WO2019205025A1 - 一种利用β-葡萄糖苷酶制备宝藿苷I的方法 - Google Patents

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saponin
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刘立辉
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曹磊
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江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司
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Definitions

  • the reaction system for preparing the taxoside I by catalyzing the hydrolysis of the substrate by ⁇ -glucosidase further comprises a buffer solution and a co-solvent, wherein the buffer has a pH of 5.0-7.0, and the reaction system is controlled during the reaction.
  • the temperature is from 45 ° C to 80 ° C
  • the pH is from 4.5 to 6.5
  • the reaction time is from 2 to 10 h.
  • the buffer is an acetate buffer.
  • the ⁇ -glucosidase used in the above methods include liquid enzyme solutions, solids, and various immobilized enzymes, either in the form of unpurified crude enzymes or in partially or completely purified form.
  • the ⁇ -glucosidase is added in the form of a crude enzyme solution, which is obtained by inducing expression by a microorganism strain containing the ⁇ -glucosidase gene, and then removing the precipitate by centrifugation and centrifugation.
  • a solution containing ⁇ -glucosidase obtained.
  • the crude enzyme solution is used in an amount of 5% to 20% (v/v) of the total reaction liquid, and the substrate concentration is 5% to 20% (wv) of the total reaction liquid.
  • the crystallization process comprises: distilling off the acetone in a 45-55 ° C water bath environment under reduced pressure, and after 9/10 of the acetone is distilled off, Then, the remaining solution is cooled to 10-15 ° C, and after all the crystals are precipitated, the mixture is filtered, and the filter cake is washed with water and dried to obtain a crude product of protamine I.
  • the mixture is stirred at 55-65 ° C for at least 1 h before the hot filtration.
  • the crystallization process should be slowly stirred.
  • the ⁇ -glucosidase has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2.
  • the ⁇ -glucosidase has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2.
  • the preparation method of the saponin I provided by the invention has the following advantages:
  • the ⁇ -glucosidase known in the prior art generally only has the function of hydrolyzing glucosidic bonds, so usually only the icariin can be hydrolyzed to the saponin I.
  • the present invention screens a ⁇ -glucosidase having various functions, and when the extract of the extract of Epimedium is used as a substrate, the icariin can be hydrolyzed to the valerian I, and At the same time, it can hydrolyze all of the scorpion scorpion A, scutellarin B, arrow saponin A and arrow saponin B into scutellarin I, and hydrolyze radix as a saponin I and rhamnosyl
  • the glucoside II enhances the effective utilization of the extract of Epimedium and greatly reduces the preparation cost of the Baoji I.
  • the invention adopts the crude enzyme solution as the source of ⁇ -glucosidase, and can rapidly prepare the crude enzyme solution by expressing in E. coli, which greatly reduces the preparation cost.
  • the macroporous resin is generally used to separate and purify the saponin I monomer, and the process is complicated and the cost is high.
  • the method provided by the invention uses the crystallization and recrystallization process to separate and purify the Baojiu I monomer, thereby reducing the cost, and the process is simple and easy to operate, and the efficiency is high.
  • Figure 2 is an HPLC chromatogram of the standards of ⁇ A, ⁇ B, ⁇ C, and Baojiin I;
  • Figure 4 is an HPLC chart of the enzyme-catalyzed reaction solution of Example 2 of the present invention.
  • Figure 6 is an HPLC chart of an enzyme-catalyzed reaction solution of phlegm-B in Example 5 of the present invention.
  • Fig. 7 is an HPLC chart of an enzyme-catalyzed reaction solution of sputum C in Example 5 of the present invention.
  • coli Rosetta (DE3) competent cells and the recombinant plasmid-containing Escherichia coli was inoculated into 5 mL of LB medium (containing 100 ⁇ g/mL of Amp), and cultured at 37 ° C, shaking at 200 rpm overnight. Transfer 1% of the inoculum to 100-1000 mL of LB medium (containing 100 ⁇ g/mL of Amp), incubate at 37 ° C, shaker at 200 rpm until the OD600 reaches 0.6-1.0, and add a final concentration of 0.1-0.5 mM.
  • Epimedium extract produced by Shaanxi Huike Plant Development Co., Ltd. was used, which contained 20% by weight of icariin and a total of 12% of Chaoyang Ding, Chaoyang Ding B. And ⁇ C, its HPLC map is shown in Figure 3.
  • the crude Baojiu I prepared in Example 3 was dissolved in 250 ml of absolute ethanol, 2 g of activated carbon was added, stirred and heated to 60 ° C for 1 h, filtered while hot, the filter cake was rinsed with 20 ml of ethanol, and the filtrate was placed under a water bath at 60 ° C.
  • the detection conditions were as follows: Yuexu Xtimate C18 5 ⁇ m ⁇ 250 ⁇ 4.6 mm column, wavelength UV 270 nm, mobile phase 90% acetonitrile aqueous solution, flow rate 1.0 ml/min, temperature 25 °C.
  • the HPLC chromatograms of the enzyme-catalyzed reaction solutions of Asarum A, Asarum B and Asarum C are shown in Figures 5, 6 and 7, respectively.
  • the results showed that both C. sylvestris A and C. sylvestris B were 100% converted into scutellarin I, 56.3% of C. striata C was converted into baumannin I, and the remainder was transformed into buckthorn Glycosyl Epimedin II.
  • the sources of the ⁇ -glucosidase genes of the crude enzyme solutions numbered 1-10 are Aspergillus oryzae RIB40, Aspergillus fumigatus A1163, Aspergillus niger, Talaromyces leycettanus JCM12802, Thermotoga maritima MSB8, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, Aspergillus oryzae, Dictyoglomus thermophilum DSM 3960, Caldanaerobius fijiensis.

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Abstract

一种制备宝藿苷I的方法，包括利用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷I，所述底物为淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定C、箭藿苷A和箭藿苷B中的任意一种或多种，所述β-葡萄糖苷酶由来源于极端栖热袍菌 Thermotoga petrophila RKU-1的β-葡萄糖苷酶基因编码。

Description

[根据细则37.2由ISA制定的发明名称]　一种利用β-葡萄糖苷酶制备宝藿苷I的方法 技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种利用生物酶催化技术制备宝藿苷Ⅰ的方法。
背景技术
宝藿苷Ⅰ是淫羊藿中的一种多羟基黄酮类单体化合物，也是淫羊藿药材中的一种有效成分。淫羊藿为小檗科淫羊藿属多年生草本植物，是具有两千多年用药历史的传统中药。现代药理研究表明，淫羊藿具有增强免疫力、改善心血管系统功能、抗炎、抗肿瘤、促进骨细胞增殖等药理作用，具有广阔的用药前景。淫羊藿中最为重要的药效成分是黄酮类化合物，包括淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A、箭藿苷B、宝藿苷Ⅰ等200多种成分，称为淫羊藿总黄酮。采用现代中药提取技术将淫羊藿总黄酮从淫羊藿药材中提取出来，得到淫羊藿提取物，逐渐成为众多中药制剂的重要原料。
近年来，国内外研究发现，宝藿苷Ⅰ的药理活性独特，对癌细胞具有显著的抑制作用，并可诱导癌细胞凋亡，其抗癌活性和生物药剂学性质明显优于淫羊藿中其他黄酮类化合物。同时，药代动力学研究发现，淫羊藿苷在被人体吸收之前，已经在肠道中代谢成了淫羊藿素和宝藿苷I，吸收并进入血液循环发挥药理效应的物质主要是能更好被机体吸收的宝藿苷Ⅰ。因此，宝藿苷Ⅰ单体的制备和获取逐渐成为广大研究者关注的重点。
宝藿苷Ⅰ可以从淫羊藿药材中直接提取，然而研究发现，淫羊藿中以淫羊藿苷的含量最多，朝藿定(A、B、C)的含量次之，而宝藿苷Ⅰ的含量极低，只有约0.17mg/g，并且宝藿苷Ⅰ与淫羊藿中的很多成分的结构和极性相近，这使得通过从淫羊藿药材中分离得到宝藿苷Ⅰ单体的难度极大，并且步骤繁琐，产率较低，不适于工业化应用。
现有的制备宝藿苷Ⅰ的途径多采用生物酶(如β-葡萄糖苷酶、纤维素酶等)水解淫羊藿苷的方法制备，如中国发明专利申请CN 103160553 A、 CN 102311985 A和CN 106148454 A都是以高纯度淫羊藿苷为底物制备宝藿苷Ⅰ。可是淫羊藿苷单体的价格较高，从而导致制备成本较高。为克服淫羊藿苷价格较高的问题，又有采用直接以淫羊藿提取物(淫羊藿总黄酮)为底物，用生物酶催化制备宝藿苷Ⅰ的方法。但是此种制备方法通常也只是将淫羊藿提取物中的淫羊藿苷转化成宝藿苷Ⅰ，而不能同时将淫羊藿提取物中的其他某些成分也转化成宝藿苷Ⅰ，从而使得淫羊藿提取物没有达到最大限度的有效利用。
发明内容
本发明的目的在于解决上述背景技术中提到的现有生物酶催化淫羊藿提取物制备宝藿苷Ⅰ的方法所存在的未能对淫羊藿提取物达到最大限度的有效利用的技术问题，提供一种酶法制备宝藿苷Ⅰ的新方法，该方法不仅能够将淫羊藿提取物中的淫羊藿苷转化成宝藿苷Ⅰ，而且能同时将淫羊藿提取物中的其他某些成分也转化成宝藿苷Ⅰ，提高了淫羊藿提取物的利用率，降低了宝藿苷Ⅰ的制备成本。
为实现上述目的，发明人经过长期大量的实验摸索，在筛选了几十种不同来源的β-葡萄糖苷酶后，终于筛选出一种可同时将淫羊藿提取物中的多种成分转化成宝藿苷Ⅰ的β-葡萄糖苷酶。基于此，本发明一方面提供了一种新的制备宝藿苷Ⅰ的方法，具体为，用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ，所述底物为淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A和箭藿苷B中的任意一种或多种，所述β-葡萄糖苷酶由来源于极端栖热袍菌Thermotoga petrophila RKU-1的β-葡萄糖苷酶基因编码，且所述β-葡萄糖苷酶特异性地将所述淫羊藿提取物中的淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、箭藿苷A和箭藿苷B全部水解成宝藿苷Ⅰ，并将所述淫羊藿提取物中的朝藿定C水解成宝藿苷Ⅰ和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ。
淫羊藿提取物是指淫羊藿的干燥茎叶经加工制成的乙醇提取物，以淫羊藿中的黄酮类化合物为主要成分为，又名淫羊藿总黄酮。本发明提供的制备宝藿苷Ⅰ的方法适用于淫羊藿苷的含量范围为10％-50％的淫羊藿提取物。
具体地，所述β-葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
优选地，所述β-葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
具体地，所述用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ的反应体系中还含有缓冲液和助溶剂，所述缓冲液的pH值为5.0-7.0，反应过程中控制反应体系的温度为45℃-80℃，pH值为4.5-6.5，反应时间为2-10h。
优选地，反应过程中控制反应体系的温度为45℃-60℃，pH值为4.5-6.0，反应时间为6-10h。
优选地，所述缓冲液的用量为占总反应液的60％-90％(v/v)，所述助溶剂的用量为占总反应液的5％-20％(v/v)。
优选地，所述缓冲液为醋酸盐缓冲液。
优选地，所述助溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、NMP、吐温20和吐温80中的任意一种。
更优选地，所述助溶剂为丙酮，相比较选用甲醇、乙醇、NMP、吐温20或吐温80作为助溶剂时，选用丙酮具有后处理操作(即酶催化反应结束后从酶催化反应液中分离宝藿苷Ⅰ的操作)简单的优点。
上述方法中所使用的β-葡萄糖苷酶的具体存在形式包括液态酶液、固态以及各种固定化酶，可以是未经纯化的粗酶形式，也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。优选地，所述β-葡萄糖苷酶以粗酶液的形式投加，所述粗酶液是指由含有所述β-葡萄糖苷酶基因的微生物菌株诱导表达后经破胞、离心去除沉淀后获得的含有β-葡萄糖苷酶的溶液。优选地，所述粗酶液的用量为占总反应液的5％-20％(v/v)，所述底物浓度为占总反应液的5％-20％(wv)。
具体地，所述粗酶液的制备过程包括：构建含有所述β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒，并将所述重组质粒转入微生物菌株体内，培养所述微生物菌株并进行诱导表达所述β-葡萄糖苷酶，之后收集所述微生物菌株于缓冲液中，经破胞、离心去除沉淀后即得所述粗酶液。
优选地，所述微生物菌株为大肠杆菌Rosetta(DE3)。
待所述用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ的反应结束后，需 要将宝藿苷Ⅰ单体从酶催化反应液中分离出来，优选将获得的酶催化反应液进行结晶工艺处理，收集结晶体即得宝藿苷Ⅰ粗品，为提高宝藿苷Ⅰ的纯度，优选将所述宝藿苷Ⅰ粗品进行重结晶工艺处理，收集结晶体即得宝藿苷Ⅰ精制品。
具体地，当助溶剂为丙酮时，所述结晶工艺处理过程包括：将所述酶催化反应液于45-55℃水浴环境中减压蒸馏出丙酮，至9/10的丙酮被蒸馏出后，再将剩余溶液降温至10-15℃，待结晶体全部析出后过滤，滤饼经水洗、干燥处理后即得宝藿苷Ⅰ粗品。
优选地，上述降温过程保持在水浴环境中进行。
优选地，所述干燥处理是指将滤饼置于70℃烘箱中干燥至宝藿苷Ⅰ粗品中的水分含量低于5％，干燥时间优选为12h。
具体地，所述重结晶工艺处理过程包括：将所述宝藿苷Ⅰ粗品溶解于无水乙醇中，并加入活性炭，搅拌并加热至55-65℃，趁热过滤，并用无水乙醇冲洗滤饼，滤液经减压蒸馏出乙醇后再加水，优选待蒸馏出50％-70％的乙醇后加水，整个过程维持温度在55-65℃，之后降温至5-10℃，搅拌至结晶体全部析出后，过滤，滤饼经乙醇溶液冲洗、干燥处理后即得宝藿苷Ⅰ精制品。
优选地，为使活性炭对不溶性杂质的吸附完全，在趁热过滤之前，保持55-65℃下搅拌至少1h。
优选地，加水的过程应保持缓慢滴加。
优选地，析晶过程应缓慢搅拌。
优选地，所述乙醇溶液选用体积比为40％的冷乙醇水溶液。
为进一步提高宝藿苷Ⅰ精制品的纯度，优选将干燥处理之前的滤饼重复进行重结晶工艺处理，即可获得纯度进一步提高的宝藿苷Ⅰ精制品。
进一步地，重复进行重结晶工艺处理过程中，第二次使用的乙醇溶液优选为体积比为60％的冷乙醇水溶液。
另一方面，本发明还提供了β-葡萄糖苷酶以及含有所述β-葡萄糖苷酶基因的微生物菌株在催化淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、 朝藿定C、箭藿苷A和箭藿苷B中的任意一种或多种制备宝藿苷Ⅰ中的应用，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶由来源于极端栖热袍菌Thermotoga petrophila RKU-1的β-葡萄糖苷酶基因编码，且所述β-葡萄糖苷酶特异性地将所述淫羊藿提取物中的淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、箭藿苷A和箭藿苷B全部水解成宝藿苷Ⅰ，并将所述淫羊藿提取物中的朝藿定C水解成宝藿苷Ⅰ和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ。
具体地，所述β-葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
优选地，所述β-葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
第三方面，本发明还提供了β-葡萄糖苷酶以及含有所述β-葡萄糖苷酶基因的微生物菌株用于水解木糖苷键和鼠李糖苷键的用途，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶由来源于极端栖热袍菌Thermotoga petrophila RKU-1的β-葡萄糖苷酶基因编码。
具体地，所述β-葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
优选地，所述β-葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
有益效果：
与现有技术相比，本发明提供的宝藿苷Ⅰ的制备方法具有如下优点：
1、现有技术中已知的β-葡萄糖苷酶一般只具备水解葡萄糖苷键的作用，所以通常只能将淫羊藿苷水解成宝藿苷Ⅰ。本发明筛选到了一种具有多种功能的β-葡萄糖苷酶，在以淫羊藿提取物为底物制备宝藿苷Ⅰ时，不仅能够将淫羊藿苷全部水解成宝藿苷Ⅰ，而且能同时将朝藿定A、朝藿定B、箭藿苷A和箭藿苷B全部水解成宝藿苷Ⅰ，并将朝藿定C水解成宝藿苷Ⅰ和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，从而提高了淫羊藿提取物的有效利用率，大大降低了宝藿苷Ⅰ的制备成本。
2、本发明采用粗酶液作为β-葡萄糖苷酶的来源，通过在大肠杆菌中表达可以快速制备粗酶液，极大地降低了制备成本。
3、现有技术中普遍采用大孔树脂对宝藿苷Ⅰ单体进行分离和纯化，工艺复杂，成本较高。本发明提供的方法采用结晶和重结晶工艺对宝藿苷Ⅰ单体进行分离和纯化，降低了成本，且工艺简单易操作，效率高。
附图说明
图1是淫羊藿苷标准品的HPLC图谱；
图2是朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及宝藿苷Ⅰ标准品的HPLC图谱；
图3是本发明实施例2中使用的底物淫羊藿提取物的HPLC图谱；
图4是本发明实施例2的酶催化反应液的HPLC图谱；
图5是本发明实施例5中朝藿定A的酶催化反应液的HPLC图谱；
图6是本发明实施例5中朝藿定B的酶催化反应液的HPLC图谱；
图7是本发明实施例5中朝藿定C的酶催化反应液的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例，实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。若无特别说明，本发明实施例中所使用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。
实施例1
β-葡萄糖苷酶粗酶液的制备。
将来源于极端栖热袍菌(Thermotoga petrophila RKU-1)的β-葡萄糖苷酶基因(编号为BGL04，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)连接到表达载体pET22b(+)的Nde I位点和EcoR I位点之间，得到重组质粒pET22b-BGL04。将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，将含有重组质粒的大肠杆菌接种在5mL的LB培养基(含有100μg/mL的Amp)，37℃、200rpm摇床培养过夜后，以1％的接种量转接到100-1000mL的LB培养基中(含有100μg/mL的Amp)，在37℃、200rpm摇床培养至OD600达到0.6～1.0，加入终浓度为0.1-0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在37℃、200rpm摇床培养8-10h后离心收集菌体。菌体用4倍体积的浓度为100mM的磷酸盐缓冲液(pH6.5)悬浮，用超声波或均质机破胞，离心去沉淀得到β-葡萄糖苷酶的粗酶液。
实施例2
宝藿苷Ⅰ的制备
以淫羊藿提取物为底物，选用陕西慧科植物开发有限公司生产的淫羊藿提取物，其含有20％重量的淫羊藿苷和总计12％的朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C，其HPLC图谱如图3所示。
称取100g淫羊藿提取物置于2L的三口瓶中，加入780ml的醋酸盐缓冲液(pH6.0)，加入100ml的丙酮，搅拌均匀后，加入实施例1制备的β-葡萄糖苷酶粗酶液120ml，控制pH 6.0，温度45℃开始反应。反应6h后，取酶催化反应液进行HPLC检测，检测条件：月旭Xtimate C18 5μm×250×4.6mm色谱柱，波长UV270nm，流动相为90％乙腈水溶液，流速1.0ml/min，温度25℃，所得HPLC图谱如图4所示。
实施例3
宝藿苷Ⅰ粗品的制备
待实施例2的酶催化反应结束后，将酶催化反应液置于50℃水浴中减压蒸馏，蒸出大部分丙酮(约90ml)，剩余溶液置于水浴锅中搅拌降温至10-15℃。过滤，将水溶液滤出，用50ml水冲洗滤饼，滤饼置于70℃烘箱中干燥12h，确保水分含量低于5％，得到宝藿苷Ⅰ粗品102.8g，纯度为69.6％，含量为14.54％。
实施例4
宝藿苷Ⅰ精制品的制备
将实施例3制备的宝藿苷Ⅰ粗品用250ml无水乙醇溶解，加入2g活性炭，搅拌加热至60℃保持1h，趁热过滤，用20ml乙醇冲洗滤饼，滤液置于60℃水浴下减压蒸馏，蒸出170ml乙醇，剩余溶液转移至60℃水浴锅中，缓慢滴加150ml纯水，温度降至5-10℃，缓慢搅拌保持2h，过滤，用20ml40％冷乙醇冲洗滤饼，滤饼再次用200ml无水乙醇溶解，加入2g活性炭，60℃搅拌保持1h，过滤，用20ml乙醇冲洗滤饼，滤液减压浓缩，蒸出120ml乙醇，将剩余溶液置于60℃水浴锅，缓慢滴加54ml纯水，降温至5-10℃，缓慢搅拌保持2h，过滤，用20ml 60％乙醇冲洗滤饼，滤饼置于70℃烘箱 干燥12h，确保水分含量低于1％，得到宝藿苷Ⅰ精制品13.12g。按水解后分子量减少的理论收率折算为84.87％。产品取样检测纯度为98.20％，含量为98.36％。
实施例5
称取朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C各1mg分别置于2mL的离心管中，加入780μL的醋酸盐缓冲液(pH6.0)，加入100μL的丙酮，加入实施例1制备的β-葡萄糖苷酶粗酶液120μL，控制pH 6.0，温度45℃开始反应。反应6h后，取酶催化反应液进行HPLC检测，检测条件：月旭Xtimate C18 5μm×250×4.6mm色谱柱，波长UV270nm，流动相为90％乙腈水溶液，流速1.0ml/min，温度25℃。朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的酶催化反应液的HPLC图谱分别如图5、图6和图7所示。检测结果显示，朝藿定A和朝藿定B均100％转化成了宝藿苷Ⅰ，朝藿定C中占56.3％的部分转化成了宝藿苷Ⅰ，剩余部分则转化成了鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ。
对比例
参照实施例1分别制备另外10种不同来源的β-葡萄糖苷酶的粗酶液，并参照实施例2制备宝藿苷Ⅰ，检测每种粗酶液对底物的转化率如表1所示，表中，编号1-10的粗酶液的β-葡萄糖苷酶基因来源分别为Aspergillus oryzae RIB40、Aspergillus fumigatus A1163、Aspergillus niger、Talaromyces leycettanus JCM12802、Thermotoga maritima MSB8、Aspergillus terreus、Aspergillus ustus、Aspergillus oryzae、Dictyoglomus thermophilum DSM 3960、Caldanaerobius fijiensis。
表1
Figure PCTCN2018084474-appb-000001
Figure PCTCN2018084474-appb-000002

Claims (14)

  1. 一种制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ，所述底物为淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A和箭藿苷B中的任意一种或多种，所述β-葡萄糖苷酶由来源于极端栖热袍菌Thermotoga petrophila RKU-1的β-葡萄糖苷酶基因编码，且所述β-葡萄糖苷酶特异性地将所述淫羊藿提取物中的淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、箭藿苷A和箭藿苷B全部水解成宝藿苷Ⅰ，并将所述淫羊藿提取物中的朝藿定C水解成宝藿苷Ⅰ和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ。
  2. 根据权利要求1所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
  3. 根据权利要求1所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
  4. 根据权利要求1、2或3所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ的反应体系中还含有缓冲液和助溶剂，所述缓冲液的pH值为5.0-7.0，反应过程中控制反应体系的温度为45℃-80℃，pH值为4.5-6.5，反应时间为2-10h。
  5. 根据权利要求4所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述缓冲液的用量为占总反应液的60％-90％(v/v)，所述助溶剂的用量为占总反应液的5％-20％(v/v)。
  6. 根据权利要求4所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述助溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、NMP、吐温20和吐温80中的任意一种。
  7. 根据权利要求1、2或3所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶以粗酶液的形式投加，所述粗酶液是指由含有所述β-葡萄糖苷酶基因的微生物菌株诱导表达后经破胞、离心去除沉淀后获得的含有β-葡萄糖苷酶的溶液。
  8. 根据权利要求7所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于，所述粗酶液的制备过程包括：构建含有所述β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒，并将所述重组质粒转入微生物菌株体内，培养所述微生物菌株并进行诱导表 达所述β-葡萄糖苷酶，之后收集所述微生物菌株于缓冲液中，经破胞、离心去除沉淀后即得所述粗酶液。
  9. 根据权利要求7所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述粗酶液的用量为占总反应液的5％-20％(v/v)，所述底物浓度为占总反应液的5％-20％(w/v)。
  10. 根据权利要求4所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：待所述用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ的反应结束后，将获得的酶催化反应液进行结晶工艺处理，收集结晶体即得宝藿苷Ⅰ粗品，将所述宝藿苷Ⅰ粗品进行重结晶工艺处理，收集结晶体即得宝藿苷Ⅰ精制品。
  11. 根据权利要求10所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于，当所述助溶剂为丙酮时，所述结晶工艺处理过程包括：将所述酶催化反应液于45-55℃水浴环境中减压蒸馏出丙酮，再将剩余溶液降温至10-15℃，待结晶体全部析出后过滤，滤饼经水洗、干燥处理后即得宝藿苷Ⅰ粗品。
  12. 根据权利要求10所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于，所述重结晶工艺处理过程包括：将所述宝藿苷Ⅰ粗品溶解于无水乙醇中，并加入活性炭，搅拌并加热至55-65℃，趁热过滤，并用无水乙醇冲洗滤饼，滤液经减压蒸馏出乙醇后再加水，整个过程维持温度在55-65℃，之后降温至5-10℃，搅拌至结晶体全部析出后，过滤，滤饼经乙醇溶液冲洗、干燥处理后即得宝藿苷Ⅰ精制品。
  13. β-葡萄糖苷酶以及含有所述β-葡萄糖苷酶基因的微生物菌株在催化淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A和箭藿苷B中的任意一种或多种制备宝藿苷Ⅰ中的应用，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶由来源于极端栖热袍菌Thermotoga petrophila RKU-1的β-葡萄糖苷酶基因编码，且所述β-葡萄糖苷酶特异性地将所述淫羊藿提取物中的淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、箭藿苷A和箭藿苷B全部水解成宝藿苷Ⅰ，并将所述淫羊藿提取物中的朝藿定C水解成宝藿苷Ⅰ和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ。
  14. β-葡萄糖苷酶以及含有所述β-葡萄糖苷酶基因的微生物菌株用 于水解木糖苷键和鼠李糖苷键的用途，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶由来源于极端栖热袍菌Thermotoga petrophila RKU-1的β-葡萄糖苷酶基因编码。
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