대부분은 PPD 타입의 진세노사이드이다. PPD 타입의 진세노사이드에는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII), 화합물 O(Compound O), 화합물 Mc1(Compound Mc1), F2, 화합물 Y(Compound Y), 화합물Mc(Compound Mc), Rg3, Rh2, C-K가 포함된다. PPT 타입의 진세노사이드에는 Re, Rg1, Rf, Rg2, Rh1 등이 포함된다.

또한, 건삼에서의 진세노사이드의 90% 이상을 차지하는 것은 메이저 진세노사이드이나 이는 1,000 달톤 부근의 큰 사이즈로 인하여 생체 내에서의 흡수율이 매우 낮다. 따라서 진세노사이드의 약효를 증대시키기 위해서 메이저 진세노사이드를 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더 뛰어난 마이너 진세노사이드로 전환시키는 과정이 필요하다. 즉, 메이저 진세노사이드는 인 비보(in vivo)에서 효과적으로 생리적 활성을 나타내기 위하여 당을 구성하는 글루코스, 아라비노스, 람노스, 자일로스 등을 제거(deglycosylated)하는 전환과정이 요구된다. 메이저 진세노사이드에는 Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc 및 Rd 등이 포함되며, 미량으로 존재하는 마이너 진세노사이드(희귀 진세노사이드)에는 F2, Rg3, Rh1, Rh2, 지페노사이드(gypenoside, Gyp) XVII, 지페노사이드 LXXV 및 화합물 K, C-K, Mc, Mc1(compound K, C-K, Mc, Mc1)등이 포함된다.

마이너 진세노사이드 중 F2는 주로 인삼의 잎에 소량 함유되어 있으나 근에는 극미량 함유되어 있는 진세노사이드로서, 항암효과, 항산화 효과가 알려져 있으며 마이너 진세노사이드 중에서도 그 약리작용이 거의 알려지지 않은 물질이다. 진세노사이드 F2의 알려진 효능으로는 치매의 개선(한국공개특허 제10-2009-0083780호), 유방암 줄기세포에서 자가소화작용(autophagy)을 동반하는 아폽토시스(apoptosis)를 유발하는 통한 항증식활성(Mai TT et al., Cancer Lett. 2012 Aug 28;321(2):144-53) 및 아토피 피부염에 대한 개선 효과 등이 있다. 이와 같이 F2는 여러 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 물질이지만, 인삼에 미량 존재하므로 이와 같이 미량으로 존재하는 마이너 진세노사이드를 대량 생산할 수 있는 방법이 필요하다.

미량으로 존재하는 마이너 진세노사이드를 생산하기 위한 방법으로 화학적 분해 방법, 효소적 방법 및 배당체 합성을 이용한 방법 등이 제시되어 왔으나, 상기와 같은 방법들은 1) 제조 공정상 여러 단계를 거쳐야 하거나, 2) 제조과정에서 목적하는 성분이 소실되며, 3) 식용에 부적합한 촉매를 사용하거나, 4) 낮은 수율을 나타내어 여전히 대량생산에 한계가 있었다.

특히 효소적 방법 중, 사용될 수 있는 효소의 종류로 β-글루코시다제(β-glucosidase), α-L-아라비노피라노시다제(α-L-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase),α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase)가 있으며, 이와 같은 효소를 이용한 메이저 진세노사이드의 생전환(biotransformation)에 대해 많은 연구가 있었다. 그러나 이들 역시 대량 생산 방법으로서는 효과적이지 못하고, 많은 비용이 발생하는 문제가 있다.

뿐만 아니라, β-글루코시다제(β-glucosidase), α-L-아라비노피라노시다제(α-L-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase),α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase)에 속한다고 해도 모두 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있는 활성을 가지는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명자들은 아스로박터 클로로페노리쿠스(Arthrobacter chlorophenolicus) A6에서 유래한 것으로 알려진 베타 글루코시다제에는 진세노사이드의 생전환 활성이 없음을 확인한 바 있다. 또한, 기존의 알려진 효소들, 예컨대, Rb1으로의 전환능력이 있다고 알려진 효소인 베타-글리코시다제 A는 진세노사이드의 생전환 활성이 있다 하여도 그 활성이 미미하였다. 즉, 상기 효소들은 그 유래 등에 따라 기질 및 최종 산물에 차이가 있다.

또한, 한국등록특허 제10-0329259호는 사포닌 알파-글루코시다제로 PPD 타입 진세노사이드의 사포닌 당기를 분해하여 진세노사이드 F2를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 발명의 사포닌 알파-글루코시다제는 진세노사이드 Rd를 진세노사이드 F2로 전환시키고, 진세노사이드 F2를 진세노사이드 Rh2로 전환시킨다. 또한, 진세노사이드 Rb1과 Rc로부터 Rh2를 제조할 수도 있다. 그러나 상기 특허의 실시예 3에 기재된 바에 따르면 상기 사포닌 알파-글루코시다제는 맥부와 인삼분말이 포함되어 있는 배지에 국균을 넣어서 배양하고 균체를 제거하여 생산해야하는 단점이 있다. 따라서, 낮은 수율을 나타내어 대량생산방법으로 효과적이지 못하며 제조원가가 많이 들며, 제조과정 중 목적하는 성분이 소실될 수 있다는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 인삼 등의 식물체에 미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 희귀 진세노사이드를 용이하게 고수율로 다량 수득하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 패니바실러스 무실라지노서스 KCTC 3870^T 균주로부터 메이저 형태의 진세노사이드에서 마이너 진세노사이드로의 생전환 활성을 가지는 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 유전자를 수득하고, 상기 유전자에 의해 코딩되는 진세노사이드 글리코시다제가 메이저 진세노사이드인 Rb1을 지페노사이드 XVII를 거쳐 진세노사이드 F2로 전환시키고, 진세노사이드 Rd를 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있음을 확인하여 마이너 진세노사이드 F2를 대량생산할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 F2를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌인 진세노사이드 F2로의 전환용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질 전환체를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 F2를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "PPD(protopanaxadiol) 타입의 사포닌"은 담마란(dammarane)계 사포닌으로, 비 당부분(aglycone)에 붙어있는 수산기(-OH)의 숫자가 2개인 진세노사이드를 의미하며, 이의 예로 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Ra3, Rg3, Rh2, Rs1, 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII) 또는 Rs2가 있다. 본 발명의 목적상 PPD 타입의 사포닌은 상기 진세노사이드 글리코시다제의 활성에 의해 진세노사이드 F2로 전환될 수 있는 사포닌을 모두 포함하며, 대표적으로 Rb1, Rd, Rc 및 지페노사이드 XVII가 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제의 활성에 의하여 진세노사이드 F2로 전환될 수 있음을 확인하였다. 상기 PPD 타입의 사포닌은 바람직하게는 Rb1, Rd, Rc 또는 지페노사이드 XVII이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 PPD 타입의 사포닌은 분리 및 정제된 형태의 사포닌을 이용할 수도 있고, 또는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물에 포함되어 있는 진세노사이드들을 이용할 수도 있다. 즉, 사포닌을 포함하는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물을 직접 출발물질로 이용하여 본 발명의 방법을 실시할 수도 있다. 본 발명에서 이용되는 인삼으로는, 공지된 다양한 인삼을 사용할 수 있으며, 고려삼(Panax ginseng), 화기삼(P. quiquefolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus), 삼엽삼(P. trifolium), 히말라야삼(P. pseudoginseng) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. PPD 타입의 사포닌의 구조를 도 1에 나타내었다.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 F2"는 PPD 타입의 사포닌의 기본 탄소 골격에 있어, 3번 탄소 및 20번 탄소에 글루코스(glucose)가 하나씩 결합되어 있는 형태의 마이너 진세노사이드를 의미하며, Rb1, Rd 및 지페노사이드 XVII 등에 비하여 당류가 제거되어 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 말한다. 상기 진세노사이드 F2는 항암, 항산화 효과를 가지므로, 암과 같은 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 물질이다. 다만, 이러한 유용성에도 불구하고 진세노사이드 F2는 미량으로 존재하므로 대량생산할 필요가 있으며, 이때 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있는 적절한 효소를 규명해야한다. 다만, 같은 글리코시다제에 속하는 효소라 하더라도 그 효소 활성이 글루코시다제, 셀룰라제와 같이 다양한 효소 활성을 나타낼 수 있으므로, 진세노사이드 F2로 전환시키는 활성을 지닌 적절한 효소를 규명해야할 필요성이 있다. 이에 본 발명자들은 이와 같은 활성을 갖는 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 분리 및 동정하여 그 기능을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 글리코시다제(Ginesenoside glycosidase)"는 이당류 이상의 사슬형 다당류의 글루코시드 분자결합을 가수분해하는 분해하는 효소를 의미한다. 진세노사이드 글리코시다제의 활성 정도 및 기능은 효소 종류마다 차이가 있다. 본 발명의 목적상 진세노사이드 F2로의 전환활성을 갖는 효소이면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 의미할 수 있다. 상기 진세노사이드 글리코시다제는 상기 진세노사이드 글리코시다제를 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제의 활성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 유사성이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 유사성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 진세노사이드 글리코시다제는 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus) KCTC 3870^T에서 유래한 효소로서, 이는 본원발명에서 Bgl P.muc과 혼용될 수 있다. 상기 진세노사이드 글리코시다제는 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 활성을 가져, 두 개의 글루코스 또는 글루코스가 치환된 분자를 연결하는 β1->2, β1->4, β1->6 결합을 분해할 수 있어, 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드인 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있다. 다만, 베타-글루코시다제 활성을 가지는 효소라고 하여도 모두 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환할 수 있는 활성을 가지고 있는 것은 아니며, 진세노사이드의 특정 탄소에 위치한 어떠한 당기를 자르는 활성을 지니는지 여부는 규명되어야 한다. 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제가 진세노사이드 3번 탄소 또는 20번 탄소의 당기를 잘라 마이너 진세노사이드인 진세노사이드 F2로 전환시키는 용도는 알려진바 없다.

상기 진세노사이드 글리코시다제는 특히 PPD 타입의 사포닌의 3번 탄소 또는 20번 탄소의 바깥쪽 글루코스에 대한 선택적 가수분해능을 가진다. 본 발명의 상기 진세노사이드 글리코시다제를 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 전환시켜 진세노사이드 F2를 제조하는 방법은 PPD 타입의 사포닌의 3번 탄소 또는/및 20번 탄소의 글루코스에 대한 선택적 가수분해로 제조되는 진세노사이드 F2를 제조하는 방법이라면 제한없이 포함될 수 있다. 대표적으로 본 발명의 실시예에서 진세노사이드 Rd를 진세노사이드 F2로 전환, 진세노사이드 Rb1을 지페노사이드 XVII로 전환, 지페노사이드 XVII를 진세노사이드 F2로 전환하여 진세노사이드 F2를 제조하는 것을 확인하여, PPD 타입의 사포닌의 3번 탄소 또는/및 20번 탄소의 글루코스에 대한 선택적 가수분해로 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있음을 확인하였다.

구체적으로, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 Rb1의 경우, Rb1의 3번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 3번 탄소에 위치한 두 개의 글루코스 모이어티(glucose moiety) 중 바깥쪽 글루코스(outer glucose)를 가수분해하여, 지페노사이드 XVII로 전환시킬 수 있으며, 상기 지페노사이드 XVII의 20번 탄소의 두 개의 글루코스 모이어티 중 바깥쪽 글루코스를 가수분해하여, 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있다. 또한, Rd의 3번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 3번 탄소의 두 개의 글루코스 모이어티 중 바깥쪽 글루코스를 선택적으로 제거하여, 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 진세노사이드 F2를 제조하는 방법은 바람직하게는 진세노사이드 Rb1으로부터 지페노사이드 XVII로의 전환 과정, 지페노사이드 XVII로부터 F2로의 전환 과정 및 진세노사이드 Rd로부터 F2로의 전환 과정으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 전환 과정을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 진세노사이드 글리코시다제의 전환 활성을 도 4에 나타내었다.

본 발명의 진세노사이드 F2를 제조하는 방법은 상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물과 PPD 타입의 사포닌을 반응시키는 단계에, α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase) 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase) 단백질"은 α-1,6 아라비노퓨라노실(α-1,6 arabinofurranosyl) 잔기에 대한 선택적 가수분해능을 지니는 효소를 의미한다. 본 발명의 목적상 α-1,6 아라비노퓨라노실 잔기에 대한 선택적 가수분해능을 갖는 효소이면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 α-L-아라비노퓨라노시다제 단백질을 의미할 수 있다. 상기 α-L-아라비노퓨라노시다제는 바람직하게는 PPD 타입의 사포닌의 20번 탄소에 존재하는 α-1,6 아라비노퓨라노실 잔기에 대해 선택적 가수분해능을 지니나, 이에 제한되지 않는다. 상기 α-L-아라비노퓨라노시다제는 진세노사이드 Rc의 20번 탄소에 존재하는 α-1,6 아라비노퓨라노실 잔기를 가수분해하여 진세노사이드 Rd로 전환시킬 수 있으므로, 상기 (a) α-L-아라비노퓨라노시다제를 이용하여 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 Rd로 전환시키는 단계, (b) 진세노사이드 글리코시다제를 이용하여 상기 전환된 진세노사이드 Rd를 진세노사이드 F2로 전환시키는 단계를 수행하여 진세노사이드 F2를 제조할 수 있다. 상기 α-L-아라비노퓨라노시다제는 상기 α-L-아라비노퓨라노시다제를 서열번호 5로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 α-L-아라비노퓨라노시다제의 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 α-L-아라비노퓨라노시다제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 α-L-아라비노퓨라노시다제는 바람직하게는 서열번호 6으로 기재된 핵산 서열로 정의되는 α-L-아라비노퓨라노시다제를 의미할 수 있으나, α-L-아라비노퓨라노시다제 활성을 갖는 서열인 한 이에 제한되지 않는다. 상기 α-L-아라비노퓨라노시다제는 서열번호 6으로 기재한 핵산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 핵산 서열로서 실질적으로 α-N-아라비노퓨라노시다제의 활성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있는 핵산을 포함한다.

진세노사이드 F2를 제조하는 방법에 있어, 상기 진세노사이드 글리코시다제 및 α-L-아라비노퓨라노시다제는 순차적으로 사용될 수 있다. 바람직하게는 α-L-아라비노퓨라노시다제를 사용하여 진세노사이드 Rc와 먼저 반응시킨 후, 진세노사이드 글리코시다제를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법의 예로, α-L-아라비노퓨라노시다제는 35 내지 37℃ 온도에서 최적의 효소활성을 지니므로, 35 내지 37℃ 온도에서 Rc와 먼저 반응시킨 후, 이를 37 내지 55℃ 온도에서 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제와 반응시켜, 진세노사이드 F2를 제조할 수 있다.

본 발명의 진세노사이드 F2를 제조하는 방법은 상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 배양물과 PPD 타입의 사포닌을 반응시키는 단계를 포함한다. 이에 α-L-아라비노퓨라노시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 말한다. 본 발명에서는 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터 또는 α-L-아라비노퓨라노시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 제조된 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 상기 단백질들을 수득할 수 있게 된다.

본 발명에서 제공하는 상기 진세노사이드 글리코시다제 또는 α-L-아라비노퓨라노시다제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터는 이에 제한되지 않으나, 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)를 포함한다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터 제작에 있어서, pGEX4T-1 벡터를 사용하였다.

아울러 본 발명의 벡터로서, 핵산 발현 활성화 단백질(예를 들어, B42같은)이 연결된 융합 플라스미드(fusion plasmid, 예를 들어, pJG4-5)가 사용될 수 있다. 이러한 융합 플라스미드에는 GST, GFP, His-tag, Myc-tag 등을 태그(tag)로 포함할 수 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 융합 플라스미드가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 발현된 진세노사이드 글리코시다제를 용이하게 정제, 회수 및 용해성 단백질 비율을 높이기 위하여 GST(glutathione S-transferase)를 퓨전 태그로 사용하였다.

또한, 본 발명에서 회수되는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 벡터는 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함될수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 헥사히스티딘(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 헥사히스티딘(hexahistidine)일 수 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질의 경우, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 헥사히스티딘이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼(Novagen, USA)을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.

본 발명의 핵산을 벡터로 삽입하기 위해, 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한 부위 또는 클로닝 부위에 삽입하는 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, Bgl P.muc를 코딩하는 유전자는 BamHI과 XhoI 제한효소를 이용하여 절단된 사이에 삽입되었다.

본 발명의 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산 또는 α-L-아라비노퓨라노시다제 단백질을 코딩하는 핵산은 벡터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 발명의 벡터는 프로모터 및 본 발명의 핵산 외에 인핸서(enhancer)와 같은 시스 요소(cis element), 스플라이싱 시그널(splicing signal), 폴리 A 추가 시그널(poly A addition signal), 선택 마커(selection marker), 라이보좀 결합 서열(ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택 마커의 예로, 클로람페니콜 저항 핵산, 암피실린 저항 핵산, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 핵산 등이 사용될 수 있으나, 상기 예들에 의해 작동 가능하도록 연결되는 추가적 구성요소가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 α-L-아라비노퓨라노시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.

상기의 방법으로 형질전환된 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체는 PPD 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있는 활성을 지니며, 바람직하게는 PPD 타입의 사포닌인 진세노사이드 Rb1로부터 지페노사이드 XVII로의 전환활성, 지페노사이드 XVII로부터 진세노사이드 F2로의 전환활성, 또는 진세노사이드 Rd로부터 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있는 활성을 지닌 형질전환체를 의미하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, α-L-아라비노퓨라노시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터가 도입된 형질전환체는 α-1,6 아라비노퓨라노실 잔기를 선택적으로 가수분해할 수 있는 활성을 지니며, 바람직하게는 진세노사이드 Rc의 20번 탄소에 위치한 α-1,6 아라비노퓨라노실 잔기를 가수분해하여 진세노사이드 Rd로 전환시킬 수 있는 활성을 지닐 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 숙주는 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)같은 바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포가 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 대장균 균주의 구체적인 예로는 CL41(DE3), BL21 또는 HB101이, 바실러스 서브틸리스 균주의 구체적인 예로는 WB700 또는 LKS87이 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 대장균 세포 CL41(DE3)을 숙주 세포로 하여 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제조하였다.

대장균과 같은 세균이 숙주로서 사용될 때, 본 발명의 재조합 벡터는 숙주 내에서 자율적인 복제를 할 수 있고, 프로모터, 라이보좀 결합서열, 본 발명의 핵산 및 전사 종료 서열(transcription termination sequence)로 구성되어 있다.

본 발명의 프로모터는, 본 발명의 핵산을 대장균과 같은 숙주에서 발현하도록 하는 한 어떠한 프로모터도 사용될 수 있다. 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터 또는 PR 프로모터 같은 대장균 또는 파아지-유래 프로모터; T7 프로모터 같은 대장균 감염 파아지-유래 프로모터가 사용될 수 있다. 또한 tac 프로모터 같은 인공적으로 변형된 프로모터도 사용될 수 있다.

상기 형질전환체를 배양하여 수득한 배양물을 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 전환시켜 진세노사이드 F2를 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어, "배양물"은 상기 형질전환체를 공지된 미생물 배양방법에 따라 배양한 다음 수득한 산물을 의미할 수 있다. 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터가 도입된 형질전환체의 배양물은 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제를 포함하여, 진세노사이드 Rb1을 지페노사이드 XVII로 전환, 지페노사이드 XVII를 진세노사이드 F2로 전환 또는 진세노사이드 Rd를 진세노사이드 F2로의 전환시킬 수 있는 활성을 가지는 배양물을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, α-L-아라비노퓨라노시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터가 도입된 형질전환체의 배양물은 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 Rd로 전환시킬 수 있는 활성을 가지는 배양물을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 실시예에서는 패니바실러스 무실라지노서스 KCTC 3870^T로부터 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 진세노사이드 글리코시다제를 분리 및 정제하였고, 이를 Bgl P.muc로 명명하였다(실시예 1). 상기 Bgl P.muc를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1260bp 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 419개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 코딩한다.

또한, Bgl P.muc는 베타-글루코시다제의 효소 활성을 지녀, PPD 타입의 진세노사이드인 Rb1의 3번 탄소에 위치한 바깥쪽 글루코스를 분해하여 지페노사이드 XVII로 전환시키고, 지페노사이드 XVII의 20번 탄소에 위치한 바깥쪽 글루코스를 분해하여 진세노사이드 F2로 전환시키는 활성을 지님을 확인하였고, 또한, 진세노사이드 Rd의 3번 탄소에 위치한 바깥쪽 글루코스를 분해하여 진세노사이드 F2로 전환시키는 활성을 지님을 확인함으로써, 3번 탄소 또는/및 20번 탄소에 위치한 글루코스에 대하여 선택적 가수분해능이 있는 것을 확인하였다(도 3). 아울러, 진세노사이드 글리코시다제 외에 α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase)를 추가로 사용하는 경우, 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있음을 확인하였다(도 6).

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌인 진세노사이드 F2로의 전환용 조성물을 제공한다.

상기 PPD 타입의 사포닌, 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 형질전환체 또는 이의 배양물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 진세노사이드 F2로의 전환용 조성물은 α-L-아라비노퓨라노시다제 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 추가로 포함할 수 있다.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질은 PPD 타입의 사포닌의 3번 탄소 또는 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 지니므로 마이너 진세노사이드인 F2를 생산하는데 있어 유용하게 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산은 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 핵산을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 진세노사이드 글루코시다제를 코딩하는 핵산은 진세노사이드 글루코시다제의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 핵산인 한 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 상기 유사성은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 진세노사이드 글리코시다제 단백질은 PPD 타입의 진세노사이드를 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성인 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있으며, 이 단백질은 활성 및 안정성이 유지될 수 있는 한 다양한 온도 및 pH 조건에서 사용될 수 있으며, ZnCl₂, MnCl₂, CaCl₂, CoCl₂, MgCl₂, EDTA, NaCl, KCl, CuCl₂, SDS, DTT 및 머캅토에탄올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 금속 및 화학 제재를 함께 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 진세노사이드 글리코시다제의 효소 특성을 분석하여 50℃이하에서 효소의 안정성이 탁월하였으며, 37-55℃에서 효소의 활성이 높았고, pH 7.0-8.0에서 효소의 안정성 및 활성이 탁월한 것을 확인하였다(도 5a 및 5b).

본 발명의 신규한 진세노사이드 글리코시다제는 PPD 타입의 사포닌을 체내 흡수가 용이한 형태인 진세노사이드 F2로 전환시키는 우수한 활성을 나타내어, 그 약리 효과가 입증되었음에도 천연에서 미량으로만 생산되어 이용에 제한이 따랐던 마이너 형태의 진세노사이드 F2를 대량으로 생산 및 제조하는데 이용될 수 있다.

도 1은, PPD(protopanaxadiol) 타입 진세노사이드의 종류를 나타낸 것이다.
도 2는, Bgl P.muc 정제를 위한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
M, 단백질 분자량 마커; S: E. coli 에서 대량 발현 후 가용화된 GST fusion된 Bgl P.muc; P: E. coli 에서 대량 발현 후 침전된 Bgl P.muc 유도 전 전체 세포
도 3은, Bgl P.muc 단백질의 생전환 활성을 나타내는 TLC사진이다.
S, 진세노사이드 표준물질 마커; lane 1, 진세노사이드 Rb1의 진세노사이드 F2로의 전환; lane 2, 진세노사이드 Rb2의 진세노사이드 C-O로의 전환; lane 3, 진세노사이드 Rc의 진세노사이드 C-Mc1으로의 전환; lane 4, 지페노사이드 XVII의 진세노사이드 F2로의 전환; 5, 진세노사이드 Rd의 진세노사이드 F2로의 전환.
도 4는, Bgl P.muc 단백질의 생전환 반응경로를 나타내는 모식도이다.
도 5a는, E.coli 로부터 정제된 Bgl P.muc의 pH에 따른 안정성 및 활성을 나타내는 그래프이고, 도 5b는, 온도에 따른 안정성 및 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은, PPD 타입 진세노사이드 혼합물(PPD type ginsenoside mixture)를 기질로 이용하여 α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase)를 선 이용하여 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 Rd로 전환시킨 후, Bgl P.muc 단백질을 이용하여 진세노사이드 Rb1 및 Rd를 진세노사이드 F2로 모두 전환시킨 HPLC 분석결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 신규한 진세노사이드 글리코시다제(gincenoside glycosidase)의 제조

실시예 1-1: 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작

본 발명에서는 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있는 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 제조하기 위하여, 먼저 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus) KCTC 3870^T 균주로부터 신규한 진세노사이드 글리코시다제(gincenoside glycosidase)를 스크리닝하였으며, 이를 Bgl P.muc로 명명하였다.

구체적으로, 이미 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 특정되어 있는 패니바실러스 무실라지노서스(KCTC 3870^T) 균주를 선발하고, 이의 게놈 DNA를 추출하였다. 이의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 정방향 프라이머(서열번호 3)와 역방향 프라이머(서열번호 4)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 상기 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

프라이머	서열(5'->3')	서열번호
정방향 프라이머	GGTTCCGCGTGGATCCgaatatatttttccacagcaattt	서열번호 3
역방향 프라이머	GATGCGGCCGCTCGAGttacagcactttcgtggatgcgat	서열번호 4

상기 반응으로 증폭된 단편을, 글루타티온 S-트랜스퍼라제가 삽입되어 있는 플라스미드 벡터 pGEX4T-1(GE Healthcare, USA)에 EzCloning Kit(Enzynomics)를 이용하여 삽입하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터 GST-Bgl P.muc 진세노사이드 글리코시다제를 제작하였다. 상기 재조합 발현 벡터를 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환(transformation)시켰다.

실시예 1-2: 진세노사이드 글리코시다제(gincenoside glycosidase)의 발현

실시예 1-1의 진세노사이드 글리코시다제를 대량 생산하기 위하여, 상기 형질전환된 균주를 앰피실린(Ampicillin)이 첨가된 LB 배지 100 ㎖가 들어있는 삼각플라스크에 접종하여 600 ㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 200 rpm으로 종균 배양을 실시하였다. 가용성 단백질의 발현여부를 여러 온도(18, 22, 25, 30, 37℃)에 따라 확인하기 여기에 최종 0.1 mM IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside) 농도가 되도록 첨가하여 진세노사이드 글리코시다제의 대량 발현을 유도하였다. 균주가 정체기(staionary phase)에 들었을 때, 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 100 mM 인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer, pH 7.0)를 첨가하여 현탁한 후, 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리한 다음, 수용성인 진세노사이드 글리코시다제를 진세노사이드 생산에 사용될 수 있는 상등액으로부터 획득하였다. 분리정제된 진세노사이드 글리코시다제를 SDS-PAGE로 분석하였다. 이때, 상기 진세노사이드 글리코시다제 Bgl P.muc의 아미노산 개수는 419개이며, 상기 Bgl P.muc의 아미노산 서열을 서열번호 1로 표시하였다. GST fusion 단백질은 약 70 kDa의 분자량을 나타내었다(도 2).

실시예 2: 진세노사이드 글리코시다제 Bgl P.Muc의 진세노사이드 특이적 전환 능력 평가 및 분석

진세노사이드 3번 탄소(C-3) 및 20번 탄소(C-20) 부위에 부착된 글루코스 가수분해에 대한 효소의 특이성 및 선택성을 분석하기 위하여, 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 지페노사이드 XVII을 기질로 사용하였다. 효소 0.2U, 50mM 인산 나트륨 버퍼 0.1%(w/v) (pH 7.0), 및 기질을 포함하는 각 반응 혼합물을 37℃에서 배양하였다. 샘플을 적절한 간격으로 수거하여, 수용액-포화된 부탄올 동량 부피를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. n-부탄올 분획을 건조하여 증발시키고, 잔기를 CH₃OH에 용해시켜 TLC(thin layer chromatography)로 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 진세노사이드 Rb1의 경우 진세노사이드 F2로 전환되었고(레인 1), 진세노사이드 Rb2의 경우 진세노사이드 C-O로 전환되었으며(레인 2), 진세노사이드 Rc의 경우 C-Mc1으로 전환되었으며(레인 3), 지페노사이드 XVII 및 Rd는 F2로 전환된 결과를 보였다(레인 4 및 5).

이러한 결과는 진세노사이드 Rb1의 경우 진세노사이드 Rb1의 3번 탄소 위치에 존재하는 두 글루코스 모이어티에서 말단 글루코스(outer glucose)가 절단됨으로써 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII, Gyp XVII)로 전환되고, 지페노사이드 XVII이 다시 진세노사이드 F2로 전환되는 것을 나타내는 것이다. 또한, 진세노사이드 Rb2의 3번 탄소 위치에 존재하는 두 글루코스 모이어티에서 말단 글루코스가 절단됨으로써 진세노사이드 C-O로 전환된다. 또한, 진세노사이드 Rc는 3번 탄소 위치 말단의 글루코스가 절단됨으로써 컴파운드 Mc1으로 전환되는 것을 나타내는 것이다(도 3).

실시예 3: 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Bgl P.muc)를 이용한 미량 진세노사이드 대량 생산

실시예 3-1: 진세노사이드 글리코시다제(Bgl P.muc)를 포함하는 효소액 획득

10 g 단위 미량 진세노사이드들을 생산하기 위한 효소액을 대량으로 얻기 위해서는 10 L 단위의 발효기(fermentor)에 형질전환된 E. coli 세포를 키워야하므로, 하기와 같은 과정을 수행하였다. 본 배양에 앞서, 전날 500 ml 플라스크에 앰피실린이 함유된 LB 배지에 GST-Bgl P.muc이 함유되어 있는 형질전환된 E.coli BL21(DE3) 세포를 접종하여 다음 날 10 L 발효기(fermentor)에서 6 L 볼륨의 LB에 접종하여 600 ㎚에서의 흡광도가 3이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 500 rpm으로 배양을 실시하였다. 수용성 재조합 단백질인 Bgl P.muc의 발현 유도하기 위해서 발효기의 온도를 30 ℃로 낮추고, E.coli 세포의 추가 성장을 원활히 하기 위하여 글루코스 용액(600 g/L)을 200-500 ml 을 넣어주었다. 여기에 1 M 인산나트륨 버퍼 300-500 ml를 넣어주어서 안정적인 pH 조건을 꾀하였다. 여기에 최종IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside) 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가하여 진세노사이드 글리코시다제 Bgl P.Muc의 대량 발현을 유도하였다. 20 내지 36시간 동안 이를 배양하여 균주가 정체기(staionary phase)에 들었을 때 상기 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여, E. coli 세포를 200 g 얻을 수 있었다 (30g/L 전후). 이에 100 mM 인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer, pH 7.0)를 첨가하여 현탁한 다음, 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 수용성으로 발현된 상기 Bgl P.Muc가 들어있어 진세노사이드 생산에 사용될 수 있는 효소액을 대량으로 획득하였다.

실시예 3-2: 진세노사이드 F2 대량 생산

상기 실시예 3-1에서 대량으로 얻어진 효소액 1 L에 최대 농도 10%인 PPD type 진세노사이드 혼합물(Rb1, Rb2, Rc, Rd) 1 L를 37℃의 온도에서 150rpm으로 교반시키면서 반응시켰다. Bgl P.muc만 단독으로 사용시에는 진세노사이드 Rb1과 Rd는 모두 F2로 전환이 가능하나, 진세노사이드 Rc가 C-Mc1으로 전환되어서 최고 높은 순도의 F2를 얻기에는 어려우므로 이를 극복하기 위하여 본 발명자 소유의 α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase)를 복합적으로 넣고 반응시켰을 때는 Rc 또한 Rd를 거쳐 F2로 전환된다는 것을 확인하였다(도 6). 반응을 중단시키고 전환된 F2을 회수하기 위하여 주정을 70%가 되도록 첨가하여 재조합 효소는 불활성시켜 다운시키고, 진세노사이드 F2는 용해시켰다. 용해된 진세노사이드는 다시 알콜 농도를 낮추어 HP20 다공성 수지로 흡착 후, 물로 세척 후, 80% 에탄올을 이용하여 탈착시킨 후, 감압식 회전 증발기로 날려서 순도 높은 진세노사이드 F2를 획득할 수 있었다. 최종적으로 PPD 혼합물 100 g을 반응시켜서 46.7g의 진세노사이드 F2을 얻을 수 있었다.

실시예 4: 진세노사이드 글리코시다제(Bgl P.muc) 효소 특성 분석

2.0 mM pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma)를 포함하는 pH 7.0, 50 mM 인산 나트륨 버퍼 90 μl에 대해 특이 활성을 측정하였고, 반응 개시 전 10 μl 희석 정제 효소와 37℃에서 20분 동안 반응시켜 배양하였다. 1M Na₂CO₃ 0.1ml로 5 분 동안 처리하여 반응을 종료시키고, 405nm에서 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 분비를 즉각적으로 측정하였다. 활성 유닛(one unit of activity)을 분당 p-니트로페놀 1 μmol의 분비량으로 정의하였다. 특이 활성은 단백질 밀리그램(milligram)당 유닛으로 발현되었다. Bio-Rad 단백질 분석 염색 시약 프로토콜을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 모든 분석은 적어도 세 번 이상 수행하였다.

실시예 4-1: pH 변화에 따른 효과 측정

pH가 효소 활성에 미치는 효과를 측정하였다. 기질은 2.0 mM pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma)을 사용하였고, 하기와 같은 버퍼(50 mM)를 사용하여 pH를 조절하였다.

pH 2 내지 10의 범위: KCl-HCl(pH 2), 글라이신-HCl(pH 3), 아세트산 나트륨(pH 4 및 5), 인산 나트륨(pH 6 및 7), Tris-HCl (pH 8 및 9) 및 글라이신-수산화나트륨(pH 10)

또한, pH가 효소 안정성에 미치는 효과를 측정하였다. 4 ℃, 24시간 동안 상기 언급된 버퍼 각각에서 효소를 배양한 후, 50mM 칼륨(potassium) 버퍼 내에서 pHPGlc을 분석함으로써 pH 변동에 따른 효소 안정성을 측정하였다. 표준 분석 방법에 의해 잔기 활성을 분석하여 최적 pH에서 수득된 활성 확률로서 그 결과를 도 5a에 나타내었다.

그 결과, 진세노사이드 글리코시다제(Bgl P.muc)는 pH 6.0-8.0에서 효소의 안정성 및 활성이 탁월하였으며, pH 8.0에서 가장 높은 활성을 나타내었다(도 5a).

실시예 4-2: 온도 변화에 따른 효과 측정

온도가 효소 활성에 미치는 효과를 측정하였다. 4-90℃로 온도를 조절하였으며, pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma) 2.0mM을 사용하여 5분 동안 최적 pH에서 50mM 인산 칼륨 버퍼 내 온도 의존적 활성을 분석하였다.

또한, 동일 온도 범위 내에서 30분 동안 인산 칼륨 버퍼 50mM 내 효소 당량을 배양함으로써 온도 안정성 분석을 수행하였다. 이는 10분간 얼음으로 샘플을 냉각한 후, 표준 분석 방법에 의해 측정된 잔존 활성을 확인함으로써 수행한 후, 그 결과를 도 5b에 나타내었다.

그 결과, Bgl P.muc의 활성은 40-55℃에서 최고치를 보인 반면, 열 안정성 실험 결과 37 ℃이하의 온도에서는 안정한 것으로 나타났다. 다만, 45℃에서는 30분경과 후 50% 가량의 활성을 상실하였다(도 5b).

상기와 같은 결과들은 본 발명의 서열번호 1의 진세노사이드 글리코시다제가 PPD 타입의 사포닌을 효율적으로 전환시켜서 가용성 사포닌인 진세노사이드 F2를 효율적으로 제작할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Intelligent Synthetic Biology Center <120> Production of ginsenoside F2 using novel ginsenoside glycosidase <130> PA120466KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 419 <212> PRT <213> Paenibacillus mucilaginosus <400> 1 Met Glu Tyr Ile Phe Pro Gln Gln Phe Met Phe Gly Ser Ala Thr Ala 1 5 10 15 Ala Tyr Gln Val Glu Gly Asn Asn Thr Asn Ser Asp Phe Trp Ala Glu 20 25 30 Glu His Ala Glu Gly Ser Pro Tyr Gln Asp Lys Ser Gly Asp Ala Val 35 40 45 Asp His Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Asp Ile Ala Leu Met Ala Ser Leu 50 55 60 Gly Leu Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Ile Glu Trp Ala Arg Ile Glu Pro 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Phe Ser Leu Ser Ala Ile Ala His Tyr Arg Asp Val 85 90 95 Leu Gln Ala Cys Tyr Glu His Arg Leu Thr Pro Val Val Ala Met His 100 105 110 His Phe Ser Ser Pro Gln Trp Leu Met Arg Phe Gly Gly Trp Gly Ser 115 120 125 Glu Glu Val Pro Glu Arg Phe Ala Lys Tyr Cys Glu Phe Val Phe Gln 130 135 140 Glu Leu Gly Asp Leu Ile Pro Tyr Val Leu Thr Phe Asn Glu Val Asn 145 150 155 160 Leu Pro Val Met Leu Arg Glu Val Phe Ser Ser Ile Gly Ile Ile Pro 165 170 175 Pro Val Gly Ile Asp Gly Ala Ala Trp Thr Ala Pro Gly Trp Arg Ala 180 185 190 Ser Ala Ala Gln Leu Cys Gly Thr Thr Ala Asp Arg Tyr Val Thr Phe 195 200 205 His Met Ile Ser Asp Glu Pro Lys Ile Ala Leu Leu Met Glu Ala His 210 215 220 Arg Arg Ala Arg Gln Thr Ile Lys Arg Leu Gln Pro Asn Ala Lys Val 225 230 235 240 Gly Leu Ser Met Ala Leu Ser Asp Ile Gln Ser Val Pro Gly Gly Glu 245 250 255 Ala Trp Ala Gln Gln Lys Trp Gln Gln Tyr Phe Glu Gln Tyr Leu Pro 260 265 270 Ala Leu Glu Gly Asp Asp Phe Phe Gly Leu Gln Asn Tyr Thr Arg Glu 275 280 285 Val Tyr Gly Pro Glu Gly Arg Val Thr Pro Ala Ala Asp Ala Glu Leu 290 295 300 Thr Gln Met Lys Tyr Glu Tyr Tyr Pro Glu Ala Leu Glu Gln Val Ile 305 310 315 320 Arg Lys Val Ala Lys Ala Leu Thr Leu Pro Ile Phe Val Thr Glu His 325 330 335 Gly Val Ala Thr Asp Asp Asp Glu Arg Arg Ile Glu Phe Ile Arg Arg 340 345 350 Gly Leu Gln Gly Val His Ala Cys Leu Glu Glu Gly Ile Asp Val Arg 355 360 365 Gly Tyr Leu His Trp Thr Thr Phe Asp Asn Phe Glu Trp Asn Ala Gly 370 375 380 Tyr Ser Met Arg Phe Gly Leu Ile Gly Val Asp Arg Thr Thr Gln Glu 385 390 395 400 Arg Thr Val Lys Glu Ser Ala Arg Tyr Leu Gly Arg Ile Ala Ser Thr 405 410 415 Lys Val Leu <210> 2 <211> 1260 <212> DNA <213> Paenibacillus mucilaginosus <400> 2 atggaatata tttttccaca gcaatttatg ttcggctcgg ccacggcggc ttatcaagtc 60 gaaggcaaca ataccaacag cgatttttgg gcggaggagc atgcggaagg ctctccgtac 120 caagacaagt ccggagatgc agtcgatcat taccgtctct atagagagga tatcgcactc 180 atggccagcc tcgggctgaa ggcttaccgc ttctcgatcg agtgggcaag aatcgagccg 240 gctcccggac agttttccct gtcggccatc gcgcattacc gggatgtact gcaggcctgc 300 tatgagcaca ggctgacgcc tgtcgtcgct atgcatcact tctcatcccc gcagtggctg 360 atgcgattcg gagggtgggg gagcgaggaa gttccggaac gcttcgcgaa gtattgcgaa 420 ttcgtgtttc aggagctggg cgaccttatt ccctacgtgc tgacattcaa tgaagtcaat 480 cttccggtta tgctccgcga ggtgttcagc agcatcggca tcataccgcc ggtcggcatt 540 gacggcgcag cctggacggc acccggatgg cgggcatccg cagcacagct gtgcggcaca 600 acggcggatc gatacgtcac cttccacatg atctcggacg agccgaagat tgcgctgctg 660 atggaagccc accgccgcgc aaggcagacg atcaaacgtc tgcagccgaa cgccaaagtc 720 gggctttcga tggccttatc cgacattcag tccgttccgg gcggagaagc atgggcccag 780 cagaaatggc agcagtattt cgaacagtat ttgcctgcct tggagggcga cgatttcttc 840 ggtctgcaga attacacgag ggaagtctac ggacccgagg gccgggtgac accggctgcc 900 gacgccgagc tgacccagat gaaatatgag tattaccccg aagctctgga gcaggtgatc 960 cgcaaggttg ccaaagcgtt gacgcttccg atattcgtca ccgaacatgg cgtggctacg 1020 gatgacgacg agcggcggat tgaatttatc cggcgcggcc tgcagggggt tcatgcttgt 1080 ctcgaagagg gcattgatgt aaggggctat ctgcactgga cgaccttcga taacttcgaa 1140 tggaatgccg gttattcgat gcggttcggc ctgatcgggg tggaccggac gactcaggaa 1200 cggaccgtga aagaaagcgc acgttatttg ggacggatcg catccacgaa agtgctgtaa 1260 1260 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 ggttccgcgt ggatccgaat atatttttcc acagcaattt 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 gatgcggccg ctcgagttac agcactttcg tggatgcgat 40 <210> 5 <211> 508 <212> PRT <213> Leuconostoc sp. <400> 5 Met Lys Val Lys Ile Glu Lys Arg Gln Asn Glu Thr Lys Ile Asn Pro 1 5 10 15 Arg Leu His Gly Gln Phe Ile Glu Phe Leu Gly Asn Ala Ile Asn Asp 20 25 30 Gly Ile Trp Val Gly Lys Glu Ser Lys Ile Pro Asn Ile Asn Gly Met 35 40 45 Arg Leu Asp Val Ile Asn Ala Leu Lys Glu Ile Glu Pro Pro Ile Ile 50 55 60 Arg Trp Pro Gly Gly Val Phe Ala Asp His Tyr Asn Trp Arg Asp Gly 65 70 75 80 Val Gly Glu Lys Arg Glu Lys Val Phe Asn Glu Gly Phe Gly Thr Tyr 85 90 95 Ser Val Glu Thr Asn Glu Phe Gly Thr Asp Glu Phe Leu Glu Phe Ala 100 105 110 Ser Leu Ile His Ser Glu Pro Trp Ile Asn Val Asn Leu Leu Thr Gly 115 120 125 Ser Ala Arg Glu Met Thr Glu Trp Met Glu Tyr Ile Asn Arg Lys Gln 130 135 140 Ser Thr Tyr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Asp Ser Gly His Glu Lys Pro 145 150 155 160 Tyr Asp Val Asn Tyr Trp Gly Ile Gly Asn Glu Val Trp Gly Gly Gly 165 170 175 Gly Met Met Thr Pro Glu Gln Tyr Val Ala Asp Tyr Arg Lys Tyr Ala 180 185 190 Thr Ala Ala Pro Thr Phe Ala Leu Asn Gln Phe Ser Glu Asp Ser Arg 195 200 205 Tyr Phe Ile Leu Ser Gly Ala Asp Ala Asn Lys Pro Lys Glu Arg Arg 210 215 220 Tyr Trp Thr Lys Ser Val Met Lys Glu Leu Ala Arg Ala Arg Pro Pro 225 230 235 240 Lys Val Asp Gly Tyr Asp Leu His Trp Tyr Asn Trp Tyr Leu Gly Asn 245 250 255 Glu Phe Ser Ala Ser Ala Thr Asp Phe Asn Ala Asn Asp Trp Tyr Gln 260 265 270 Val Ile Lys Gly Ala Thr Glu Leu Glu Asp Ile Leu Lys Glu Gln Tyr 275 280 285 Asp Leu Ile Gln Asp Gly Leu Asp Gln Leu Pro Glu Pro Glu Gly Glu 290 295 300 Phe Asp Gln Lys Leu Glu Lys Met Asp Leu Ile Leu Gly Glu Trp Gly 305 310 315 320 Asn Trp Tyr Gly Arg Ala Phe Phe Glu Glu Lys Ala Leu Tyr Gln Gln 325 330 335 Asn Thr Met Arg Asp Ala Ile Thr Thr Ala Ile Val Leu Asp Ile Leu 340 345 350 His Ser Asn Ala Asp Lys Val Lys Met Ala Ser Met Ala Gln Thr Ile 355 360 365 Asn Val Leu Asn Ala Leu Ile Leu Thr Asn Gly Glu Gln Phe Val Leu 370 375 380 Thr Pro Val Tyr Asp Ile Phe Lys Met Tyr Lys Val His Arg Asn Asn 385 390 395 400 Asp Val Leu Asp Val Thr Ile Thr Asp Glu Asn Ser Asp His Val Lys 405 410 415 Phe Phe Ala Ser Ile Asn Asp Lys Thr Ile Tyr Leu Asn Val Ile Asn 420 425 430 Phe Asp Leu Thr Glu Thr Ile Ser Val Asp Ile Asp Leu Pro Gly Leu 435 440 445 Val Leu Gln Tyr Gln Lys Glu Glu Leu Ala Ala Asn Asp Met His Glu 450 455 460 Thr Asn Thr Phe Glu Asp Pro Asn Gln Leu Arg Ala Ala Ile Val Glu 465 470 475 480 Gln Arg Asn Asn Val Ser Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ile Ser Ile Lys 485 490 495 Pro Met Ser Val Ser Val Phe Lys Ile Val Leu Gly 500 505 <210> 6 <211> 1527 <212> DNA <213> Leuconostoc sp. <400> 6 atgaaagtta aaatagaaaa acgtcaaaat gagactaaaa tcaatccacg tttacatggt 60 caatttatag aatttcttgg taatgcgata aatgatggta tatgggtcgg aaaagaaagt 120 aaaatcccaa acattaatgg gatgcggtta gatgtcatta acgccttgaa agaaattgaa 180 cctccaatta taaggtggcc aggtggtgta tttgcggatc attacaattg gcgagacgga 240 gttggggaaa aaagggaaaa ggtatttaac gaaggattcg gaacatatag cgttgaaacc 300 aatgagtttg 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atatgatatt ttcaagatgt acaaagtgca tagaaataat 1200 gatgttctag atgtgacaat aacagatgag aatagtgatc acgttaagtt ttttgcatca 1260 ataaatgaca aaacaattta cttaaatgtg attaattttg atttgactga aaccatcagt 1320 gttgacattg atttaccagg gttggtactt cagtatcaaa aggaggagtt agcggccaat 1380 gatatgcatg aaaccaatac gttcgaggat cctaatcaac tacgtgcagc gattgttgaa 1440 cagcgtaata atgtttctgc gaatgagtta tttgatatta gcataaagcc aatgtcagtt 1500 tctgtattca aaattgtatt aggttag 1527

Claims (12)

1. 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD(protopanaxadiol) 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 F2를 제조하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질은 PPD 타입의 사포닌의 3번 탄소 또는 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가지는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 진세노사이드 F2의 제조는 진세노사이드 Rb1으로부터 지페노사이드(Gypenoside) XVII로의 전환 과정, 지페노사이드(Gypenoside) XVII으로부터 진세노사이드 F2로의 전환 과정 및 진세노사이드 Rd로부터 진세노사이드 F2로의 전환 과정으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 전환 과정을 포함하는 방법에 의해서 수행되는 것인 방법.
   
4. 제1항에 있어서, α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 α-L-아라비노퓨라노시다제 단백질은 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 것인 방법.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 진세노사이드 F2의 제조방법은 상기 α-L-아라비노퓨라노시다제 단백질 활성에 의해서 진세노사이드 Rc의 진세노사이드 Rd로의 전환 과정을 추가로 포함하는 것인 방법.
   
7. 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD(protopanaxadiol) 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌인 진세노사이드 F2로의 전환용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서, α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 추가로 포함하는 조성물.
   
9. 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase) 단백질.
   
10. 제9항의 단백질을 코딩하는 핵산.
    
11. 제10항의 핵산을 포함하는 벡터.
    
12. 제11항의 벡터가 도입된 형질 전환체.

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