CN101691389A

CN101691389A - 一种提高甜菊糖甜质的方法

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Publication number: CN101691389A
Application number: CN200910036066A
Authority: CN
Inventors: 陈育如; 刘虎; 姜中玉
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2009-10-16
Filing date: 2009-10-16
Publication date: 2010-04-07
Anticipated expiration: 2029-10-16
Also published as: CN101691389B

Abstract

甜菊糖苷是从甜菊叶中提取的新型甜味剂，甜菊叶中甜菊糖苷主要含甜菊苷和莱鲍迪甙A两种成分。莱鲍迪甙A的甜质与口感俱佳，而甜菊苷具有一定的后苦味。由于莱鲍迪甙A的结构和性质与甜菊苷非常接近，使莱鲍迪甙A与甜菊苷的分离成本高、技术难度大。本发明利用微生物在甜菊糖浓度0.01％～5％(W/W)、温度25～80℃、转化酶量或菌液量0.1％～10％(W/W)、pH2.0～7.0的条件下转化20h～150h，可将莱鲍迪甙A溶液中所含的甜菊苷选择性降解，从而得到不含甜菊苷的高纯度莱鲍迪甙A。本发明所用的生物转化法条件温和，不使用有毒的甲醇等化学品或成本高的大孔树脂，是一种安全、绿色、环境友好的新工艺。

Description

一种提高甜菊糖甜质的方法

技术领域

本发明涉及一种利用微生物及酶法分离纯化高品质甜味剂成分-莱鲍迪甙A或分离其他甜菊苷中其他成份的方法，属于食品添加剂和甜味剂应用领域。

背景技术

甜菊糖苷为白色、无嗅的粉末，熔点198-202℃，耐高温，在空气中会迅速吸湿，微溶于乙醇，对热、酸、碱稳定，在pH 4-10的范围的溶液内加热到120℃不发生变化，不发生褐变，在人体内大都不被代谢，为非发酵性糖，因此在体内产生的热量极低。甜菊糖苷(纯度90％以上)是白色粉末，次纯品(纯度50％)呈淡棕色。易溶于水，在空气中会迅速吸湿，室温下的溶解度超过40％(王一凡，任岱，周风贤等.甜菊糖食品中营养成分的研究.中国现代医学杂志，1997，7(3)：63-64.)。

甜菊苷在体内不蓄积，其安全性已得到国际粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)等的认可。日本食品添加剂联合会在很早已确定甜菊糖为不需特殊限量使用的甜味剂。我国卫生部自1985年和1990年分别批准了甜菊糖作为不限量使用的天然甜味剂和医药用甜味剂辅料。用甜菊糖替代15％-35％的蔗糖生产饮料，既符合国家标准GB10791-89的要求，又符合产品质量要求，具有改善口感，实现饮料低糖化的优点，符合饮料发展方向；用于食品中可替代10％-25％的蔗糖，具有增加甜味的效果；用甜菊糖替代20％-30％的蔗糖生产的水果罐头，除保持原有风味外，还有使糖水清晰、味道清凉纯正的优点。用于肉类、鱼类罐头，可明显延长保质期。还可用于腌制品、水产品、蜜饯、果脯、蛋糕、调味品、酒类制品、糕点、肉食品、口香糖、甜菊茶等。在医药工业上，由于甜菊糖无毒无副作用，安全可靠，用甜菊糖部分或全部代替蔗糖作药品的矫味剂，前途广阔(胡献丽，董文宾等.甜菊及甜菊糖研究进展.食品研究与开发，2005，1(26)：36-38.)。

甜菊糖苷是八种双萜糖甙的混合物结构通式见式1，R1和R2位可连接不同种类和数量的单糖构成不同成分，其八种成分分别为：甜菊甙(stevioside，SS)、甜菊醇双糖甙(steviolbioside)、莱包迪甙A(rebaudioside A，RA)、莱包迪甙B(rebaudioside B，RB)、莱包迪甙C(rebaudioside C，RC)、莱包迪甙D(rebaudioside D，RD)、莱包迪甙E(rebaudioside E，RE)、杜尔可甙A(dulcoside A，Dul-A)。其不同种类的糖甙在甜度和味质上存在较大的差异。其中以RA口感最好，其甜度超过蔗糖的300倍，且甜味纯正无后味，是非常理想的天然甜味剂。而SS的甜度为蔗糖的200倍并带有一定的后苦味道，且呈味比蔗糖慢，SS和RA是甜菊叶中主要甜菊糖苷成分，约占总甜菊糖含量的90％(曹强译，甜菊糖的特征与有效利用.杭州食品科技，1993，29(2)：8-11.)。

表1甜叶菊总糖甙中各组份结构及相对于叶含量

甜菊叶水浸提液HPLC图(见图1)，主要成分有3种。含量最高的为甜菊苷，其次是莱鲍迪甙A和莱鲍迪甙C。

现有技术一般利用重结晶法、树脂吸附分离法等纯化甜菊糖。重结晶法是通过研究甜菊苷与莱鲍迪苷A在甲醇与水的混合液中溶解度的差异，将甜叶菊提取液经提取、脱色、吸附等处理后，再在一定配比的甲醇-水体系中重结晶，得到了莱鲍迪苷A含量高于60％的甜味剂产品，可显著改进甜叶菊糖的味质，并推广到工业化生产(Morita T，Nishimura M，Ishikawa H，Manufacture of a sweetener difficult to dissolve inwater from Stevia extract.JP 07，177，802，1995.；Katantri T， Xitatsume M.Preperation ofStevia sweetener.JP 07，143，860，1995.)。

采用树脂吸附分离法提取、精制甜叶菊糖具有快速、经济、稳定等优点，是目前甜叶菊糖精制过程中不可缺少的工艺流程。大孔吸附树脂对甜叶菊提取成份的吸附作用具有一定的选择性。南开大学何炳林等利用树脂吸附的弱选择性特点，设计合成了系列具有高选择性的大孔吸附树脂，首次尝试了利用大孔吸附树脂选择性吸附的作用分离高苷RA含量的甜菊苷产品，再经重结晶可得到纯度大于90％RA的产品(何炳林，陈天红，张杨等.吸附树脂法从甜菊糖中富集、分离菜鲍迪苷A.中国专利CN98104776.9，1998.)。陈天红等设计合成了一系列极性含酮基大孔吸附树脂，研究了树脂极性与骨架结构的关系，讨论了树脂对甜菊苷中两种主要糖苷甜菊苷及莱鲍迪苷A的吸附能力和吸附选择性，并设计通过树脂柱的动态色层法从甜菊苷含量高的甜菊苷中分离出高RA产品(陈天红，张杨，史作清.含酮基吸附剂对莱鲍迪苷A的吸附选择性研究.高分子学报，1999，4：398-343.)。但是总有一定含量的甜菊苷的存在使得RA纯度不能继续增高。

高效液相色谱法(HPLC)，高效液相色谱法作为一种高效、高灵敏度的检测手段已被广泛用于甜叶菊糖各组份的分离、测定研究。它是利用物质在不同的两相中溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异，使混合物中各组分达到分离。它是目前最常用的分析方法，能对甜菊叶和食品中的甜菊糖苷进行分离测定，但代价高昂，不利于工业化。

除上述分离方法外，还有液滴逆流分配层析(DCCC)、超临界萃取法(Simone KYodaa，Marcia O M Marquesb，Ademir J.Petenatec，et al.Supercritical fluid extractionfrom Stevia rebaudiana Bertoni using CO₂and CO₂+water：extraction kinetics andidentification of extracted components.Journal of Food Engineering，2003，57(2)：125-134.)和毛细管电泳法(邵寒娟，胡涌刚，丁亮等.利用毛细管电泳法分析甜菊糖苷的含量.植物学通报，2001，18(1)：113-117.)等等。但是由于这些方法包括各种色谱方法可处理的样品量太少，难于实现工业化生产。

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)存在于许多植物、昆虫、酵母、霉菌及细菌体内，1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了该酶，该酶分布较为广泛，特别是植物的种子和微生物中尤为普遍，黑樱桃、水稻、大豆、木薯作物中纯化出β-葡萄糖苷酶。对微生物中的β-葡萄糖苷酶的研究主要在酵母、细菌、真菌、链霉等(李远华.β-葡萄糖苷酶的研究进展.安徽农业大学学报，2002，29(4)：421-425.)。

β-葡萄糖苷酶能参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用，能够水解结合于底物末端的非还原性β-D-葡糖苷键，释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶的生物学功能使它在生产中有着广泛的应用。首先是作为食品风味酶应用，目前，β-葡萄糖苷酶的主要应用是在食品工业中。随着食品工业的发展，风味化学的研究也引人关注。运用该酶可以提高果制品的天然风味。另外β-葡萄糖苷酶还在青梅脱苦、降解纤维素、水解大豆异黄酮方面有着广泛的应用(许晶，张永忠，孙艳梅.β-葡萄糖苷酶的研究进展.食品研究与开发，2005，26(6)：183-186.)。

本发明利用巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megateriumJ2)CCTCC NO：M209201所产β-葡萄糖苷酶对甜菊苷进行转化，从而达到与RA分离的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高甜菊糖甜质的方法。

本发明具体的技术方案是：

一种提高甜菊糖甜质的方法，包括：

将巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megateriumJ2)CCTCC NO：M209201菌种接种到含有甜菊糖的底物中，进行转化培养；转化后的液体经除菌、除杂处理后，经分离纯化得到莱鲍迪甙A；

或者是：

将巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megateriumJ2)CCTCC NO：M209201菌粉加入到含有甜菊糖的底物中，进行转化反应，转化后的液体经除菌、除杂处理后，经分离纯化得到莱鲍迪甙A；

或者是：将巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megateriumJ2)CCTCC NO：M209201酶液或酶粉加入到含有甜菊糖的底物中，进行转化反应，转化后的液体经除菌、除杂处理后，经分离纯化得到莱鲍迪甙A。

上述方法是所说的甜菊糖是包括甜菊苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F和甜菊双甙的混合糖。混合糖中甜菊苷在重量比例为0.01％～99％，优选2％～50％；或者是莱鲍迪甙A(RA)的重量比为0.01％～99％。

上述方法中，甜菊糖在转化底物中的重量比为0.01％～5％，优选0.1％～3％。

上述方法中，转化体系中的pH值为2.0-7.0。

转化体系的温度为25～80℃。

当为菌液转化时，转化体系中的菌液添加量为底物重量的0.1％～10％，优选2％～5％；当加入菌粉时，菌粉添加量为底物重量的0.01％～10％，优选0.1％～2％；当为酶转化时，转化体系中的酶粉或酶液添加量为底物重量的0.1％～2％。

附图说明

图1：甜菊浸提原液HPLC图

图2：微生物对SS和RA的降解时间曲线

具体实施方式

巨大芽孢杆菌的选育：

从江苏土壤中分离筛选出一批微生物。分别对甜菊糖进行转化，筛选出一株巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megaterium J2)对SS有良好的降解效果。该菌株于2009年9月13日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：武汉大学；保藏菌株分类命名为巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megaterium J2)，保藏编号：CCTCC NO：M209201。

巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megaterium J2)CCTCC NO：M209201菌体为杆状，G⁺，单个或成串排列，菌落圆形、扁平。在含2％氯化钠的牛肉膏培养基或PDA培养基上生长。经测定，其16S rDNA序列全长为1513bp。用Blast与GenBank中的核酸数据进行比对分析，结果发现与数据库中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的相似性达100％。所以J2菌被鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megaterium J2)CCTCC NO：M209201的β-葡萄糖苷酶酶液制备：

经发酵培养的巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megaterium J2)CCTCC NO：M209201菌液经除菌后，经常规的酶液制备方法浓缩或其他除杂处理，得到酶液，置低温保藏备用。β-葡萄糖苷酶的酶粉制备：

将巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megaterium J2)CCTCC NO：M209201产酶发酵的酶液经常规的硫酸铵盐析或其他酶纯化方法制备，即可得到酶粉。

菌液的制备：

巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megaterium J2)CCTCC NO：M209201经常规的肉汤液体培养基在37℃、220rpm培养48h即得菌液。

菌粉的制备：

包括菌的发酵培养、发酵液的分离、菌泥乳化和乳化液真空冷冻干燥。即巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megaterium J2)CCTCC NO：M209201经上述液体培养基于培养48h后得到的菌液经8000rpm、5min离心收集菌体得到菌泥，菌泥在真空度1～5pa条件下真空冷冻干燥30h，即得到菌粉。

降解菌对SS和RA的降解特性：

将巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megaterium J2)CCTCC NO：M209201按常规的液体或固体发酵培养培养12-98h，接入甜菊浸提液或含有一定甜菊糖浓度的降解液中，接入量为转化，图1为甜菊浸提原液的HPLC图，甜菊糖含量由多到少的顺序为SS、RA和RC。降解结果见图2所示，由图2可见，SS可以被迅速降解，而RA在SS快速降解时基本稳定，说明在特定的时间内用该微生物对SS和RA降解有着良好的选择性，这样甜菊糖溶液中SS被降解从而使得RA的纯度得到提高，甜菊糖的甜味品质同时也得到改善。

不同浓度的RA与浸提液等体积的混合液中SS降解情况：

由表1可知：高浓度RA添加到甜菊浸提液中对J2菌降解反而有利，RA＞90％时，SS降解了91％，B(70％＜RA＜80％)，C(80％＜RA＜90％)时分别达84％和76％，也较高。这有利于高纯度RA中少量SS的降解，以进一步提高RA的纯度。

表1添加等体积的不同浓度甜菊糖苷(RA＞50％)对降解影响

酶转化后的降解液经常规的分离纯化可得高纯度的RA产品。

实施例1：

0.5％(W/W)、pH 5.0甜菊糖溶液(RA纯度约为85％)，灭菌冷却后接5％(W/W)巨大芽孢杆菌J2CCTCC NO：M209201菌液，37℃培养72h，经转化后SS被大部分降解，RA含量不变。转化结束后，5000rpm离心去除菌体，上清液经絮凝沉淀除杂、大孔树脂吸附分离，纯化液结晶后获得RA，纯度约98％。

实施例2：

0.01％(W/W)、pH 4.5甜菊糖溶液(RA纯度约为75％)，加2％(W/W)巨大芽孢杆菌J2CCTCC NO：M209201的菌粉，37℃培养36h后，按常规的分离纯化获得纯度约为90％的RA。

实施例3：

3％(W/W)、pH 5.5甜菊糖溶液(RA纯度约为70％)，加10％(W/W)巨大芽孢杆菌J2CCTCC NO：M209201产的β-葡萄糖苷酶酶粉，80℃转化20h。结束后，分离纯化获得纯度约为75％的RA。

实施例4：

5％(W/W)、pH 5.0甜菊糖溶液(RA纯度约为80％)，加0.1％(W/W)巨大芽孢杆菌J2CCTCC NO：M209201产的β-葡萄糖苷酶粉，25℃转化100h。结束后，分离纯化获得纯度约为92％的RA。

实施例5：

3％(W/W)、pH 2.0甜菊糖溶液(RA纯度约为45％)，加10％(W/W)菌液，25℃培养120h。结束后，分离纯化获得纯度约为55％的RA。

实施例6：

4％(W/W)、pH 7.0甜菊糖溶液(RA纯度约为75％)，加0.1％(W/W)酶粉，45℃转化60h。结束后，分离纯化获得纯度约为80％的RA。

实施例7：

0.1％(W/W)、pH 5.0甜菊糖溶液(RA纯度约为70％)，加10％(W/W)菌粉，15℃培养150h。结束后，分离纯化获得纯度约为85％的RA。

实施例8：

2％(W/W)、pH 5.0甜菊糖溶液(RA纯度约为60％)，加2％(W/W)酶粉，50℃转化20h。结束后，分离纯化获得纯度约为82％的RA。

实施例9：

2％(W/W)、pH 5.0甜菊糖溶液(RA纯度约为78％)，加2％(W/W)菌液，20℃培养150h后，分离纯化获得纯度约为90％的RA。

实施例10：

1.5％(W/W)、pH 5.5甜菊糖溶液(RA纯度约为65％)，加0.01％(W/W)菌粉，15℃培养30h后，分离纯化获得纯度约为88％的RA。

实施例11：

2％(W/W)、pH 5.0甜菊糖溶液(RA纯度约为72％)，加0.1％(W/W)菌粉，40℃转化40h后，分离纯化获得纯度约为87％的RA。

实施例12：

3％(W/W)、pH 5.4甜菊糖溶液(RA纯度约为78％)，加2.5％(W/W)酶，35℃培养100h后，分离纯化获得纯度约为95％的RA。

实施例13：

2％(W/W)、pH 5.0甜菊糖溶液(RA纯度约为70％)，加0.1％(W/W)菌液，35℃培养120h后，分离纯化获得纯度约为92％的RA。

Claims

1.一种提高甜菊糖甜质的方法，包括：

或者是：

2.根据权利要求1所述的提高甜菊糖甜质的方法，其特征在于，所说的甜菊糖是包括甜菊苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F和甜菊双甙的混合糖。

3.根据权利要求2所述的提高甜菊糖甜质的方法，其特征在于，甜菊苷在混合糖中的重量比例为0.01％～99％；

4.根据权利要求2所述的提高甜菊糖甜质的方法，其特征在于，莱鲍迪甙A在混合糖中的重量比为0.01％～99％。

5.根据权利要求1所述的提高甜菊糖甜质的方法，其特征在于，甜菊糖苷在转化底物中的重量比为0.01％～5％。

6.根据权利要求1所述的提高甜菊糖甜质的方法，其特征在于，转化体系中的pH值为2.0-7.0。

7.根据权利要求1所述的提高甜菊糖甜质的方法，其特征在于，转化体系的温度为25～80℃。

8.根据权利要求1所述的提高甜菊糖甜质的方法，其特征在于，当为菌液转化时，转化体系中的菌液添加量为底物重量的0.1％～10％；当加入菌粉时，菌粉添加量为底物重量的0.01％～10％。

9.根据权利要求8所述的提高甜菊糖甜质的方法，其特征在于，菌液的添加量为2％～5％；菌粉的添加量为0.1％～2％。

10.根据权利要求1所述的提高甜菊糖甜质的方法，其特征在于，酶粉的添加量为底物重量的0.1％～2％。