WO2016039575A1 - 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 혼합 효소에 의한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법 - Google Patents

고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 혼합 효소에 의한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법 Download PDF

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arabinofuranosidase
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beta
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오덕근
신경철
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건국대학교 산학협력단
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    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the preparation of ginsenoside compound K using high temperature beta-glycosidase and alpha-L-arabinofuranosidase enzyme and More specifically, the present invention relates to a preparation method, and more particularly, a pyrogenic beta derived from Sulfolobus solfataricus and Caldicellulosiruptor saccharolyticus strains, showing stable activity even at high temperatures.
  • glycosidase and alpha-L-arabinofuranosidase enzymes the reaction rate can be rapidly controlled at high temperatures, thereby enabling industrial production of ginsenoside compound k in short time from red and red ginseng extracts.
  • Compositions for the preparation of ginsenoside compound k which can be used for It relates to crude methods.
  • Ginsenoside compound K (20 (S) -Proptophanacanadiol-20-O-beta-di-glucopyranoside, see Formula 1 below) is an enteric bacterial metabolite of ginseng saponin component, protopa
  • the glucose moiety is produced by hydrolysis of the ginsenoside Rb1, the ginsenoside Rb2, the ginsenoside Rc, and the ginsenoside Rd, which are naxadiol-based saponins.
  • ginsenoside compound K is known to have various excellent effects such as immune enhancement, tumor angiogenesis inhibition, cancer cell invasion inhibition and cancer cell proliferation. Therefore, the need for stable and efficient production is increasing.
  • ginsenoside compound k Conventional techniques for the preparation of such ginsenoside compound k include diol-based saponins, enzymes beta-glycosidase (Korea Patent Publication No. 2003-94757), cellulase or Aspergillus genus isolated from the genus Penicillium By treating beta-galactosidase (Korean Patent No. 377546) isolated in the US, naringinase isolated in the penicillium or pectinase (Korean Patent No. 418604) isolated in the Aspergillus genus Methods of making compound k are known.
  • ginsenoside compound k is produced using a mesophilic enzyme having a temperature in the range of 10 to 50 ° C., but the enzyme has a problem of being easily contaminated with microorganisms and having a low production yield because it operates at a low reaction temperature.
  • ginsenoside compound k To produce high yields of ginsenoside compound k, several enzymes must be mixed and used. Enzyme mixture showed the highest productivity during the production of ginsenoside compound k.
  • This method was characterized by beta-glucosidase (6.3 mg / ml) derived from sulforobus ashido caldarius and cardicellulose syrup sakaroloi.
  • Alpha-L-arabinofuranosidase (1.4 mg / ml) and beta-galactosidase (1.4 mg / ml) derived from ticus were used in a method of about 5 mg / ml of protoparanaxadiol.
  • the present invention solves the above problems, and the object of the present invention is to provide a composition for producing a large amount of high yield ginsenoside compound k in a short time.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a large amount of high yield ginsenoside compound k in a short time.
  • the present invention provides a ginsenoside compound k (beta-glycosidase) and alpha-L-arabinofuranosidase ( ⁇ -L-arabinofuranosidase) as an active ingredient.
  • compound K Provides a composition for preparation.
  • the beta-glycosidase ( ⁇ -glycosidase) is preferably composed of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, but induces mutations such as one or more substitutions, deletions, etc. in the sequence of the present invention All mutants that achieve the object are also included in the scope of the present invention.
  • the beta-glycosidase is preferably derived from Sulfolobus solfataricus strain, and the beta-glycosidase
  • the preferred activity temperature is preferably 70 ⁇ 95 °C but is not limited thereto.
  • the alpha-L-arabinofuranosidase ( ⁇ -L-arabinofuranosidase) is preferably composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but one or more substitutions, deletions, etc. All mutants which cause mutations to achieve the object of the present invention are also included in the scope of the present invention.
  • alpha-L-arabinofuranosidase ( ⁇ -L-arabinofuranosidase) is preferably derived from Caldicellulosiruptor saccharolyticus strain,
  • the alpha-L-arabinofuranosidase ( ⁇ -L-arabinofuranosidase) is preferably an optimum activity temperature of 70 ⁇ 95 °C but is not limited thereto.
  • the composition ratio of beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase of the composition is preferably 1: 9 to 9: 1 (w / v), but is not limited thereto. No.
  • the present invention is a ginsenoside compound containing a gene encoding beta-glycosidase and a gene encoding alpha-L-arabinofuranosidase as an active ingredient.
  • a composition for making compound K is provided.
  • the gene encoding the beta-glycosidase is preferably composed of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3, the alpha-el-arabinofuranosidase (The gene encoding ⁇ -L-arabinofuranosidase) is preferably composed of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4, but any mutant which induces a mutation such as one or more substitutions or deletions in the sequence to achieve the object of the present invention is also the present invention. It is included in the range of.
  • the present invention also provides a method for preparing ginsenoside compound k by treating beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase to a substrate.
  • the substrate is preferably a red ginseng extract, a ginseng extract, or a protopananaxadiol-based saponin, but is not limited thereto.
  • the ginseng saponin mixture or extract obtained by extracting and separating from the root or ground portion of Himalayan ginseng or Vietnamese ginseng is not limited thereto.
  • the present invention uses a mixture of two high temperature enzymes to produce ginsenoside compound k from high concentration and high productivity from protopanaxadiol-based saponins.
  • thermophilic beta-glycosidase and caldicellulose syrup sakaroloi derived from the thermophilic microorganism Sulphorobus solfataricus strain
  • the optimum ratio of the two enzymes was confirmed, and when reacted with the red ginseng and the ginseng extract, a large amount of ginsenoside compound k was prepared in a short time to confirm the high yield.
  • thermophilic beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase of the present invention from the thermophilic microorganisms of the present invention, sulfobus solfataricus and calcicellulose sycaroliticus It can be obtained by 1) direct purification from the strain, or 2) cloning of the beta-galactosidase gene from the strain, which is then expressed in a recombinant expression vector and purified. This process for obtaining enzymes from microorganisms is by conventional methods in the art (Sambrook, J. and Russell, D. W. Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 2001).
  • the present invention provides a method of converting all of the propanacanadiol-based saponins in red ginseng extract or rice ginseng extract to compound k by simultaneously treating alpha-L-arabinofuranosidase. to provide.
  • Beta-glycosidase and alpha-L-arabinofuranosidase of the present invention are ginsenosides at a 3: 2 ratio when ginsenoside Rc is used as a substrate. Maximum production of compound k is shown (FIG. 1).
  • beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase produced the maximum production of ginsenoside compound k at 4: 1 and 8: 3 ratios, respectively. Indicates.
  • the composition for preparing ginsenoside compound K containing high-temperature beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase of the present invention is ginsenoside Rb1 and Rb2 which are main diol-based saponins in red ginseng extract or ginseng extract.
  • the reaction rate is rapidly controlled at a high temperature of 85 ° C., and a low yield of ginsenoside compound K is produced in high yield using a low enzyme concentration.
  • a) genomic DNA of sulfoverse solfataricus and caldicellulose syrup sakaroliticus strains and PCR was performed with the primers to amplify the DNA fragments containing the thermophilic beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase genes, respectively;
  • B) Recombinant expression of plasmid vector pET-24a (+) after the restriction enzyme treatment of each DNA fragment containing the amplified thermophilic beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase gene To construct vectors pET-24a (+) / beta-glycosidase and pET-24a (+) / alpha-L-arabinofuranosidase;
  • thermophilic beta-glycosidase BL21 (DE3) ER2566 strain by conventional transformation method
  • thermophilic beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase enzyme protein separating the expressed thermophilic beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase enzyme protein.
  • the step of separating the thermophilic beta-galactosidase and alpha-el-arabinofuranosidase enzyme protein expressed in the step (a) comprises: (a) crushing the culture medium with the microorganisms; (b) centrifuging the cell debris to obtain a supernatant; (c) heat treatment again at high temperature for centrifugation; And (d) filtering the supernatant obtained therefrom; This can be done by separating the enzyme liquid into the process.
  • step (a) it is preferable to crush the cells at a pressure of about 15,000 lb / in 2 using a device such as a French presser, and in the step (c), the cell supernatant is heat-treated at a temperature of 75 ° C. for about 10 minutes. It is preferable to, and in the step (d) it is preferable to filter using a filter paper of 0.45 ⁇ m or the like.
  • the substrate is ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, Rd, which is a diol-based saponin in red ginseng extract or ginseng extract, can be used as a mixture when preparing the ginsenoside compound K, and the reaction solvent is McKilvaine. Buffers such as buffers can be used.
  • thermophilic beta-glycosidase and the alpha-el-arabinofuranosidase enzyme and the substrate in the reaction solvent is preferably performed at pH 6.0 and proceeds at a temperature of 80 ° C.
  • the optimum ratio of beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase enzyme concentration was 3: 2 (0.6 mg / ml: 0.4 mg / ml).
  • 4: 1 (2 mg / ml: 0.5 mg / ml) is preferred when the red ginseng extract is used as a substrate, and 8: 3 (2 mg / ml: 0.75 mg / ml) is used when the ginseng extract is used as the substrate.
  • 3 2 mg / ml: 0.75 mg / ml
  • thermophilic beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase enzyme of the present invention it is derived from the thermophilic Sulfolobus solfataricus strain.
  • thermophilic beta-glycosidase and thermophilic Caldicellulosiruptor saccharolyticus exhibits stable activity even at high temperatures, resulting in faster reaction rates, resulting in the production of large amounts of ginsenoside compound k in a short time. Since it shows the effect of showing a high yield can be useful industrially.
  • composition for preparing ginsenoside compound k containing high temperature beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase enzyme of the present invention and high temperature beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosid According to the preparation method of ginsenoside compound k using an azease enzyme, the thermophilic beta- glyco derived from the thermophilic Sulfolobus solfataricus and Caldicellulosiruptor saccharolyticus strains Since the oxidase and the alpha-el-arabinofuranosidase exhibit stable activity even at high temperature, the reaction rate is fastened, and thus, a large amount of ginsenoside compound k is produced in a short time, and thus the industrial effect is obtained. It can be usefully used.
  • Figure 1 shows the production of the compound K according to the ratio of the thermophilic beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase enzyme concentration using the ginsenoside Rc as a substrate.
  • Figure 2-3 is when the red ginseng extract as a substrate (Fig. 2) and when using the ginseng extract as a substrate (Fig. 3), alpha-el with a fixed concentration of high temperature beta- glycosidase at 2 mg / ml -Arabinofuranosidase enzyme concentration is different, which shows reduction of compound MC.
  • FIG. 4-5 shows the production of ginsenoside compound k by 2 mg / ml of high-temperature beta-glycosidase when the red ginseng extract was used as a substrate (FIG. 4) and the rice extract was used as the substrate (FIG. 5). It is shown.
  • FIG. 6 shows the production of ginsenoside compound K by 2 mg / ml beta-glycosidase and 0.5 mg / ml alpha-L-arabinofuranosidase when red ginseng extract was used as a substrate.
  • ginseng extract was used as a substrate, the production amount of ginsenoside compound K by 2 mg / ml beta-glycosidase and 0.75 mg / ml alpha-L-arabinofuranosidase was shown.
  • Example 1 Construction of Recombinant Expression Vectors and Transgenic Microorganisms Including High Temperature Beta-Glycosidase or High Temperature Alpha-L-Arabinofuranosidase
  • thermophilic beta-glycosidase in order to prepare a thermophilic beta-glycosidase, the beta-glycosidase gene derived from a sulfobus solfataricus strain was first isolated, and a thermophilic alpha-el-arabinofuranosidase was prepared. To this end, an alpha-L-arabinofuranosidase gene derived from a strain of S. acarolyticus was isolated.
  • a sulfoverse solfataricus strain and a caldicellulose syrup sakaroliticus strain were selected and respective genomic DNAs were extracted.
  • primers [SSbglF 5'-GCGTCTGCATATGTACTCATTTCCAAATAGC-3 '(SEQ ID NO: 5), SSbglR (5'-GCGAATCTCGAGTTAGTGCCTTAAT -3 '(SEQ ID NO: 6), CSabfF (5'-TTTGGATCCATGAAAAAAGCAAAAGTCATCTA-3' (SEQ ID NO: 7), CSabfR (5'-TTTCTGCAGTTAATTTTCTCTCTTCTTCAATCTG-3 '), respectively, were prepared.
  • PCR was carried out using primers to amplify the sequence of the genes, which was obtained by a large amount of each gene and then inserted into the plasmid vectors pET-24a (+) and pTrc-99a.
  • the recombinant expression vectors pET-24a (+) / beta-glycosidase and pTrc-99a / alpha-L-arabinofuranosidase of the present invention were prepared.
  • the recombinant expression vectors prepared as described above were transformed into E. coli BL21 (DE3) ER2566 strain by a conventional transformation method, the transformed recombinant E. coli BL21 (DE3) ER2566 pET-24a (+) / Beta-glycosidase strain and E. coli BL21 (DE3) ER2566 pTrc-99a / alpha-L-arabinofuranosidase.
  • the transformed E. coli was stored frozen before the incubation by adding a 20% glycerin (glycerine) solution.
  • E. coli BL21 (DE3) ER2566 pET-24a (+) / beta-glycosidase strains E. coli BL21 (DE3) ER2566 pTrc-99a / alpha-el-arabinofuranosidase strains were each inoculated into 250 ml flasks containing 50 ml of LB medium until the absorbance at 600 nm was 2.0. Shake culture was performed in a shaker at 37 °C.
  • the culture solution was added again to a 2 L Erlenmeyer flask containing 500 ml of LB medium and cultured until the absorbance at 600 nm was 0.8.
  • the stirring speed was adjusted to 200 rpm and the incubation temperature was adjusted to 37 ° C. .
  • 0.1 mM IPTG isopropyl-beta-thiogalactoside was added thereto to induce the production of the overexpressed enzyme.
  • the stirring rate was 150 rpm and the incubation temperature was adjusted to 16 ° C.
  • the culture medium of the transformed strains was centrifuged at 4,000 x g for 30 minutes at 4 °C
  • the cell solution was then disrupted at 15,000 lb / in 2 with a French press.
  • the cell lysate was again centrifuged at 13,000 ⁇ g for 20 minutes at 4 ° C. and heat treated at 75 ° C. for 10 minutes at a high temperature, and then the heat treated material was centrifuged again at 4 ° C. for 20 minutes at 13,000 ⁇ g. It was.
  • the resulting supernatant was filtered with 0.45 ⁇ m filter paper to separate the enzyme liquid which can be used for the production of ginsenoside compound k.
  • ginsenoside Rc and compound MC remained in protopananaxadiol-based saponin to produce ginsenoside compound k. It was confirmed that the yield is limited.
  • alpha-el-arabinofuranosidase was added and treated with beta-glycosidase, and compound k was produced at the ratio of two enzyme concentrations. The degree was compared.
  • the optimum ratio of the high temperature beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase enzyme isolated in Example 2 was confirmed as follows. Under various substrate conditions, the two enzymes were reacted with the substrate at different concentration ratios and the degree of compound k production was compared.
  • the ginsenoside Rc was measured using a ginsenoside Rc as a substrate to determine the ratio of the enzyme concentration between the thermophilic beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase. Specifically, before the reaction, 0.4 mg / ml ginsenoside Rc, 50 mM McKilvain buffer (pH 6.0) and two enzymes were treated by concentration to a total volume of 1 ml, and then mixed at a temperature of 80 ° C. 15 The reaction was allowed to proceed for a minute. After the reaction, n-butanol was added to terminate the reaction, and the amount of compound k was measured.
  • the concentration of beta-glycosidase was increased by 0.1 mg / ml from 0.0 to 1.0 mg / ml and the concentration of alpha-el-arabinofuranosidase was decreased by 0.1 mg / ml from 1.0 to 0.0 mg / ml.
  • the mixture was used as the enzyme solution so that the sum of the two enzymes to 1 mg / ml.
  • Figure 1 when the mixture of 0.6 mg / ml beta- glycosidase and 0.4 mg / ml alpha-L- arabinofuranosidase was confirmed to show the highest compound K production.
  • red ginseng extract When red ginseng extract was used as a substrate, to check the enzyme concentration ratio of beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase, red ginseng containing about 6.5 mg / ml of protopanaxadiol-based saponin Extracts, 50 mM McKilvaine buffer (pH 6.0) and a mixture of the two enzymes were treated.
  • ginsenoside Rd disappeared mostly at 12 hours, as shown in FIG. 2, and the concentration of beta-glycosidase at 12 hours.
  • the concentration of alpha-el-arabinofuranosidase was confirmed by varying the concentration of alpha-el-arabinofuranosidase.
  • Example 3 Based on the 6: 4 ratio found in Example 3, the concentration of alpha-el-arabinofuranosidase was reduced from 1.33 to 0.125 mg / ml, resulting in 2 mg / g of beta-glycosidase. When fixed in ml, it was confirmed that the compound MC was completely converted when the alpha-L-arabinofuranosidase was treated with 0.5 mg / ml or more.
  • the ginseng extract When using ginseng extract as a substrate, to check the enzyme concentration ratio of beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase, the ginseng containing about 5 mg / ml of protopananaxadiol-based saponin Extracts, 50 mM McKilvaine buffer (pH 6.0) and a mixture of the two enzymes were treated.
  • the ginseng extract was treated, it was confirmed that ginsenoside Rd disappeared mostly at 12 hours, as shown in FIG. 3, and the concentration of beta-glycosidase at 12 hours.
  • the concentration of alpha-el-arabinofuranosidase was confirmed by varying the concentration of alpha-el-arabinofuranosidase.
  • the concentration of alpha-el-arabinofuranosidase was reduced from 1.33 to 0.125 mg / ml, resulting in alpha-el when beta-glycosidase was fixed at 2 mg / ml.
  • -Arabinofuranosidase was treated more than 0.75 mg / ml confirmed that the compound MC is completely converted.
  • ginsenoside compound K in order to develop a method for producing ginsenoside compound K using the pyrogenic beta-glycosidase and alpha-el-arabinofuranosidase, the optimum ratio of enzyme concentration in each substrate identified above is applied. Hourly production of ginsenoside compound k was measured with red ginseng extract and misam extract.
  • FIG. 6 shows 2.0 mg / ml beta-glycosidase and 0.5 mg / ml alpha-el-arabinofuranosidase of the present invention in red ginseng extract containing about 6.5 mg / ml of protoparnaxadiol-based saponin as a substrate.
  • Figure 7 is 2.0 mg / ml beta-glycosidase and 0.75 mg / ml alpha-el-arabinofurano of the present invention in the rice ginseng extract containing about 5 mg / ml protopananaxadiol-based saponin as a substrate
  • the graph showing the amount of ginsenoside compound k produced by the sidase it was confirmed that all converted at 12 hours to produce 3.3 mg / ml of ginsenoside compound k.
  • ginsenoside compound K has been shown to be beta-glucosidase (6.3 mg / ml) derived from sulfo bus ashdo caldarius and alpha- derived from cardicellulose syrup sakaroliticus.
  • the total enzyme concentration is 3.6 times lower than when the three extracts are used. And the productivity was increased to about 1.9 times, when using the red ginseng extract, the total enzyme concentration was used 3.3 times lower and the productivity increased to about 2.7 times it was confirmed that the productivity in the present invention is much better.

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Abstract

본 발명은 고온성 베타-글리코시다아제(β-glycosidase)와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제(α-L-arabinofuranosidase) 효소를 이용한 홍삼추출물 또는 미삼추출물로부터 진세노사이드 컴파운드 케이(Ginsenoside compound K)의 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 고온성 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 균주와 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 균주로부터 유래한 것으로 높은 온도에서도 안정한 활성을 나타내는 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소를 이용함으로써 컴파운드 케이의 생산성을 높이기 위한 두 가지 효소의 최적 농도 비율을 확인하고, 높은 온도에서 반응 속도를 빠르게 조절하여 그로 인해 홍삼 및 미삼 추출물로부터 단시간에 진세노사이드 컴파운드 케이를 대량 생산할 수 있으므로 산업적으로 유용하게 사용될 수 있는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.

Description

고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 혼합 효소에 의한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법
본 발명은 고온성 베타-글리코시다아제(β-glycosidase)와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제(α-L-arabinofuranosidase)효소를 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이(Ginsenoside compound K)의 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 고온성 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)와 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 균주로부터 유래한 것으로 높은 온도에서도 안정한 활성을 나타내는 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소를 이용함으로써 높은 온도에서 반응 속도를 빠르게 조절하여 그로 인해 홍삼 및 미삼 추출물로부터 단시간에 진세노사이드 컴파운드 케이를 대량 생산할 수 있으므로 산업적으로 유용하게 사용될 수 있는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.
진세노사이드 컴파운드 케이 (20(S)-프록토파낙사다이올-20-O-베타-디-글루코피라노사이드, 하기 '화학식 1' 참조)는 인삼 사포닌 성분의 장내 세균 대사산물로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 에서 글루코오스 부분이 가수분해되어 생성된다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2015009542-appb-I000001
현재까지 진세노사이드 컴파운드 케이는 면역 증강, 종양의 혈관신생 억제, 암세포 침윤 억제 및 암세포 증식 억제 등 여러 가지 우수한 효능을 지니고 있는 것으로 알려져 있어 건강식품 산업 분야에 있어서 점점 대량공급이 요구되고 있는 실정이며 따라서 안정적이고 효율적으로 생산할 필요성이 커지고 있다.
이러한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조에 대한 종래 기술로는, 다이올계 사포닌을 효소인 베타-글리코시다제(한국공개특허 제2003-94757호), 페니실리움속 미생물에서 분리한 셀룰라제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제(한국등록특허 제377546호), 페니실리움속에서 분리한 나린지나제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 펙티나제(한국등록특허 제418604호) 등을 처리함으로써 컴파운드 케이를 제조하는 방법이 공지되어 있다.
상기와 같이 진세노사이드 컴파운드 케이는 온도 10~50 ℃ 범위의 중온성 효소를 이용하여 생산되고 있지만, 이 효소는 낮은 반응 온도에서 작용하기 때문에 미생물에 오염되기 쉽고 생산 수율도 낮은 문제점이 있다.
진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 수율로 생산하려면 몇 가지 효소를 혼합하여 사용해야한다. 효소혼합액을 사용한 경우 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산 중 가장 높은 생산성을 나타내었고 이 방법은 설포로버스 애시도칼다리우스 유래의 베타-글루코시다아제 (6.3 mg/ml)와 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 유래의 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (1.4 mg/ml), 베타-갈락토시다아제 (1.4 mg/ml)의 혼탁액 사용한 방법으로 약 5 mg/ml의 프로토파낙사다이올계 사포닌이 함유된 미삼 추출물에서 20시간에 2.9 mg/ml를 생산한 결과가 보고된 바 있다 (Kyung-Chul Shin et al. 2013, J. Biotechnol. 167, 33-40, 2013). 그러나 이러한 방법은 세가지 효소를 사용해야하는 불편함이 있고 생산성도 더 향상시킬 필요가 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 단시간에 대량의 고수율 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단시간에 대량의 고수율 진세노사이드 컴파운드 케이 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase) 및 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase)를 유효성분으로 함유하는 진세노사이드 컴파운드 케이(compound K) 제조용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase)는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase)는 설포로버스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus) 균주로부터 유래한 것이 바람직하고, 상기 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase)는 최적 활성온도가 70~95℃인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase)는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase)는 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 (Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 균주로부터 유래한 것이 바람직하고,
상기 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase)는 최적 활성온도가 70~95℃인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 조성물의 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 조성비는 1:9에서 9:1(w/v)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase)를 코딩하는 유전자 및 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase)를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 진세노사이드 컴파운드 케이(compound K) 제조용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하고, 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 4에 기재된 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하나, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또한 본 발명은 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 기질에 처리하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 기질은 홍삼 추출물, 미삼 추출물, 또는 프로토파낙사다이올계 사포닌인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하며,상기 미삼 추출물은 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말라야인삼 또는 베트남인삼의 뿌리 또는 지상부로부터 추출 분리하여 얻은 인삼사포닌 혼합물 또는 추출물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 두 가지 고온 효소를 혼합 사용하여 프로토파낙사다이올계 사포닌으로부터 고농도 및 고생산성으로 진세노사이드 컴파운드 케이를 생산하였다.
본 발명자는 새로운 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법을 개발하기 위해 지속적으로 연구한 결과, 고온성 미생물인 설포로버스 솔파타리쿠스 균주유래의 고온성 베타-글리코시다아제와 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 균주유래의 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소를 생산한 다음, 두 가지 효소의 최적 비율을 확인하고 이를 홍삼 및 미삼 추출물과 반응시켰을 때 단시간에 대량의 진세노사이드 컴파운드 케이가 제조되어 고수율을 나타냄을 확인하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 고온성 미생물인 설포로버스 솔파타리쿠스와 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 균주로부터 본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 수득하는 것은 1) 균주로부터 직접 분리정제하거나, 2) 균주로부터 베타-갈락토시다제 유전자를 클로닝하여 재조합 발현벡터에서 발현시키고 이를 정제하여 수득할 수 있다. 이렇게 미생물로부터 효소를 얻는 과정은 당업계의 통상적인 방법에 의한다(Sambrook, J. and Russell, D.W. Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 2001).
이렇게 수득된 베타-글리코시다아제(β-glycosidase)를 홍삼 추출물 또는 미삼 추출물에 처리하였을 때, 프로토파낙사다이올계 사포닌중 진세노사이드 Rc와 컴파운드 엠씨가 잔존하여 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산수율에 제한을 주기 때문에, 본 발명에서는 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제(α-L-arabinofuranosidase)를 동시에 처리하여 홍삼 추출물 또는 미삼 추출물 내의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 전부 컴파운드 케이로 전환시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 베타-글리코시다아제(β-glycosidase)와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제(α-L-arabinofuranosidase)는 진세노사이드 Rc를 기질로 이용하였을 때 3:2비율에서 진세노사이드 컴파운드 케이의 최대 생성을 나타낸다 (도 1).
또한, 홍삼추출물과 미삼추출물을 기질로 이용하였을 때, 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제는 각각 4:1 과 8:3비율에서 진세노사이드 컴파운드 케이의 최대생성을 나타낸다.
이렇게 본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 함유한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물은 홍삼추출물 또는 미삼추출물 내의 주요 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 혼합물과 완충용액, 수성용매의 혼합액 중에서 반응시킬 때, 고온 85℃에서 반응속도를 빠르게 조절하여 낮은 효소농도를 이용해 단시간에 진세노사이드 컴파운드 케이가 고수율로 생성되는 작용효과를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서는, 가) 설포로버스 솔파타리쿠스와 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 균주의 genomic DNA와 각각의 프라이머를 가지고 PCR을 실시하여 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 유전자를 포함하는 DNA 절편을 각각 증폭한 다음; 나) 증폭된 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 유전자를 포함하는 각각의 DNA 절편에 제한효소를 처리한 후 플라스미드 벡터 pET-24a(+)에 클로닝하여 재조합 발현 벡터 pET-24a(+)/베타-글리코시다아제와 pET-24a(+)/알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 제작하고; 다) 이를 통상적 형질전환방법으로 대장균 BL21(DE3) ER2566 균주에 형질전환 한 후; 라) 고온성 베타-글리코시다아제 유전자와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 유전자로 형질전환된 각각의 대장균을 배양하고; 마) 배양 중 유전자의 발현을 유도하여 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소를 생산하고; 및 바) 발현된 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소 단백질을 분리하여 수득한다.
상기 바) 과정에서 발현된 고온성 베타-갈락토시다제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소 단백질을 분리하는 과정은, (a) 상기 미생물들을 배양액을 파쇄하고; (b) 상기 세포 파쇄물을 원심분리하여 상등액을 얻고; (c) 다시 고온에서 열처리하여 원심분리하고; 및 (d) 이로부터 얻은 상등액을 여과하는; 과정으로 효소액을 분리함으로써 이루어질 수 있다.
상기 (a) 과정에서는 프렌치 프레서 등의 기기를 사용하여 압력 15,000 lb/in2 내외 범위에서 세포를 파쇄하는 것이 바람직하고, 상기 (c) 과정에서는 세포 상등액을 온도 75℃에서 10분 내외로 열처리하는 것이 바람직하며, 상기 (d) 과정에서는 0.45 ㎛ 내외의 여과지 등을 사용하여 여과시키는 것이 바람직하다.
또한, 상기 기질은 홍삼추출물 또는 미삼추출물 내의 다이올계 사포닌인, 진세노사이드 Rb1 , Rb2 , Rc, Rd이며, 진세노사이드 컴파운드 케이 제조시 혼합물로서 사용될 수 있으며, 상기 반응 용매는 맥킬바인(McIlvaine) 완충액과 같은 완충용액이 사용될 수 있다.
이렇게 반응 용매 중의 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소 및 기질간의 반응은 바람직하게는 pH 6.0에서 수행하고, 온도 80℃에서 진행하는 것이 바람직하다.
또한, 진세노사이드 Rc를 기질로 사용하였을 경우, 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소농도의 최적 비율은 3:2 (0.6 mg/ml:0.4 mg/ml) 가 바람직하며, 홍삼추출물을 기질로 하였을때는 4:1 (2 mg/ml:0.5 mg/ml)이 바람직하며, 미삼추출물을 기질로 하였을 때는 8:3 (2 mg/ml:0.75 mg/ml)이 바람직하다.
본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소를 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법에 따르면, 고온성 설포로버스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus) 균주로부터 유래한 고온성 베타-글리코시다아제와 고온성 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 (Caldicellulosiruptor saccharolyticus)는 높은 온도에서도 안정한 활성을 나타내어 반응 속도가 빨라지고 그로 인해 단시간에 대량의 진세노사이드 컴파운드 케이가 제조되어 고수율을 나타내는 작용효과를 보이므로 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소를 함유한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소를 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법에 따르면, 고온성 설포로버스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus)와 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 균주로부터 유래한 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제가 높은 온도에서도 안정한 활성을 나타내어 반응 속도가 빨라지고 그로 인해 단시간에 대량의 진세노사이드 컴파운드 케이가 제조되어 고수율을 나타내는 작용효과를 보이므로 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 진세노사이드 Rc를 기질로 하였을 때, 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소농도 비율에 따른 컴파운드 케이의 생성을 나타낸 것이다.
도 2-3은 홍삼추출물을 기질로 하였을 때(도 2)와 미삼추출물을 기질로 하였을 때(도 3), 고온성 베타-글리코시다아제의 농도를 2 mg/ml로 고정한 상태로 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소농도를 다르게 하여 컴파운드 엠씨의 감소를 나타낸 것이다.
도 4-5는 홍삼추출물을 기질로 하였을 때(도 4)와 미삼추출물을 기질로 하였을 때(도 5), 2 mg/ml의 고온성 베타-글리코시다아제 의한 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산량을 나타낸 것이다.
도 6은 홍삼추출물을 기질로 하였을 때 2 mg/ml 베타-글리코시다아제와 0.5 mg/ml 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제에 의한 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산량을 나타내었으며, 도 7은 미삼추출물을 기질로 하였을 때 2 mg/ml 베타-글리코시다아제와 0.75 mg/ml 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제에 의한 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산량을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1:고온성 베타-글리코시다아제 또는 고온성 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작
본 발명에서는 고온성 베타-글리코시다아제를 제조하기 위하여, 먼저 설포로버스 솔파타리쿠스 균주로부터 유래한 베타-글리코시다아제 유전자를 분리하였으며, 고온성 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 제조하기 위하여, 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 균주로부터 유래한 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 유전자를 분리하였다.
구체적으로, 이미 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 특정되어 있는 설포로버스 솔파타리쿠스 균주와 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 균주를 선발하고, 각각의 게놈 DNA를 추출하였다. 또한, 설포로버스 솔파타리쿠스 균주의 베타-글리코시다아제 유전자의 염기서열 [진뱅크 수탁번호 M34696 (Genebank Accession No. M34696)]과 카디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 균주의 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 유전자의 염기서열 [진뱅크 수탁번호 CP000679 (Genebank Accession No. CP000679)] 을 기초로 하여 프라이머들[SSbglF 5'-GCGTCTGCATATGTACTCATTTCCAAATAGC-3'(서열번호 5), SSbglR (5'-GCGAATCTCGAGTTAGTGCCTTAATGGCTTTAC-3'(서열번호 6), CSabfF (5'-TTTGGATCCATGAAAAAAGCAAAAGTCATCTA-3'(서열번호 7), CSabfR (5'-TTTCTGCAGTTAATTTTCTCTCTTCTTCAATCTG-3'(서열번호 8)]을 각각 제작하였다. 그 다음 상기 게놈 DNA 및 프라이머들을 이용한 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 실시하여 해당 유전자들의 염기서열을 증폭하였다. 상기 과정으로 각각의 유전자를 대량 얻은 다음 플라스미드 벡터 pET-24a(+)와 pTrc-99a에 삽입하는 과정으로 본 발명의 재조합 발현 벡터 pET-24a(+)/베타-글리코시다아제와 pTrc-99a/알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 제작하였다.
또한 상기와 같이 제작한 재조합 발현 벡터들은 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 BL21(DE3) ER2566 균주에 형질전환 하였으며, 상기 형질전환된 재조합 대장균은 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-24a(+)/베타-글리코시다아제 균주와 E. coli BL21(DE3) ER2566 pTrc-99a/알파-엘-아라비노퓨라노시다아제로 명명하였다. 또한 상기 형질전환된 대장균은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.
실시예 2:고온성 베타-글리코시다아제와 고온성 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 발현 및 정제
본 발명에서는 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 대량 생산하기 위하여, 냉동 보관된 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-24a(+)/베타-글리코시다아제 균주와 E. coli BL21(DE3) ER2566 pTrc-99a/알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 균주를 각각 LB 배지 50 ㎖가 들어있는 250 ㎖의 플라스크에 접종하여 600 ㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 진탕 배양하였다. 그 다음 상기 배양액을 다시 LB 배지 500 ㎖가 들어있는 2ℓ의 삼각 플라스크에 첨가하여 600 ㎚에서의 흡광도가 0.8이 될 때까지 배양하고 상기 과정 중에서 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃로 조정하였다. 여기에 0.1 mM IPTG(isopropyl-beta-thiogalactoside)를 첨가하여 상기 과발현된 효소의 생산을 유도하였으며 교반 속도는 150 rpm, 배양 온도는 16℃로 조정하였다.
또한 상기와 같이 생산된 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소를 정제하기 위하여, 상기 형질전환된 균주들의 배양액을 4,000×g 로 4℃에서 30분 동안 원심분리 한 다음 상기 세포 용액을 프렌치 프레서로 15,000 lb/in2에서 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000×g 로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 고온인 75℃에서 10분 동안 열처리한 다음, 이로부터 얻은 열 처리물을 13,000×g 로 4℃에서 20분 동안 다시 원심분리하였다. 그 결과 얻은 상등액은 0.45 ㎛ 여과지로 여과하여 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산에 사용될 수 있는 효소액으로 분리하였다.
실시예 3:고온성 베타-글리코시다아제와 고온성 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 최적 비율 조사
먼저 상기 실시예 2에서 분리한 고온성 베타-글리코시다아제를 홍삼추출물 또는 미삼추출물에 처리하였을 때, 프로토파낙사다이올계 사포닌중 진세노사이드 Rc와 컴파운드 엠씨가 잔존하여 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산수율에 제한을 주는 것을 확인하였다. 잔존하는 진세노사이드 Rc와 컴파운드 엠씨를 컴파운드케이로 전환하기 위하여 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 첨가하여 베타-글리코시다아제와 함께 처리하였고, 두 가지 효소 농도의 비율별로 컴파운드 케이의 생성정도를 비교하였다.
본 발명에서는 상기 실시예 2에서 분리한 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소의 최적 비율을 다음과 같이 확인하였다. 다양한 기질조건 하에서 두 가지 효소를 농도 비율별로 기질과 반응 시키고 컴파운드 케이의 생성정도를 비교하였다.
가. 진세노사이드 Rc를 기질로 하였을 때, 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소농도의 최적 비율 측정
본 발명에서는 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 효소 농도 비율을 확인하기 위해 진세노사이드 Rc를 기질로 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 상기 반응 전에 0.4 mg/ml 진세노사이드 Rc, 50 mM 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액 (pH 6.0) 및 두 가지 효소를 농도 별로 처리하여 총 부피 1 ㎖이 되게 섞은 다음 온도 80℃에서 15분 동안 반응을 진행시켰다. 반응이 끝난 다음, n-부탄올을 첨가하여 반응을 종료시키고 컴파운드 케이의 양을 측정하였다. 이때 베타-글리코시다아제의 농도는 0.0부터 1.0 mg/ml 까지 0.1 mg/ml 씩 증가시키고 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 농도는 1.0부터 0.0 mg/ml 까지 0.1 mg/ml씩 감소시켜, 두 효소의 합이 1 mg/ml 이 되도록 섞은 혼합물을 효소액으로 사용 하였다. 그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 0.6 mg/ml 베타-글리코시다아제와 0.4 mg/ml 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 섞어 주었을 때 가장 높은 컴파운드 케이의 생산량을 보이는 것을 확인하였다.
나. 홍삼추출물을 기질로 하였을 때, 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소농도의 최적 비율 측정
홍삼추출물을 기질로 이용하였을 때, 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 효소 농도 비율을 확인하기 위해, 약 6.5 mg/ml의 프로토파낙사다이올계 사포닌이 함유된 홍삼추출물, 50 mM 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액 (pH 6.0) 및 두 가지 효소의 혼합물을 처리하였다. 홍삼추출물을 기질로 사용하여 2 mg/ml 베타-글리코시다아제만을 처리하였을 경우 도 2에 나타난 것과 같이 12시간에 진세노사이드 Rd가 대부분 사라지는 것을 확인하여, 12시간에서 베타-글리코시다아제의 농도를 2 mg/ml로 고정하고, 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 농도를 다르게 하여 컴파운드 엠씨가 전부 전환되는 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 농도를 확인하였다.
상기 실시예 3 가에서 확인한 6:4 비율을 기준으로, 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 농도를 1.33부터 0.125 mg/ml까지 감소시켰으며, 그 결과 베타-글리코시다아제를 2 mg/ml로 고정하였을 때 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 0.5 mg/ml이상 처리하면 컴파운드 엠씨가 전부 전환됨을 확인하였다.
다. 미삼추출물을 기질로 하였을 때, 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소농도의 최적 비율 측정
미삼추출물을 기질로 이용하였을 때, 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 효소 농도 비율을 확인하기 위해, 약 5 mg/ml의 프로토파낙사다이올계 사포닌이 함유된 미삼추출물, 50 mM 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액 (pH 6.0) 및 두 가지 효소의 혼합물을 처리하였다. 미삼추출물을 기질로 사용하여 2 mg/ml 베타-글리코시다아제만을 처리하였을 경우 도 3에 나타난 것과 같이 12시간에 진세노사이드 Rd가 대부분 사라지는 것을 확인하여, 12시간에서 베타-글리코시다아제의 농도를 2 mg/ml로 고정하고, 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 농도를 다르게 하여 컴파운드 엠씨가 전부 전환되는 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 농도를 확인하였다.
상기 실시예 3 나와 마찬가지로, 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 농도를 1.33부터 0.125 mg/ml까지 감소시켰으며, 그 결과 베타-글리코시다아제를 2 mg/ml로 고정하였을 때 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 0.75 mg/ml이상 처리하면 컴파운드 엠씨가 전부 전환됨을 확인하였다.
실시예 4:고온성 베타-글리코시다아제와 고온성 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산
본 발명에서는 상기 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산 방법을 개발하기 위하여, 상기에서 확인한 각 기질에서의 효소농도 최적 비율을 적용하여 홍삼 추출물 및 미삼 추출물을 가지고 진세노사이드 컴파운드 케이의 시간별 생산량을 측정하였다.
도 6은 기질로서 약 6.5 mg/ml의 프로토파낙사다이올계 사포닌이 함유된 홍삼추출물에서 본 발명의 2.0 mg/ml 베타-글리코시다아제와 0.5 mg/ml 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제에 의한 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산량을 나타낸 그래 프로, 12시간에 전부 전환되어 진세노사이드 컴파운드 케이를 4.6 mg/ml 생산함을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7은 기질로서 약 5 mg/ml의 프로토파낙사다이올계 사포닌이 함유된 미삼추출물에서 본 발명의 2.0 mg/ml 베타-글리코시다아제와 0.75 mg/ml 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제에 의한 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산량을 나타낸 그래프로, 12시간에 전부 전환되어 진세노사이드 컴파운드 케이를 3.3 mg/ml 생산함을 확인할 수 있었다.
현재까지 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산 중 가장 높은 생산성을 나타낸 것은 설포로버스 애시도칼다리우스 유래의 베타-글루코시다아제 (6.3 mg/ml)와 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 유래의 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (1.4 mg/ml), 베타-갈락토시다아제 (1.4 mg/ml)의 혼탁액으로, 이를 사용하여 약 5 mg/ml의 프로토파낙사다이올계 사포닌이 함유된 미삼 추출물에서 20시간에 2.9 mg/ml를 생산한 결과가 보고된 바 있다 (Kyung-Chul Shin et al. 2013, J. Biotechnol. 167, 33-40, 2013).
이와 비교하면 본 발명의 고온성 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제를 이용하는 경우 상기 세 개의 효소를 이용하였을 때 보다 미삼추출물을 사용하였을 때 전체 효소농도는 3.6배 낮게 사용하였고 생산성이 약 1.9배로 증가하였으며, 홍삼추출물을 사용하였을 때 전체 효소농도는 3.3배 낮게 사용하였고 생산성은 약 2.7배로 증가하여 본 발명에서의 생산성이 훨씬 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (17)

  1. 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase) 및 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase)를 유효성분으로 함유하는 진세노사이드 컴파운드 케이(compound K) 제조용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase)는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase)는 설포로버스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus) 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase)는 최적 활성온도가 70~95℃인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase)는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase)는 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 (Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제는 최적 활성온도가 70~95℃인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 조성비는 1:9 내지 9:1(w/v)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase)를 코딩하는 유전자 및 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase)를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 진세노사이드 컴파운드 케이(compound K) 제조용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 베타-글리코시다아제 (β-glycosidase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 4에 기재된 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 베타-글리코시다아제(β-glycosidase)와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제(α-L-arabinofuranosidase)를 기질에 처리하여 진세노사이드 컴파운드 케이(compound K)를 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 베타-글리코시다아제는 설포로버스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus) 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제는 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 (Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 기질은 홍삼 추출물, 미삼 추출물, 또는 프로토파낙사다이올계 사포닌인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 처리하는 베타-글리코시다아제와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제의 비는 1:9 내지 9:1(w/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 미삼 추출물은 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말라야인삼, 또는 베트남인삼의 뿌리 또는 지상부로부터 추출 분리하여 얻은 인삼사포닌 혼합물 또는 추출물인 것을 특징으로 하는 방법.
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