CN104725443B - 一种通过反应分离提纯莱鲍迪苷a的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过反应分离提纯莱鲍迪苷A的方法，属于有机化学技术领域。甜菊糖粗品中主要含有斯替夫苷和优质甜味剂莱鲍迪苷A、C以及少量其它甜菊醇衍生物，结构相似的莱鲍迪苷A和斯替夫苷在极性溶液中共存时会增加彼此的溶解度，需要分级多步有机溶剂重结晶以获得高纯度莱鲍迪苷A。本发明利用同时具有脂肪酶酶活和半乳糖苷酶酶活的、来源于sulfolobus solfataricus的β‑半乳糖苷酶，高度专一性催化水解斯替夫苷，能够完全催化转化质劣的斯替夫苷为水不溶的甜菊醇，而莱鲍迪苷A等其它甜菊醇苷则不能被水解而留在溶液中，再通过简单的水相重结晶即可得到高纯度的莱鲍迪苷A，副产的甜菊醇是用途广泛且附加值比斯替夫苷高的有机合成中间体。

Description

一种通过反应分离提纯莱鲍迪苷A的方法
【技术领域】
本发明属于机化学技术技术领域，具体涉及一种通过反应分离提纯莱鲍迪苷A的方法。
【背景技术】
甜菊糖是从甜叶菊叶子中提取出的一类低热量高倍甜味剂，其甜度是蔗糖甜度的200-350倍，但热量却仅为蔗糖的1/300，因而是一种非常理想的替代蔗糖的甜味剂。斯替夫苷(stevioside)和莱鲍迪苷A(Rebaudioside A)是甜菊糖中含量最多的两种物质，莱鲍迪苷A是甜菊糖中甜味特性最好的化合物，是FDA唯一认定的“一般安全”(GRAS)物质；但斯替夫苷则有不良的后苦味而被低值使用。斯替夫苷和莱鲍迪苷A结构式如下：
斯替夫苷和莱鲍迪苷A分别水解掉其C19和C13的糖苷键和酯键后，均得到甜菊醇。由于斯替夫苷和莱鲍迪苷A具有类似的结构和溶解度，分离起来比较困难；特别是斯替夫苷和莱鲍迪苷A会互相增加对方在极性溶剂中的溶解度，非常不利于高纯产品的制备。目前工业上用来分离提纯莱鲍迪苷A的方法主要为树脂吸附和重结晶，但存在生产能耗大，成本高，树脂利用率低，重结晶需要大量的溶媒(甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇乙酸乙酯、丙酮)污染环境，产率不高等缺点。
反应分离可通过将目标化合物之外的物质通过反应转化成另外一种容易分离的物质，来达到分离相似物的目的。无机酸碱催化水解对斯替夫苷和莱鲍迪苷A具有很差的专一性。而不同糖苷酶可以将斯替夫苷和莱鲍迪苷A催化水解成各种产物(见说明书附图1)，但同时能够将苷元中C19和C13的两个不同性质的葡萄糖残基水解下来的很少，能够通过特有的亲和关系专一性催化水解斯替夫苷和莱鲍迪苷A其中的一种的糖苷酶更少。本发明使用的来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶具有很好的转苷作用[1]，但是我们发现它同时具有脂肪酶酶活和半乳糖苷酶酶活，更进一步地，我们发现它在同时水解甜菊苷元中C19和C13的糖苷键和酯键的同时，并不催化水解同样具有这两种基团的莱鲍迪苷A；因此，本发明将其引入粗甜菊糖的分离过程中，可以方便地获得高纯莱鲍迪苷A而又同时得到高附加值产品甜菊醇。
【发明内容】
本发明的目的在于针对以上现状的不足和缺点，提供一种通过反应分离提纯莱鲍迪苷A的方法，本发明所用的同时具有脂肪酶酶活和半乳糖苷酶酶活的、来源于Sulfolobussolfataricus的β-半乳糖苷酶专一性催化水解斯替夫苷，将斯替夫苷水解为水不溶的甜菊醇，而莱鲍迪苷A则不能被水解而留在溶液中，此工艺能耗小，分离简单，重结晶使用的溶剂是水，不污染环境，以此方法能够得到高纯度的莱鲍迪苷A，并且斯替夫苷水解生成的甜菊醇是用途广泛且高附加值的有机合成中间体。
本发明使用的同时具有脂肪酶酶活和半乳糖苷酶酶活的、来源于Sulfolobussolfataricus的β-半乳糖苷酶是按照文献1所表述的方法获得[1]，由文献1作者提供。
[技术方案]
本发明的目的可以通过如下技术方案达到：将甜菊糖和水按质量比1∶10-1∶50混合，搅拌下加热溶解，待甜菊糖全部溶解后，在75-85℃下预热30min，加入来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶(加酶量为600-1000U/g斯替夫苷，酶活测定的底物为邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷oNPG)；在75-85℃反应直至HPLC(测定方法参照国标GB8270-1999)检测不到斯替夫苷的存在，斯替夫苷的水解物甜菊醇从反应液中析出，将反应体系进行固液分离，浓缩上清液，得到的固体用水重结晶两次，莱鲍迪苷A从水中析出，干燥晶体即得到高纯度莱鲍迪苷A(见说明书附图2)。
[有益效果]
与传统的重结晶分离纯化莱鲍迪苷A相比，本发明方法工艺简单并副产更高附加值的有机合成中间体甜菊醇。利用酶催化水解斯替夫苷的专一特性，能够完全催化转化质劣的斯替夫苷为水不溶的甜菊醇，而莱鲍迪苷A则不能被水解留在溶液中，从而达到分离的目的；最后仅需用水重结晶两次反应后的浓缩液就能得到高纯度的莱鲍迪苷A，减少了传统重结晶分离莱鲍迪苷A使用的溶媒甲醇、乙醇、等的使用，降低了环境的污染。以此方法能够得到高纯度的莱鲍迪苷A，并且斯替夫苷水解生成的甜菊醇是用途广泛且高附加值的有机合成中间体。
【附图说明】
图1斯替夫苷的催化水解途径和产物
图2甜菊糖粗品HPLC图谱(a)、反应后HPLC图谱(b)、重结晶后HPLC图谱(c)
【具体实施方式】
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
实施例一：
将甜菊糖粗提物(斯替夫苷80％，莱鲍迪苷A 10％，其余5％为RC及其它杂质)和水按质量比1∶10混合，搅拌下加热溶解，等到甜菊糖全部溶解后，在75℃下预热30min加入来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶600U/g斯替夫苷反应16h，将反应析出物与反应液使用高速离心机进行固液分离，将得到的固体用水重结晶两次，莱鲍迪苷A从水中析出，干燥得到莱鲍迪苷A，纯度为95.1％，收率90.3％。。
实施例二
将甜菊糖粗提物(斯替夫苷50％，莱鲍迪苷A46％，其余4％为RC及其它杂质)和水按质量比1∶15混合，搅拌下加热溶解，等到甜菊糖全部溶解后，在75℃下预热30min加入来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶600U/g斯替夫苷反应16h，将反应析出物与反应液使用高速离心机进行固液分离，将得到的固体用水重结晶两次，莱鲍迪苷A从水中析出，干燥得到莱鲍迪苷A，纯度为95.6％，收率90.8％。
实施例三
将甜菊糖粗提物(斯替夫苷55％，莱鲍迪苷A 35％，其余5％为RC及其它水溶性杂质)和水按质量比1∶10混合，搅拌下加热溶解，等到甜菊糖全部溶解后，在75℃下预热30min加入来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶600U/g斯替夫苷反应16h，将反应析出物与反应液使用高速离心机进行固液分离，将得到的固体用水重结晶两次，莱鲍迪苷A从水中析出，干燥得到莱鲍迪苷A，纯度为95.5％，收率90.7％。
实施例四
将甜菊糖粗提物(斯替夫苷50％，莱鲍迪苷A 40％，其余5％为RC及其它水溶性杂质)和水按质量比1∶10混合，搅拌下加热溶解，等到甜菊糖全部溶解后，在75℃下预热30min加入来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶600U/g斯替夫苷反应16h，将反应析出物与反应液使用高速离心机进行固液分离，将得到的固体用水重结晶两次，莱鲍迪苷A从水中析出，干燥得到莱鲍迪苷A，纯度为97.1％，收率91.4％。
实施例五
将甜菊糖粗提物(斯替夫苷50％，莱鲍迪苷A 40％，其余5％为RC及其它水溶性杂质)和水按质量比1∶50混合，搅拌下加热溶解，等到甜菊糖全部溶解后，在80℃下预热30min加入来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶1000U/g斯替夫苷反应12h，将反应析出物与反应液使用高速离心机进行固液分离，将得到的固体用水重结晶两次，莱鲍迪苷A从水中析出，干燥得到莱鲍迪苷A，纯度为98.7％，收率92.5％。
实施例六
将甜菊糖粗提物(斯替夫苷50％，莱鲍迪苷A 40％，其余5％为RC及其它水溶性杂质)和水按质量比1∶30混合，搅拌下加热溶解，等到甜菊糖全部溶解后，在80℃下预热30min加入来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶1000U/g斯替夫苷反应16h，将反应析出物与反应液使用高速离心机进行固液分离，将得到的固体用水重结晶两次，莱鲍迪苷A从水中析出，干燥得到莱鲍迪苷A，纯度为98.6％，收率93.2％。
实施例七
将甜菊糖(斯替夫苷50％，莱鲍迪苷A 40％，其余5％为RC及其它水溶性杂质)和水按质量比1∶50混合，搅拌下加热溶解，等到甜菊糖全部溶解后，在80℃下预热30min加入来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶800U/g斯替夫苷反应12h，将反应析出物与反应液使用高速离心机进行固液分离，将得到的固体用水重结晶两次，莱鲍迪苷A从水中析出，干燥得到莱鲍迪苷A，纯度为96.8％，收率90.6％。
实施例八
将甜菊糖粗提物(斯替夫苷50％，莱鲍迪苷A 40％，其余5％为RC及其它水溶性杂质)和水按质量比1∶50混合，搅拌下加热溶解，等到甜菊糖全部溶解后，在85℃下预热30min加入来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶1000U/g斯替夫苷反应12h，将反应析出物与反应液使用高速离心机进行固液分离，将得到的固体用水重结晶两次，莱鲍迪苷A从水中析出，干燥得到莱鲍迪苷A，纯度为97.4％，收率91.6％。

Claims (5)

1.一种通过反应分离提纯莱鲍迪苷A的方法，其特征在于，利用同时具有脂肪酶酶活和半乳糖苷酶酶活的、来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶专一性催化水解斯替夫苷，将斯替夫苷水解为水不溶的甜菊醇，而莱鲍迪苷A则不能被水解而留在溶液中，从而可以通过后续简单的重结晶而得到莱鲍迪苷A。
2.根据权利要求1所述的一种通过反应分离提纯莱鲍迪苷A的方法，其特征在于，所述的反应分离通过以下方法达到：将甜菊糖原料溶于水中，在75-85℃下预热30min，加入来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶在75-85℃反应直至用HPLC检测不到反应液中斯替夫苷，将反应体系固液分离，浓缩上清液后，得到的固体用水重结晶两次，莱鲍迪苷A从水中析出，干燥晶体即得到莱鲍迪苷A。
3.根据权利要求1所述的一种通过反应分离提纯莱鲍迪苷A的方法，其特征在于所述的来源于Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶是一种具有脂肪酶酶活的β-半乳糖苷酶，加酶量为600-1000U/g斯替夫苷。
4.根据权利要求1或2所述的一种通过反应分离提纯莱鲍迪苷A的方法，其特征在于，固液分离所用的方法为离心或过滤，过滤的滤材孔径要小于50μm。
5.根据权利要求1所述的一种通过反应分离提纯莱鲍迪苷A的方法，其特征在于，所述的重结晶所用的溶剂是水。
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